מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי
21 במרץ 2025
השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.
מטרת המחקר היא לקדם מודלים מיקרופיזיולוגיים של הלב במבחנה על ידי שילוב שיטות פוטוסטימולציה מבוססות חומרים. הוא מתמקד בהתגברות על מגבלות באריכות ימים ופולשניות לגירוי, מתן כלים אמינים לחקר פיזיולוגיה של הלב, שיפור תהליכי סינון תרופות וטיפוח יישומים במודלים של מחלות. ההתקדמות האחרונה בגירוי ביולוגי ממנפת, כמו בקרה תאית מדויקת ולא פולשנית.
אופטוגנטיקה מאפשרת שינוי גנטי כדי לווסת את הפעילות התאית, בעוד שמתמרים פוטו-מבוססי חומר מתפתחים מציעים חלופות לא גנטיות. חידוש זה מספק פריצת דרך משמעותית במחקר ומווסת נוירונים, קרדיומיוציטים ותאי שריר שלד ביישומים מגוונים. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים השגת אספקת אור עקבית לרקמות עמוקות, אופטימיזציה של התאימות הביולוגית והיציבות של מתמרים פוטו, ושיפור הדיוק של טכניקות גירוי מבוססות אור.
בנוסף, שילוב שיטות אלה עם מערכות ביולוגיות מורכבות תוך שמירה על כדאיות ופונקציונליות תאית נותר מכשול מרכזי. פרוטוקול זה נותן מענה לפער המחקרי של הצורך בטכניקות גירוי מדויקות לא פולשניות במודלים מיקרופיזיולוגיים של הלב. על ידי שימוש במתמרים פוטו-מבוססי חומרים, כמו Ziapin2, גישה זו מתגברת על המגבלות של גירוי חשמלי מסורתי ואופטוגנטיקה, ומציעה קווי מתאר זמניים ומרחביים משופרים תוך שמירה על כדאיות ותפקוד הרקמות.
הממצאים שלי יקדמו את המחקר על ידי הצגת טכניקת גירוי אור לא פולשנית מבוססת חומרים המציעה דיוק ושליטה גדולים יותר על הפעילות התאית ברקמות הלב. גישה זו מבטלת את הצורך בשינויים גנטיים, ומספקת כלי רב-תכליתי למידול תפקוד הלב, חקר מנגנוני מחלה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות יותר. כדי להתחיל, הדביקו שתי שכבות של סרט מעבדה, אחת לבנה ואחת כחולה, ליריעת אקריליק שקופה, עמידה בפני שריטות ואולטרה סגול בעובי מילימטר.
חותכים את תבנית השבב על הקלטת בהתאם לעיצוב המיועד, ואז, בעזרת חרט לייזר פחמן דו חמצני, חותכים את יריעת האקריליק לעיגולים. הסר את שתי שכבות הסרט בתוך הקו הפנימי ביותר בעזרת פינצטה. משרים את הצ'יפס באקונומיקה טהורה למשך 30 דקות עד שעה כדי להסיר קווים עבים וכתמים כהים מהחיתוך, משאירים קו חד, ושוטפים את הצ'יפס בכוס במים זורמים נטולי יונים למשך הלילה או למשך שלוש שעות לפחות.
סוניקציה של השבבים למשך 10 דקות בחותמות הפולידימתילסילוקסן, או PDMS, עם תכונות חריץ קו למשך 30 דקות באתנול נקי של 70%. העבירו את השבבים והחותמות לאזור נקי מתחת למכסה המנוע ותנו להם להתייבש תחת זרימת אוויר למשך כשעה עד שעתיים. לאחר מכן, סוניקציה של הג'לטין הטרי שהוכן למשך 15 דקות, ואז החזירו אותו לאמבט המים של 65 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
הנח את הטרנסגלוטמינאז המיקרוביאלי, או צינור MTG, בחומר ייבוש כשהמכסה משוחרר מעט והפעל לאט את הוואקום כדי להסיר את הבועות. לאחר הסרת הגז, החזר את צינור ה-MTG לאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, כסו יריעת רשת עם פרפילם נקי והניחו את הצ'יפס על הרשת.
שמור את חותמת ה-PDMS בקרבת מקום לשימוש. הוסף חמישה מיליליטר MTG לחמישה מיליליטר מתמיסת הג'לטין, פיפטינג בזהירות כדי למנוע בועות. כעת, יש להוציא במהירות כ-0.5 מיליליטר מתערובת הג'לטין על כל שבב, וודא שהתערובת מכסה את אזור השבב.
