רספירומטריה ברזולוציה גבוהה בתא בנפח קטן

במחקר זה, אנו רוצים לחקור אם ניתן להשתמש בתא הנפח הקטן המכויל ל-0.5 מיליליטר במבחנים ספירומטריים מבלי לפגוע בדיוק המתקבל עבור הנפח הקלאסי של שני מיליליטר בפלטפורמת Oroboros.

הפיתוח שלנו של תא הנפח הקטן וההערכה על ידי רספירומטריה ברזולוציה גבוהה עם בקרת איכות קפדנית באמצעות ניתוח OXPHOS מדויק סלל את הדרך לפיתוחים, חידושים חדשים, כלומר, מספר אחד, מד נשימה O2k בעל 12 תאים, מספר שתיים, רובוט לטיטרציות אוטומטיות של חומרים בפרוטוקולים מורכבים המיושמים לניתוח OXPHOS. יישומים אלה יהיו חיוניים בהתרחבות נוספת לקראת ניתוח מיטוכונדריאלי, אבחון מחלות מיטוכונדריאליות, הערכת פיתוחים תרופתיים המתמקדים הן ביתרונות התרופות לתפקוד המיטוכונדריה והן בהשפעות מחוץ למטרה המשבשות את תפקוד המיטוכונדריה באופן לא רצוני. כשהצוות שלי פיתח רספירומטריה ברזולוציה גבוהה לפני יותר מ-30 שנה, הייתה פרדיגמה שלפיה מיטוכונדריה, מיטוכונדריה, מיטוכונדריה. אולי היה הבדל בין מיטוכונדריה של שריר לכבד, אבל זה הכל. אף אחד לא באמת התעניין במיטוכונדריה מחוץ לפרדיגמות האלה. עם הפרוטוקולים שלנו שפותחו עבור רספירומטריה ברזולוציה גבוהה, הראינו מגוון עצום של תפקוד המיטוכונדריה. זה מאפשר לנו להעריך את בקרת הנשימה המיטוכונדריאלית בסוגי תאים, רקמות ומינים מגוונים בעין חדשה. לפני 30 שנה, היו כ-10 פרסומים שהעריכו זאת. כעת, יש לנו עם המכשיר שלנו יותר מ-1,500 משתמשים בפרוטוקולים האלה.

נדרשת דגימה פי ארבעה פחות בתא הנפח הקטן בהשוואה לתא הקלאסי של שני מיליליטר. במקרה של דגימה עם קצב נשימה נמוך, ניתן להשתמש באותה כמות של דגימה כדי להגדיל את נפח שטפי החמצן הספציפיים כדי להפחית את אי הוודאות של המדידה.

מוקד העבודה שלנו במעבדת המו"פ של אורובורוס הוא שילוב של פיתוח אינסטרומנטלי ומחקר אקדמי. אנו מעריכים את תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי ואת הפרופילים הביוגנטיים באמצעות ניתוח מרובה חיישנים. כלומר מדידת נשימה, פוטנציאל חמצון, פוטנציאל ממברנה, ספיגת סידן, ייצור מי חמצן ופרמטרים שונים אחרים המאפשרים לנו לקבל תובנה עמוקה יותר לגבי הפרופיל הביוגנטי ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה.

