שינוי מבחן המספר הסביר ביותר לכימות סלמונלה במוצרי עוף גולמיים ומוכנים לבישול

המחקר שלנו מפתח טכנולוגיות איתור, כימות ואפיון מהירות של פתוגנים הנישאים במזון, תוך התמקדות בשיטות רגישות שיכולות לשפר את בטיחות המזון על ידי זיהוי זיהום בעולם האמיתי. האתגרים העיקריים כוללים השגת גילוי רגיש מהיר ומטריצות מורכבות עם פתרונות בעלות נמוכה אך ניתנים להרחבה. אנו מטפלים גם בקשיים בהפחתת תוצאות חיוביות שגויות ושיפור התאימות לסביבות בדיקה מגוונות.

למען בטיחות המזון, המשמעות היא זיהוי מדויק של פתוגנים בריכוזים נמוכים במגוון מטריצות מזון. הפרוטוקול שלנו מתייחס לפער בין זיהוי שכיחות לכימות סלמונלה כדי לספק ערכים דטרמיניסטיים לרמת הזיהום במוצרי מזון. התהליך משבש באופן מינימלי מכיוון שהוא משלב בדיקות מאומתות המשמשות בפרוטוקולי FSIS וגמיש מספיק כדי להכיל פתוגנים ומטריצות מזון נוספות.

כדי להתחיל, הנח את העוף הטחון שנרכש ממחלקת הבשר הטרי של קמעונאים מקומיים על פלטפורמת עבודה. מחלקים את הבשר באופן אספטי לדגימות של 25 גרם. רכשו מוצרי עוף מוכנים לבישול ממדור המזון הקפוא של הקמעונאים המקומיים וחלקו אותם באופן אספטי לדגימות של 25 גרם.

פס סלמונלה enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 על צלחת מקדחה לעירוי לב במוח. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, חסנו 25 מיליליטר של מרק עירוי לב מוח עם מושבה אחת של סלמונלה טרייה.

גידול אירובי של תרבית בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-100 סל"ד. כדי להכין סדרה של דילול פי עשרה, העבירו 0.5 מיליליטר תרבית ל -4.5 מיליליטר של מי פפטיד חוצצים או BPW וערבבו היטב. לאחר מכן העבירו 0.5 מיליליטר מהדילול המוכן ל -4.5 מיליליטר BPW לכל דילול שלאחר מכן.

לאחר מכן, העבירו באופן אספטי 25 גרם עוף טחון מוקרן לשקיות בטן סטריליות. חסנו את הדגימה במיליליטר אחד מהריכוז הרצוי של דילול התרבית. בעזרת מפזר תאים סטרילי מחלקים בעדינות את החיסון באופן שווה על פני העוף ומניחים להם לעמוד על ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר דגירה של דגימות עוף טחון מוקרן עם תרבית סלמונלה למשך שעה, הוסף 225 מיליליטר BPW לכל דגימה כדי להשיג את יחס הדגימה למדיה הרצוי. הומוגניזציה של דגימות העוף באמצעות הקיבה במהירות רגילה למשך 120 שניות. בעזרת פיפטה של 50 מיליליטר, הסר בזהירות את הנוזל מהצד המסונן של הקיבה ופצל אותו לשני בקבוקי צנטריפוגה סטריליים.

צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא בשלושה מיליליטר BPW באמצעות מרית סטרילית. מוסיפים 12 מיליליטר BPW לגלולה המושעה ומערבבים היטב על ידי ערבוב בעזרת מרית סטרילית.

ערבבו את תכולת שני בקבוקי הצנטריפוגות לבקבוק אחד. הוסף שלושה מיליליטר מהדגימה המושעה לכל באר בעמודה הראשונה של בלוק 48 הבארות כדי ליצור שמונה שכפולים. כדי להכין סדרה של דילול פי עשרה על פני עמודות 1 עד 6 באמצעות פיפטה של שמונה ערוצים, הוסף 0.3 מיליליטר מהדגימה מכל באר לתוך 2.7 מיליליטר BPW בעמודה הבאה תוך הבטחת ערבוב יסודי.

דגירה של בלוקים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-100 סל"ד. למחרת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, צלחו שבעה מיקרוליטרים של תרבית מכל דילול על צלחות מקדחה לעירוי לב המוח ברשת ארבע על שש. הניחו לצלחות להתייבש במשך 10 דקות לפני הדגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות.

לאחר הדגירה, בדוק את לוחות המקדחה, וסמן לפחות מושבה אחת כחיובית וללא צמיחה שלילית. הזן את מספר מקדמי הדילול והדילול בגליון עבודה. הזן את הנפח או המשקל המתאימים של הדגימה.

לאחר מכן ציין את מספר השכפולים והזן את מספר הדגימות שנמצאו חיוביות. לחץ על חישוב תוצאות כדי לנתח תוצאות חיוביות ושליליות מוערות בשיטת רזולוציית ההסתברות המקסימלית הפשוטה. כדי להתחיל, הקים את בלוק MPN 48 באר לתרבית סלמונלה מחוסנת בדגימות עוף.

ערבבו תרביות בבלוק של 48 בארות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. העבירו 200 מיקרוליטר מכל תרבית לצלחת PCR של 96 בארות. אוטמים את הצלחת והצנטריפוגה בחום של 6, 600 גרם למשך 10 דקות.

הסר את הסופרנטנט והוסף 20 מיקרוליטר של מגיב ערכת מיצוי ה-DNA לגלולה. מערבבים את הגלולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. שוב, אוטמים את הצלחת ומחממים אותה בחום של 99 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן מצננים ל -20 מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, השתמש בשני מיקרוליטרים של הסופרנטנט להכנת תערובת ה-QPCR על פי הפרוטוקול שנקבע. באמצעות התנאים הבאים, בצע את ה-PCR בזמן אמת. לאחר PCR, ייצא את התוצאות והתייחס לבארות עם ערכי סף מחזור קטנים או שווים ל-30 כחיוביים וגדולים מ-30 כשליליים.

ערבבו תרביות בבלוק של 48 בארות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. העבר 20 מיקרוליטר מכל דגימה לערכת הסלמונלה לזיהוי מולקולרי שסופקה צינור ליזה. מחממים את הדגימות בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו 20 מיקרוליטר ליזאט מכל צינור ליזה לתוך צינור ריאגנט וטענו את צינורות הריאגנט לתוך המחזיק. הוסף את המחזיק עם צינורות ריאגנט למכשיר מערכת הזיהוי המולקולרית.

הגדר את הגדרות התוכנה עבור בדיקת מערכת הזיהוי המולקולרית. הפעל את הבדיקה וייצא את הדוח לניתוח. דוח MDS Run מספק מידע פלט מפורט, חיובי או שלילי.