זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות
27 ביוני 2025
פרוטוקול זה מתאר בדיקה ביוכימית של שינוי ג'ל למדידת פעילות FEN1 (Flap Endonuclease 1) והתפתחות מעכבים.
פיתחנו שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לאיתור פעילויות נוקלאז FEN1 וסינון מעכבי מולקולות קטנות, תוך קידום האבחון והמחקר הטיפולי הממוקד.
אתגרי הביטוי הנוכחיים כוללים את המורכבות והחששות הבטיחותיים של שיטות קונבנציונליות יחד עם העלות הגבוהה והציוד המיוחד הנדרש לטכניקות קיימות מבוססות פלואורסצנטיות.
פרוטוקול זה התייחס לחסרון של השיטה הרדיולוגית המסורתית וטכניקות פלואורסצנטיות בעלות גבוהה, ומספק פתרון זיהוי בטוח, יעיל וקל לשימוש.
המעבדה שלנו תתמקד באופטימיזציה של פלטפורמת סינון בעלת תפוקה גבוהה כדי לחקור יישומים ומנגנונים in vivo של מעכבי FEN1 בטיפול בסרטן.
[מדריך] כדי להתחיל, תכנן גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA על סמך פעילות המחשוף הספציפית של FEN1. מערבבים את האוליגונוקלאוטידים של ה-DNA החד-גדיליים במאגר חישול. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר חישול ומים נטולי יונים כדי ליצור נפח כולל של 50 מיקרוליטר. לאחר מכן, מחממים את תערובת התגובה בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת באמבט מתכת. מעבירים מיד את הצינור ל 72 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך 10 דקות. לאחר מכן, כבו את מקור החום ואפשרו לתמיסה להתקרר בהדרגה לטמפרטורת החדר כדי ליצור את מצע ה-DNA הדו-גדילי השלם. לבדיקת פעילות נוקלאז FEN1, שלב תחילה שני מיקרוליטרים של מצע ה-DNA עם נוקלאז FEN1 במאגר התגובה. דגרו את תערובת התגובה באמבט מתכת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר סיום פי 2 כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר מהדגימה הסופית על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% דנטור שהוכן מראש. אלקטרופורזה של הג'ל ב 100 וולט למשך 60 דקות. לאחר השלמתו, דמיין את תוצאות האלקטרופורזה תחת מערכת הדמיה פלואורסצנטית. בעזרת פיפטה, העבירו שני מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף שני מיקרוליטר של נוקלאז FEN1 ו-10 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 2 לצינור ושישה מיקרוליטר של מים נטולי יונים. מערבבים היטב את התמיסה ואז מדגרים אותה על קרח למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, פיפטה שני מיקרוליטרים של מצע DNA כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן, הכינו דילול עבודה של מעכב הנוקלאז FEN1 FEN1-IN-4 על ידי ביצוע דילול סדרתי כפול מתמיסת מלאי מולרית אחת בדימתיל סולפוקסיד. הכניסו שני מיקרוליטר כל אחד של נוקלאז FEN1 ומעכב FEN1-IN-4 המדולל לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של מאגר תגובה פי 2 וארבעה מיקרוליטרים של מים נטולי יונים. מערבבים בעדינות ומדגרים את התערובת על קרח למשך 10 דקות. כעת, הוסף שני מיקרוליטרים של מצע DNA לצינור כדי להפוך את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר. דגרו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מתכת למשך 15 דקות. לאחר מכן, סיים את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מאגר סיום. רצועת חלבון שקופה בכ-45 קילודלטון אישרה טיהור מוצלח של נוקלאז FEN1 מביטוי מושרה. מצע ה-DNA הדו-גדילי המסומן בפלואורסצאין הופיע ב-80 קילודלטון, מה שאישר סינתזה מוצלחת בהשוואה למצע החד-גדילי ב-59 קילודלטון. נוקלאז FEN1 חתך את מצע ה-DNA הדו-גדילי בן 80 הנוקלאוטידים באופן תלוי מינון, עם מחשוף מלא שנצפה ב-0.5 מיקרוגרם למיקרוליטר. תרכובת FEN1-IN-4 עיכבה באופן משמעותי את הפיצול של מצע DNA דו-גדילי על ידי FEN1, כפי שמוצג על ידי שימור רצועת 80 הנוקליאוטידים. FEN1-IN-4 הפחית את פעילות נוקלאז FEN1 באופן תלוי ריכוז, עם ריכוז מעכב חצי מקסימלי של 14.03 מיקרומולר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מציג בדיקה ביוכימית מבוססת פלואורסצנציה כדי להעריך את הפעילות של FEN1 (Flap Endonuclease 1) ולהקל על פיתוח מעכבי מולקולות קטנות. העבודה שואפת להתגבר על המגבלות הקשורות בשיטות המסורתיות, ומספקת פתרון גילוי בטוח ויעיל יותר לפעילות FEN1 הרלוונטית לטיפול בסרטן.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המחקר
- בדיקות אנזימטיות
- סינון ביוכימי
- טיפולים נגד סרטן
רקע
- FEN1 ממלא תפקיד קריטי במטבוליזם של ה-DNA.