[קריין] כדי להתחיל, התקן את הנפח הקטן, או תא ה-SV, על האורובורו. לאחר מכן הפעל את ה-Oroboros ולחץ על Connect כדי לחבר את ה-Oroboros לתוכנת DatLab. לאחר ייבוש התאים לחלוטין, השתמש בפיפטה כדי להוסיף 0.54 מיליליטר מים לתא ה- SV. ואז הפעל את הבוחשים. לפני סגירת החדר, יש להרטיב את טבעות ה- O של הפקקים, תוך שמירה על הנימים יבשים. שחרר את טבעת כיול הנפח, ולאחר מכן הכנס את הפקק כלפי מטה עד שנוזל ממלא את נימי הפקק ונוצר מניסקוס בכלי הקיבול בקצה הנימים העליון. הדק את טבעת כיול הנפח כדי לאבטח את מיקומה, והבטיח עקביות נפח מכוילת להחדרות רצופות. כדי להתחיל, מלאו את התאים באמצעי הנשימה MiR05 הפעל את תוכנת DatLab. בחר את הפרוטוקול המתאים לבדיקת הרקע האינסטרומנטלית. הגדר את מהירות סיבוב הערבוב ל-550 סל"ד, את נפח התא ל-0.5 מיליליטר, את מרווח הקלטת הנתונים בשתי שניות ואת טמפרטורת הניסוי ל-37 מעלות צלזיוס. הפעל את בדיקת המערבל ואת כיול האוויר. הגדר את סימן R1 בתרשים ריכוז החמצן על ידי הזזת הסמן תוך כדי לחיצה ממושכת על המקש Shift. מדי פעם, בצע אפס כיול חמצן. במהלך כיול האוויר, הכינו תמיסת מלאי נתרן דיתיוניט טרייה על ידי המסת אבקת O2-Zero במאגר פוספט של 50 מילי-מולרית לריכוז של 2.5 מילי-מולרית עבור ה-SV. לאחר השלמת כיול האוויר, סגור את החדר. עקוב אחר אות החמצן במשך כ-60 עד 120 דקות, מה שמאפשר לריכוז החמצן לרדת מריווי האוויר לכ-150 מיקרומולר. הגדר ארבעה סימנים המסומנים J01 עד J04 בתרשים השלילי של שיפוע החמצן. לחלופין, באמצעות מזרק המילטון, טיטר את תמיסת הנתרן דיתיוניט כדי להתאים את ריכוז החמצן ל-100 מיקרומולר ולהגדיר את הסימן J05. כדי לחשב את שיפוע הרקע של החמצן האינסטרומנטלי ב-DatLab, בחר שיפוע שטף. לאחר מכן, פתח את חלון תיקון רקע החמצן ובחר פעיל file כמקור לנתוני הרקע של החמצן. בדוק שכל סימני J0 משמשים לחישוב הרגרסיה הליניארית. לאחר מכן לחץ על החל לתיקון רקע החמצן. כדי להתחיל, שטפו את תאי אורובורוס במים נטולי יונים, והוסיפו מדיום MiR05 טרי לתא. לאחר בדיקת הרקע האינסטרומנטלית, פתח כרטיסייה חדשה של DatLab ובחר בפרוטוקול SUIT-003 לניסויי טסיות דם אנושיים. באמצעות סקירת פרוטוקול DatLab המופיעה בסרגל הצד של הפרוטוקול, בחר את פתרונות מלאי הכימיקלים. לאחר מכן בחר את מזרקי המילטון בהתאם לכימיקלים. הנח את המזרקים על מתלה המזרקים עם תוויות ברצף לפי פרוטוקול SUIT. להחלפת נפח חלקית, חשב את הנפח V שווה ערך לנפח V שהוסר מהנפח בפועל בתא הפתוח, תוך התחשבות בנפח המת הנימים. לאחר מכן הסר את הפקק שהוכנס במלואו והנח אותו על המתלה. הסר את הנפח המחושב V מתוך MiR05 מהתא בהתבסס על סוג התא וריכוז תרחיף תאי המלאי. כעת, פיפטה בנפח שווה ערך של תרחיף תא המלאי עם ריכוז תאים ידוע לתוך החדר. לעומת זאת, להחלפת נפח מלאה, שאב את כל המדיום מהחדר. הוסף 0.54 מיליליטר ממלאי המיטוכונדריה הלבבית המבודדת לתא ה-SV. סגור את החדר ושאב כל עודף תמיסת דגימה משקע הפקק. כדי להפעיל פרוטוקול טיטרציה של מעכב מצמד מצע מצע, או SUIT, פתח את חלון האירוע ב- DatLab כדי להמחיש את נפחי הטיטרציה. בעזרת המיקרו-מזרק של המילטון, הכניסו את תמיסות המלאי הכימי לתוך החדר. לאחר מכן הגדר את האירוע ב- DatLab. אפשר את ייצוב השטף לאחר הטיטרציה. לניתוח נתונים, סמן את החלק המייצג והיציב של העלילה. שטף החמצן ברקע בריווי האוויר היה גבוה פי 3.9 בתא של 0.5 מיליליטר בהשוואה לתא של 2.0 מיליליטר, בהתאם להבדל הצפוי תיאורטית פי ארבעה בשטף החמצן הרקע הספציפי לנפח. השונות של שטפי הרקע האינסטרומנטליים הייתה כמעט זהה בשני כרכי החדר. קצב הנשימה של טסיות דם חיות, פיברובלסטים חדירים ומיטוכונדריה מבודדת היו בקורלציה הדוקה בשני סוגי התאים כאשר הוחל תיקון הרקע המתאים. שטף החמצן התייצב מהר יותר בתא של שני מיליליטר מאשר בתא של 0.5 מיליליטר לאחר חמצון מחדש. צריכת החמצן השיורית לאחר עיכוב קומפלקס III הייתה עקבית בין שני החדרים, בהתאם לגבול הזיהוי האינסטרומנטלי.