שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי
25 בפברואר 2008
קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופיה 2-פוטון. סרט הווידאו הזה מראה כיצד דם תמונה הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.
היכולת לדמות את כלי הדם במוח ולתעד את דינמיקת זרימת הדם במוח השלם של מכרסמים חיים היא טכניקה רבת עוצמה שניתן ליישם לחקר איסכמיה מוחית או פיזיולוגיה מוחית תקינה. כאן נדגים כיצד להשתמש בשתי מיקרוסקופיות צילום כדי לדמות דינמיקת זרימת דם בניאו-קורטקס של עכברים חיים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים המוזרקים לווריד הזנב. טכניקה זו פותחה במקור על ידי דייוויד קליינפלד בווינפרד דאנק.
היי, אני ריקרדו מוטה מהמעבדה של קרלוס פורטר קאיו במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס. בסרטון קודם הראינו לכם את השיטה להשתלת חלון גולגולת לניסויי הדמיה כרוניים in vivo. היום אנו הולכים להראות לכם את ההליך להדמיית דינמיקת זרימת הדם בקליפת המוח דרך חלון גולגולת.
תכשיר זה שימושי מאוד מכיוון שהוא מאפשר לצלם עמוק בתוך המוח באמצעות מיקרוסקופ לייזר פוטון. אז בואו נתחיל. על מנת לדמות את כלי הדם במוח, יש להזריק לבעלי חיים תוך ורידי צבע פלואורסצנטי.
אנו משתמשים בצבעים מצומדים של דקסטר מכיוון שמוטיית הדקסטרון מונעת מהצבע לחצות את מחסום הדם-מוח ולדלוף החוצה מכלי הדם. עכברים מורדמים עם איזוף פלואור, 4% לאינדוקציה ו-1.5 עד 2% במהלך ההזרקה. לאחר מכן, הזנב מחוטא בשלוש ספוגיות של 70% אלכוהול עם מחט בגודל 26, 75 עד מאה מיקרוליטר של תמיסה של 5% של R דומין דקסטרן מומס במי מלח מוזרק דרך וריד הזנב.
באמצע הדרך לאורך ציר הזנב ניתן לצלם בעלי חיים מיד לאחר הזרקת וריד הזנב עד להפרשה של המות בשתן, שיהפוך לוורוד אם משתמשים בצבע דומין ERO כשעתיים לאחר הזרקת צבע דקסטר פלואורסצנטי, העכבר מורדם עם איזוף פלואור. שוב, 4% לאינדוקציה, 1% ל-1.5% להדמיה. העכבר מחובר היטב באמצעות מוט הטיטניום לשלב המיקרוסקופ, המכיל כרית חימום מווסתת תרמית כדי לשמור על חום החיה.
מורחים מעט משחת עיניים כדי לשמור על לחות העיניים. את הכיסוי של חלון הגולגולת מנקים ב-70% אלכוהול. החלון ממוקם במקביל למישור המוקד וממורכז בשדה הראייה.
תחת המטרה של ארבע פעמים, עדיף לצלם את כלי השטח של המוח עם מצלמה דיגיטלית. תמונה זו תשמש כתמונת התייחסות במפגשי הדמיה הבאים כדי למצוא את אזור התמונה שוב ושוב מיום ליום. המטרה של ארבע x מוחלפת לאחר מכן במטרה של טבילה במים פי 40.
מבלי להזיז את הבמה, התמונה הדיגיטלית של הנוף מצולמת. שוב, הקואורדינטות של מניפולטור הבמה מוגדרות לאפס. אנו משתמשים בסריקת תמונה כתוכנת רכישת תמונות.
זה נכתב ב-MATLAB על ידי טום פול רודו וברנרדו סבטיני במעבדה של קרלס ווטו. לאחר מכן אנו מפעילים את כל שאר הציוד, הלייזר, מד הכוח, צינורות מכפיל הצילום, המגברים וכו'. אזור החלון המתאים להדמיה נסרק לזמן קצר בהגדלה נמוכה כדי למצוא את האזורים הטובים ביותר.
לאחר זיהוי אלה, נלקחת ערימת ההגדלה הנמוכה של האזור הנבחר לתמונה וקואורדינטות ה-XY שלו מוסרות כדי לתעד את דינמיקת זרימת הדם בכלי דם קטנים או נימים. אנו משתמשים בסריקות קו לאורך לפחות 40 מיקרון של כלי השיט המבוקש. סריקות בודדות אלה הנמשכות שנייה אחת נעשות תוך שימוש בכמה שפחות כוח לייזר, והקואורדינטות וזווית הסריקה נרשמות.