הנח את חותמת ה-PDMS בדוגמת קו למעלה והחל משקל של 200 גרם כדי להבטיח שהג'לטין מעוצב במקביל לציר האורך של הרקמה. לאחר שכל השבבים יצוקים, כסו אותם בצנצנת זכוכית כדי למנוע הפרעה סביבתית ואפשרו להם לקשר בן לילה. העבירו את השבב וחותמת ה-PDMS הדחוסים לצלחת P150 חדשה מלאה ב-PBS כדי להרטיב את הג'לטין למשך 30 דקות עד שעה כדי להקל על הפרדת חותמת ה-PDMS מהשבב.
לאחר הסרת כל עודפי הג'לטין סביב השבב, העבירו את הצ'יפס הנקי לכלי P150 חדש מלא ב-PBS. אחסן את חותמות ה-PDMS באתנול 70%. כדי לעקר את הצ'יפס, יש להשרות אותם באתנול למשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע.
מעבירים את הצ'יפס ל- PBS, משרים אותם למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה שלוש פעמים PBS. עבור תמיסות הציפוי, מערבבים 20 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין עם דילול של 1 עד 100 של ג'לטרקס במצעי גידול ללא תוסף. מצפים את השבבים בתמיסה זו למשך שעתיים בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
הפשרה וזריעה של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במדיום RPMI המכיל 10 מיקרו-מולרי Y-27632. החלף את המדיום ב-RPMI נטול Y-27632 לאחר 24 שעות. שלושה ימים לאחר זריעת התאים, השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את הסרט הלבן מהשבבים.
הכן את מכשיר המיפוי האופטי המורכב ממיקרוסקופ עדשות טנדם שונה המצויד במצלמה מהירה ומנורת כספית של 200 מיליוואט כמקור אור העירור. הנח מראה דיכרואית מול מצלמת הדמיית הסידן הייעודית. עבור קוצב אופטי, הפעל גירוי נקודתי אופטי בקצה אחד של הרקמה באמצעות מקור אור LED כדי לעורר את Ziapin2, מתמר הפוטו.
קצב את הרקמות בתדר של 0.5, או הרץ אחד, באמצעות סיב אופטי מווסת זמנית הממוקם במרחק של מילימטר אחד מהרקמה. דגרו את הדגימה עם שני מיקרו-מולר X-Rhod-1 שנוספו למדיום התרבות למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הצ'יפס במדיום תרבית טרי, העבירו אותם למדיום RPMI 1640 נטול פנול אדום, בתוספת B-27 מינוס אינסולין ו-HEPES.
הנח את שבבי הרקמה בצלחת מבוקרת טמפרטורה המוגדרת לטמפרטורה פיזיולוגית והתחל להקליט בקצב פריימים של 2.5 פריימים לשנייה. התפשטות גלי הסידן הודגמה בהצלחה, עם רזולוציה מרחבית וזמנית ברורה במהלך גירוי פוטו בתדרים של 0.5 או 1 הרץ, עם מהירויות הולכה המחושבות כ-4.5 סנטימטרים לשנייה, בהתאם לערכים הפיזיולוגיים. פרמטרים חולפים של סידן, כולל משרעת, זמן עלייה, דעיכה מקסימלית, שיפוע וזמן דעיכה, היו דומים כמותית בין גירוי אור לגירוי חשמלי, ואישרו תגובות תפקודיות דומות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מקדם מודלים מיקרו-פיזיולוגיים לבביים in vitro באמצעות שילוב של שיטות פוטו-סטימולציה מבוססות חומרים. מטרתו היא להתגבר על מגבלות באורך החיים וברמת הפולשניות של הגירוי, ובכך לספק כלים אמינים לחקר הפיזיולוגיה של הלב ולשיפור תהליכי סריקת תרופות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- פיזיולוגיה של הלב
- טכניקות של פוטוסטימולציה
- סריקת תרופות
רקע
- שיטות נוכחיות במחקר קרדיאלי מתמודדות לעיתים קרובות עם אתגרים הקשורים לפולשנות.
- אופטוגנטיקה מאפשרת שינוי גנטי לשליטה בפעילות תאית.
- פוטוטרנסדוסרים מבוססי חומרים מציעים חלופות לא-גנטיות עבור גרייה.
