בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

אנו מתמקדים בפיתוח שיטה לבידוד ואימוץ לימפוציטים חודרים לגידול, TILs, במודל סרטן הלבלב. אנו מנסים לענות על השאלה האם תת-הקבוצות של TIL יכולות למקד ולהרוג ביעילות גידולי לבלב in vivo וכיצד ניתן לבצע אופטימיזציה של תאי T לניסויים קליניים עתידיים. התפתחויות אחרונות בטיפול בתאים מאמצים, כולל שיפור טכניקות בידוד וביטוי TIL, שינוי עדין של TIL כדי לשפר את המיקוד שלהם ושילוב טיפול TIL עם אימונותרפיות אחרות כמו מעכבי מחסום או טיפולים ממוקדים ליעילות אנטי-גידולית מוגברת.

הקמנו שיטה חזקה לבידוד והרחבה של TIL תגובתי גידול ממודל עכברי סרטן הלבלב. הדגמנו יעילות אנטי-גידולית משופרת של תאי T מגיבים לגידול שהועברו באימוץ. הפרוטוקול שלנו מציע גישה ממוקדת יותר לטיפול בתאים מאמצים על ידי מתן אפשרות לבידוד ובחירה של TIL ספציפיים לגידול בהשוואה לשיטות אחרות פחות ספציפיות.

הוא משמש גם על ידי הדמיה ביולוגית לניטור גידול לא פולשני. הממצאים שלנו יקדמו את התחום על ידי מתן מודל פרה-קליני סטנדרטי להערכת יעילות הטיפול ב-TIL ואופטימיזציה של פרמטרי הטיפול של תת-קבוצות תאי T לסרטן הלבלב. כדי להכין תרחיף תאי KPC-Luciferase להשראת גידול לבלב אורתוטופי בעכברים, נסה את קו התאים KPC-Luciferase למשך דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הטריפסיניזציה, הוסף PBS, העביר את התאים ולאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התאים. ספרו את התאים והשעו אותם מחדש בריכוז של 1 כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר ב- PBS המכיל 30% מטריצת קרום מרתף. הנח את העכבר המורדם על פלטפורמת הפעלה.

לאחר ביצוע חתך בבטן שמאל של 0.5 עד 1 סנטימטר, החזיקו את הטחול בעזרת מלקחיים וחשפו את הלבלב. לאחר הכנת תאי KPC-Luciferase ותערובת מטריצת קרום המרתף, הזרקו 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים המכיל 50,000 תאים לתוך הלבלב באמצעות מחט בגודל 29. מחזירים את הלבלב לחלל הבטן.

תפר ברצף את הצפק והעור. אפשר לעכבר להתאושש על משטח חם עד שהוא ער לחלוטין. לאחר שבעה ימים, יש להזריק לעכבר 60 מיקרוליטר של תמיסת מלח אשלגן D-Luciferin להדמיה חיה.

לאחר ההרדמה, מקם את העכבר במערכת ההדמיה in vivo לזיהוי ביולומינסנציה. לאחר ההדמיה, הסר את העכבר מהמערכת ואפשר לו להתאושש באופן טבעי מההרדמה. כדי להתחיל, הנח את העכבר המתת החסד של התורם על פלטפורמת הפעלה.

עקר את כל הגוף עם 75% אתנול. במכסה מנוע סטרילי, השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לפתוח את חלל הבטן. הסר את הגידול והנח אותו ב-PBS על קרח.

מדוד את גודל הגידול בקליבר ורנייה. לאחר מכן, חשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה שעל המסך. לאחר הכנת תמיסת העיכול 1X באמצעות קולגנאז, Dispase II ו-DNAse I ב-RPMI 1640, הוסף מיליליטר אחד עד שניים מהתמיסה לכל באר בצלחת של 12 בארות.

טוחנים את הגידולים לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. העבירו את חלקי הגידול לכל באר בצלחת של 12 בארות ועכלו אותם ב-37 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-70 סל"ד למשך 30 דקות. כדי להפסיק את העיכול, הוסף מיליליטר אחד עד שניים של סרום בקר עוברי של 10% והעביר את תרחיף התאים לצינור איסוף.

שטפו את הבארות של צלחת 12 בארות פעמיים עם PBS כדי לאסוף את כל התאים שנותרו. מסננים את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, טוחנים ומועכים את שברי הרקמה כדי לשחרר את התאים הבודדים באמצעות הקצה השטוח של בוכנת מזרק. צנטריפוגה של המסנן ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשהה מחדש את הגלולה באלבומין סרום בקר של 5% לצביעה ציטומטרית זרימה.

כדי להתחיל, הנח את התאים שבודדו מהעכבר הנושא את הגידול יחד עם הטחול או התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי מהעכבר שאינו נושא גידול על משטח עבודה. תאי כתמים עם חוסמי FC ונוגדני זרימה בדילול של 1 עד 100. דגרו את הצינורות על קרח בחושך למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS על ידי צנטריפוגה לפני השעיית התאים באלבומין סרום בקר 1% ב-PBS. על ציטומטר זרימה, כדי למיין תאי CD45+CD3+, שער תאים חיים המבוססים על FSC-A ו-SSC-A ליצירת שער P1. לאחר מכן, שער תאים בודדים מ-P1 בהתבסס על FSC-A ו-FSC-H כדי ליצור שער P2. מיין תאי CD45+CD3+מ-P2 באמצעות שער CD45 ו-CD3. אוספים את התאים הממוינים לצינורות איסוף.

צנטריפוגה מיינה תאי CD45+CD3+ ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים בסרום העכבר בריכוז של 1 כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר, והניחו אותם על קרח. הנח את העכבר הנמען המושרה על ידי הגידול על פלטפורמת הפעלה.

בעזרת מזרק אינסולין בגודל 29 אינץ', הזרקו תוך צפקית את תאי החיסון הממוינים. לאחר מכן, יש לתת אינטרלוקין-2 תוך צפקי במשך שלושה ימים רצופים.