- שיטות הגילוי הנוכחיות הן מורכבות ויקרות.
- מחקר זה שואף להתמודד עם האתגרים הללו עם פרוטוקול ידידותי יותר למשתמש.
שיטות בשימוש
- גילוי מבוסס פלואורסצנציה של פעילות נקלז FEN1
- בדיקה ביוכימית עם מצעי DNA כפול-גדילי
- גישת סינון גבוהה-תפוקה למעכבי FEN1
תוצאות עיקריות
- הבדיקה זיהתה בהצלחה את פירוק ה-DNA הכפול-גדילי על ידי FEN1.
- התרכובת החדשה, FEN1-IN-4, עכבה את פעילות הנקלז באופן תלוי-ריכוז.
- פירוק משמעותי נצפה בריכוזים ספציפיים, מה שמאשר את יעילות הבדיקה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה מעשית להערכת פעילות FEN1 ולסינון מעכבים.
- התוצאות יש חשיבות לטיפולים נגד סרטן ממוקדים ולמחקר ביו-מולקולרי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Fluorescence-based detection of FEN1 nuclease activity addresses a critical need for safer, scalable, and quantitative assays in oncology drug discovery. This method enables rapid evaluation of FEN1 as a cancer-relevant target and supports high-throughput screening of small-molecule inhibitors, directly impacting early-stage portfolio triage and mechanistic de-risking. Its adoption streamlines the transition from target validation to lead identification in DNA repair-focused therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of FEN1 enzymatic function in disease-relevant pathways.
- Supports biological de-risking by quantifying nuclease activity and inhibitor effects.
- Facilitates predictive confidence in FEN1 as a therapeutic target for oncology portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, fluorescence-based assay for robust inhibitor screening.
- Delivers quantitative outputs suitable for dose-response and IC50 determination.
- Reduces operational hazards compared to radioisotope-based protocols.
- Supports assay standardization and scalability for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking FEN1 activity to cancer phenotypes.
- Enables continuity from biochemical validation to preclinical inhibitor evaluation.
- Supports risk-adjusted advancement of FEN1-targeted candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based assay positions FEN1 target validation and inhibitor screening at the interface of early discovery and lead identification, supporting seamless integration into oncology-focused R&D pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies FEN1 activity to clarify DNA repair mechanisms and validate target engagement.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for inhibitor potency and selectivity.
- Analytics: Enables statistical comparison of enzyme activity across conditions and compounds.
- Translational Research: Bridges biochemical findings to disease models by supporting biomarker-driven candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for ongoing FEN1-related discovery and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in FEN1 as a cancer target and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Improves assay safety, reproducibility, and throughput for inhibitor screening.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of DNA repair targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program standardization in oncology discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and fluorescence-based assay design.
- Needs access to fluorescence imaging systems and gel electrophoresis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for data comparability and reproducibility.
- Adaptable to various DNA substrates and inhibitor libraries for broader application.
- Dependent on careful optimization of reaction conditions for consistent outputs.