- קיים צורך בשיפור העקביות של הולכת האור לרקמות עמוקות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטות לא פולשניות לגירוי תאי לב.
- הארכת אורך החיים של מודלים מיקרו-פיזיולוגיים של הלב.
- אספקת כלים לסריקת תרופות ומידול מחלות בצורה משופרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של שיטות פוטו-סטימולציה מבוססות חומרים.
- שימוש באופטוגנטיקה לבקרה תאית.
- פיתוח של פוטוטרנסדוסרים לגירוי שאינו גנטי.
- אופטימיזציה ניסוית של הולכת האור ושל התאימות הביולוגית.
תוצאות עיקריות
- שילוב מוצלח של טכניקות פוטו-סטימולציה במודלים של לב.
- שיפור האמינות בחקר הפיזיולוגיה של הלב.
- שדרוג תהליכי סריקת תרופות באמצעות שיטות לא פולשניות.
- זיהוי אתגרים בהספקה של אור וביציבות של פוטוטרנסדוסרים.
מסקנות
- פוטו-סטימולציה מבוססת חומרים מהווה התקדמות משמעותית במחקר לבבי.
- שיטות לא פולשניות משמרות את המצב הטבעי של תאי הלב.
- נדרשת עבודה עתידית כדי להתגבר על אתגרים ניסיוניים בתחום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פוטוסטימולציה מבוססת-חומרים במערכות מיקרו-פיזיולוגיות של הלב נותנת מענה לצורך בגירוי לא פולשני ובדיוק גבוה בשלבי גילוי תרופות מוקדמים ובמידול מחלות. על ידי ביטול הצורך בשינוי גנטי והפחתת הפולשניות, גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בבדיקות בטיחות לבבית ובבדיקות תפקודיות. השיטה תומכת ביצירה של נתונים חסונים וניתנים לשחזור, החיוניים למיון תיקי פיתוח ולמחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני עירור-התכווצות בלב ללא שינוי גנטי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות התפשטות Ca2+ ברקמות מהונדסות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין השפעות ישירות של פוטו-סטימולציה לבין משתנים מתערבים.
- משפר את הביטחון החזוי להערכת סיכויים לפגיעה לבבית בתוכניות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמת גרייה סטנדרטית ולא פולשנית עבור בדיקות לבבות בעלות תוכן גבוה (high-content assays).
- מספקת מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של תנודות Ca2+ לצורך הערכת תרכובות.
- מאפשרת פורמטים של בדיקות ניתנים להרחבה, התואמים לזרימות עבודה של דימות וניתוח אוטומטיים.
- מפחיתה את השונות הקשורה לשיטות גרייה מבוססות אלקטרודות או גרייה גנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה תגובות לבביות in vitro למהירויות הולכה פיזיולוגיות ולנקודות קצה תפקודיות.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לפרימקלניקה של פרמקולוגיית בטיחות, על ידי שימור חיוניות ותפקוד הרקמה.
- מקלה על מידול מחלות ופיתוח ביומרקרים תרגומיים באמצעות קרדיומיוציטים המופקים מ-hiPSC.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי השפעות לבביות מושראות מתרופות במערכת רלוונטית לבני אדם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל לבבי זה, המאפשר פוטו-סטימולציה, מתאים לשלבי הגילוי המוקדמים, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד זרימות עבודה של בטיחות פרה-קלינית, והוא תומך בבדיקת היפותזות ובקבלת תוצאות כמותיות.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקה מדויקת של השערת האפס עבור התמריצות לבביות והפצה של Ca2+.
- סריקה: מספקת תוצרי הדמיית Ca2+ כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מיון תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת השוואה סטטיסטית של שיטות גירוי ונקודות קצה פונקציונליות.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית לצורך התאמה של סממנים ביולוגיים ומודלי מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמת גירוי לא-גנטית וניתנת לשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים של מו"פ לבבי.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבדיקות לבביות.
- ערך תפעולי: מייצב את הגירוי ואת קריאת התוצאות, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) ומפחית סיכוני בטיחות לבביים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של נכסים לבביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהנדסת רקמות לב ובדימוי אופטי.
- נדרש מי instrumentation ייעודי לדימוי Ca2+ במהירות גבוהה ולהולכת אור מדויקת.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת רקמות וגירוי.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור שורות hiPSC שונות או מודלים של מחלות.
- יש לתקף את יציבות הפוטוטרנסדוסר ואת חדירות האור עבור כל יישום.
