זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות

פיתחנו שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לאיתור פעילויות נוקלאז FEN1 וסינון מעכבי מולקולות קטנות, תוך קידום האבחון והמחקר הטיפולי הממוקד.

אתגרי הביטוי הנוכחיים כוללים את המורכבות והחששות הבטיחותיים של שיטות קונבנציונליות יחד עם העלות הגבוהה והציוד המיוחד הנדרש לטכניקות קיימות מבוססות פלואורסצנטיות.

פרוטוקול זה התייחס לחסרון של השיטה הרדיולוגית המסורתית וטכניקות פלואורסצנטיות בעלות גבוהה, ומספק פתרון זיהוי בטוח, יעיל וקל לשימוש.

המעבדה שלנו תתמקד באופטימיזציה של פלטפורמת סינון בעלת תפוקה גבוהה כדי לחקור יישומים ומנגנונים in vivo של מעכבי FEN1 בטיפול בסרטן.

[מדריך] כדי להתחיל, תכנן גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA על סמך פעילות המחשוף הספציפית של FEN1. מערבבים את האוליגונוקלאוטידים של ה-DNA החד-גדיליים במאגר חישול. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר חישול ומים נטולי יונים כדי ליצור נפח כולל של 50 מיקרוליטר. לאחר מכן, מחממים את תערובת התגובה בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת באמבט מתכת. מעבירים מיד את הצינור ל 72 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך 10 דקות. לאחר מכן, כבו את מקור החום ואפשרו לתמיסה להתקרר בהדרגה לטמפרטורת החדר כדי ליצור את מצע ה-DNA הדו-גדילי השלם. לבדיקת פעילות נוקלאז FEN1, שלב תחילה שני מיקרוליטרים של מצע ה-DNA עם נוקלאז FEN1 במאגר התגובה. דגרו את תערובת התגובה באמבט מתכת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר סיום פי 2 כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר מהדגימה הסופית על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% דנטור שהוכן מראש. אלקטרופורזה של הג'ל ב 100 וולט למשך 60 דקות. לאחר השלמתו, דמיין את תוצאות האלקטרופורזה תחת מערכת הדמיה פלואורסצנטית. בעזרת פיפטה, העבירו שני מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטר של נוקלאז FEN1 ו-10 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 2 לצינור ושישה מיקרוליטר של מים נטולי יונים. מערבבים היטב את התמיסה ואז מדגרים אותה על קרח למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, פיפטה שני מיקרוליטרים של מצע DNA כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן, הכינו דילול עבודה של מעכב הנוקלאז FEN1 FEN1-IN-4 על ידי ביצוע דילול סדרתי כפול מתמיסת מלאי מולרית אחת בדימתיל סולפוקסיד. הכניסו שני מיקרוליטר כל אחד של נוקלאז FEN1 ומעכב FEN1-IN-4 המדולל לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 2 וארבעה מיקרוליטרים של מים נטולי יונים. מערבבים בעדינות ומדגרים את התערובת על קרח למשך 10 דקות. כעת, הוסף שני מיקרוליטרים של מצע DNA לצינור כדי להפוך את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך 15 דקות. לאחר מכן, סיים את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מאגר סיום. רצועת חלבון שקופה בכ-45 קילודלטון אישרה טיהור מוצלח של נוקלאז FEN1 מביטוי מושרה. מצע ה-DNA הדו-גדילי המסומן בפלואורסצאין הופיע ב-80 קילודלטון, מה שאישר סינתזה מוצלחת בהשוואה למצע החד-גדילי ב-59 קילודלטון. נוקלאז FEN1 חתך את מצע ה-DNA הדו-גדילי בן 80 הנוקלאוטידים באופן תלוי מינון, עם מחשוף מלא שנצפה ב-0.5 מיקרוגרם למיקרוליטר. תרכובת FEN1-IN-4 עיכבה באופן משמעותי את הפיצול של מצע DNA דו-גדילי על ידי FEN1, כפי שמוצג על ידי שימור רצועת 80 הנוקליאוטידים. FEN1-IN-4 הפחית את פעילות נוקלאז FEN1 באופן תלוי ריכוז, עם ריכוז מעכב חצי מקסימלי של 14.03 מיקרומולר.