מודל ביופילם מצטבר של סיסטיק פיברוזיס לחקר ביטוי גנים רלוונטי לזיהום

המחקר שלנו מפתח מודל ביופילם מצטבר בליחה מלאכותית כדי לשכפל זיהומי ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס. מודל זה מאפשר לנו לנתח שינויים בביטוי גנים ולהבין מדוע חיידקים נעשים עמידים יותר לטיפולים בתנאים אלה בהשוואה לסביבות בדיקות תרופות סטנדרטיות. פיתוח מודל ביופילם מורכב הדגיש את האתגרים של סיכום סביבת הריאות העוינת, מה שהופך את זה למאתגר לחזות אם השפעות אנטי-מיקרוביאליות במבחנה עולות בקנה אחד עם תוצאות in vivo.

האופי הספציפי של זיהומי ריאות CF מסבך עוד יותר את הפיתוח של מודלים מעבדתיים יעילים לבדיקת תרופות אנטי-מיקרוביאליות. לאורך מחקר זה, יצרנו בהצלחה מודל ביופילם מצטבר רב-מיקרוביאלי, המספק פלטפורמה לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסביבה מציאותית, מראה את רמת העמידות שניתן לראות בביופילמים אלה, ומדגיש את הפוטנציאל לטיפולים אנטי-וירולנטיים המכוונים לרכיבים כגון אלגינט. קיום מודל בדיקה אנטי-מיקרוביאלי שנועד לחקות את סביבת הריאות CF יגשר על הפער הקיים בין בדיקות in vivo לבדיקות in vitro.

יתר על כן, הערכת הווירום של חיידקים בסביבה המחקה יותר ריאה של CF תאפשר פיתוח ובדיקה של טיפולים אנטי-אליליים. כדי להתחיל, פס חרוז בודד של pseudomonas aeruginosa PAO1 מתרביות מלאי חרוזים קפואות על מקדחת מרק ליזוגני. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

להכנת ביופילם של מין יחיד, הכינו תרביות לילה של Pseudomonas aeruginosa PAO1 עם מושבה אחת מצלחת הפסים ודגרו למשך הלילה למשך 18 שעות. לאחר מכן, יש לדלל את התרבית לצפיפות אופטית של 0.05 ב-600 ננומטר, שווה ערך ל-1 כפול 10 בחזקת 8 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. יתר על כן, יש לדלל תרבית זו מ-1 עד 100 במדיום SCFM2.

לאחר מכן, הוסף 180 מיקרוליטר של החיסון לבארות של צלחת מיקרוטיטר עם תחתית עגולה של 96 בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במהירות של 75 סיבובים לדקה למשך 24 שעות. להחיות את Pseudomonas aeruginosa PAO1 ו-staphylococcus aureus SH1000 מתרביות מלאי חרוזים קפואים כפי שהודגם קודם לכן.

החיו את קנדידה אלביקן CAF 2.1 כפס חרוז בודד על אגר דקסטרוז סבורו, ודגרו על הצלחות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הכינו תרביות לילה של סטפילוקוקוס זהוב וקנדידה אלביקנס עם מושבות בודדות מצלחות הפסים שלהן ב -5 מיליליטר של מרק ליזוגני. לדלל את התרביות המתוקננות ליצירת חיסון יחיד המכיל את שני המינים בריכוזים הנדרשים ב-SCFM2.

לאחר מכן, הוסף 162 מיקרוליטר של החיסון המעורב לבארות של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול במהירות של 75 סיבובים לדקה למשך 24 שעות כדי לאפשר היווצרות של ביופילמים מרובי מינים. לאחר מכן, הוסף 14.2 מיקרוליטר של תרבית הלילה המוכנה של Pseudomonas aeruginosa לבארות של צלחת המיקרוטיטר של 96 בארות, ודגר את הצלחת שוב כדי לאפשר היווצרות ביופילם פולימיקרוביאלי.