לאחר סיום סשן ההדמיה, החיה מועברת לתא חם שבו היא יכולה להתאושש מההרדמה. כאן אנו מראים ערימה של מאה תמונות שצולמו כל חמישה מיקרון עם מיקרוסקופ שני הפוטונים שלנו דרך חלון גולגולת הממוקם מעל קליפת המוח הסומטוסנסורית של עכבר בן חמישה חודשים שהוזרק לו r Domine dextan דרך וריד הזנב. רצף התמונות הזה מראה את הרשת המורכבת של כלי דם גדולים וקטנים, כולל נימים.
זה עתה הראינו לכם שיטה להדמיה של דינמיקת זרימת הדם in vivo דרך חלון גולגולת. זוהי שיטה חזקה ביותר להדמיית דינמיקת זרימת דם מוחית בכלי הדם בקליפת המוח, למשל, כדי לחקור שינויים בזרימת הדם לאחר שבץ מוחי. ניתן לבצע דמיונות מרובים בזמנים שונים ב-BULs על ידי שימוש בהזרקות חוזרות ונשנות של וריד הזנב של הצבע הפלואורסצנטי.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בתנאים הנקיים והסטריליים ביותר האפשריים ולהיות בעל יד יציבה מאוד. אוקיי, וזהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
הסרטון הזה מדגים את הטכניקה של הדמיית דינמיקת זרימת הדם בניאוקורטקס של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. צבעי דקסטרן פלואורסצנטיים מוזרקים לוריד הזנב, ומאפשרים תצפית in vivo של כלי הדם המוחיים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- הדמיית כלי דם
- טכניקות in vivo
רקע
- הדמיית זרימת הדם המוחית היא חיונית להבנת הפיזיולוגיה של המוח.
- טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים של איסכמיה מוחית.
- מיקרוסקופיה של שני פוטונים מאפשרת הדמיה מפורטת של דינמיקת זרימת הדם.
- צבעים פלואורסצנטיים מספקים ניגודיות להדמיית כלי דם.
מטרת המחקר
- להדגים את הדמיית דינמיקת זרימת הדם בניאוקורטקס.
- להציג את השימוש בחלון גולגולתי להדמיה כרונית.
- לספק מדריך חזותי לחוקרים המתעניינים בטכניקה זו.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הזרקת צבעי דקסטרן פלואורסצנטיים לוריד הזנב של עכברים.
- שימוש במיקרוסקופיה של שני פוטונים להדמיה.
- הכנת חלון גולגולתי מכוסה זכוכית לגישה לניאוקורטקס.
- הדמיה in vivo של דינמיקת זרימת הדם בעכברושים חיים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של דינמיקת זרימת הדם בניאוקורטקס.
- הדגמה של יעילות הכנת החלון הגולגולתי.
- המחשה של יישום צבעים פלואורסצנטיים בהדמיה.
- תובנות לגבי כלי דם מוחיים וויסות זרימת הדם.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת תובנות חשובות לגבי פיזיולוגיה של המוח.
- ניתן ליישם אותה במחקרים שונים הכוללים זרימת דם מוחית.
- השיטה משפרת את הבנתנו של איסכמיה מוחית ומצבים קשורים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
In vivo 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window enables high-resolution, quantitative assessment of cerebral microvascular dynamics in living rodents. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurovascular and neurodegenerative disease research pipelines. The method supports predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points, informing portfolio decisions for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vascular responses to experimental perturbations in disease-relevant brain regions.
- Supports functional target validation by quantifying blood flow changes in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular targets to physiological vascular outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantitative measurement of blood flow dynamics.
- Enables reproducible imaging of the same cortical region across multiple sessions for longitudinal studies.
- Supports assay standardization through controlled dye administration and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of vascular function in models of stroke, neurodegeneration, and brain tumors.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing quantitative endpoints relevant to human disease.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling robust, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a bridge between molecular target identification and functional validation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neurovascular mechanisms and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible blood flow measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of blood flow parameters across experimental groups and timepoints.
- Translational Research: Provides endpoints aligned with clinical imaging biomarkers of cerebral perfusion.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS vascular studies across therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with quantitative, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, in vivo imaging, and quantitative analysis.
- Demands access to 2-photon microscopy, image acquisition software, and animal support infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dye preparation, injection, and imaging protocols.
- Adaptation to other rodent models or brain regions may require protocol optimization.
- Imaging depth and dye clearance kinetics may limit applicability for certain experimental designs.