כדי להתחיל, השג ביופילמים של מינים בודדים ורב-מינים בלוחות מיקרוטיטר של 96 בארות. לשיבוש הביופילם, הוסף 8.81 מיקרוליטר של מלאי DNase 1 ישירות לבארות המכילות את הביופילמים, והשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר. דגרו את הצלחת למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך ניעור במהירות של 75 סיבובים לדקה.

השג תמיסת מלאי אנטיביוטיקה של מרופנם ב -2.56 מיליגרם למיליליטר. בצע דילולים סדרתיים בפקטור של שניים כדי להשיג טווח ריכוזים של 0.01 מיליגרם למיליליטר עד 2.56 מיליגרם למיליליטר. כעת, הוסיפו 20 מיקרוליטר מכל דילול מירופנם לביופילמים, והשיגו טווח מינון של 1 מיקרוגרם למיליליטר עד 256 מיקרוגרם למיליליטר.

אטמו את לוחית המיקרוטיטר בת 96 הבארות בסרט שקוף, ודגרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות תוך ניעור 75 סיבובים לדקה. הביופילמים של פסאודומונס ממין יחיד לא הראו ירידה משמעותית בתאים ברי קיימא כאשר טופלו במרופנם במינון כלשהו של עד 256 מיקרוגרם למיליליטר. ההתאוששות של Pseudomonas aeruginosa הייתה גבוהה ב-0.74 log 10 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר בסביבות של מין יחיד מאשר בסביבות פולימיקרוביאליות ללא אנטיביוטיקה.

כדי להתחיל, הכינו את הביופילמים החד-מינים והרב-מינים למיצוי RNA. לאחר הדגירה, העבירו את הביופילמים מכל באר לצינור מיקרו צנטריפוגה של מיליליטר אחד המאגד את הביופילם משוכפל עבור כל דגימה. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 16, 000 גרם למשך חמש דקות.

אם מיצוי RNA מתבצע מאוחר יותר, הסר את ה-supernatant ואחסן את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של תמיסת ייצוב RNA ב-80 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, הפשירו את הצינור עם גלולה בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה בחום של 16, 000 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של מגיב TRIzol ושיבשו אותה ידנית באמצעות מחט של 0.2 מילימטר המחוברת למזרק של שני מיליליטר, שאיפה 5 עד 10 פעמים, או עד שהכדור מופרע לחלוטין.

עקוב אחר הנחיות היצרן כדי לטהר את ה-RNA מהביופילמים המופרעים. כדי לכמת את ה-RNA המטוהר, הכינו את תמיסת העבודה עם 199 מיקרוליטר חיץ ומיקרוליטר אחד של מגיב לכל דגימה. מערבבים 190 מיקרוליטר מתמיסת העבודה ו -10 מיקרוליטר של אחד סטנדרטי ושניים סטנדרטיים לצינורות נפרדים.

לאחר מכן, הוסף 199 מיקרוליטר מתמיסת העבודה ומיקרוליטר אחד של דגימת ה-RNA לצינורות בודדים. מערבולת למשך 30 שניות, ומאחסנים במקום חשוך למשך חמש דקות. לאחר מכן, בפלואוריומטר, בחר RNA, ולאחר מכן RNA רחב טווח ופעל לפי ההוראות שעל המסך.

לאחר ביצוע הקריאה הריקה, פיפטה מיקרוליטר אחד של RNA על מחזיק הדגימה של הספקטרופוטומטר, ומדוד את הספיגה ב-260 על 280 ננומטר. לסינתזת DNA משלימה, הכינו את תערובת התגובה בצינורות. הנח את הצינורות במחזור תרמי והפעל את התוכנית.

השתמש ב-CDNA מיד, או אחסן אותו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. ביטוי algD בביופילמים של Pseudomonas aeruginosa של מין יחיד לא השתנה באופן משמעותי בין ריכוזי המרופנם. בביופילמים פולימיקרוביאליים, ביטוי אלגינט היה גבוה משמעותית ב-256 מיקרוגרם למיליליטר, מה שמצביע על ייצור מוגבר של אלגינט בנוכחות אורגניזמים שמתיישבים במשותף.