Name: הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: חקור את הדינמיקה של DNA פולימראז דלתא בנוכחות מבני G-quadruplex באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה אחת. השיטה חושפת מסלול חילוף חדש של הפולימראז בעת מפגש עם מחסומי שכפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
<li>Burgers Garg, P., J, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+that+propagate+the+eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).</li>
<li>Burgers, P. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+replication+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair.</a> Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).</li>
<li>Tsai, M. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+polymerases+catalyze+DNA+replication%2C+repair%2C+and+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation.</a> Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).</li>
<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
<li>Sugino Kawasaki, Y., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+replicative+DNA+polymerases+and+their+role+at+the+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork.</a> Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Shivji Wood, R. D., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+DNA+polymerases+are+used+for+DNA+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).</li>
<li>Campbell Budd, M. E., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+the+eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+repair+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis.</a> Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).</li>
<li>Gao Yang, W., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translesion+and+repair+DNA+polymerases%3A+Diverse+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism.</a> Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).</li>
<li>Bridges, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair%3A+Polymerases+for+passing+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA repair: Polymerases for passing lesions.</a> Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).</li>
<li>Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+protein+dynamics+during+DNA-lesion+bypass+by+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci.+9%22%5BJournal%5D)">Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome.</a> Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).</li>
<li>Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+proteins+play+tag%3A+The+dynamic+nature+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome.</a> Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4-quadruplexes%2C+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">G4-quadruplexes, and genome instability.</a> Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).</li>
<li>Monnat Loeb, L. A., J, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases and human disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).</li>
<li>Bryan Oganesian, L., M, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+relevance+of+telomeric+G-quadruplex+formation%3A+A+potential+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target.</a> Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).</li>
<li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).</li>
<li>Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G-quadruplexes+folding%2Funfolding+dynamics+and+interactions+with+proteins+from+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol%22%5BJournal%5D)">Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy.</a> Biomol. 11 (11), (2021).</li>
<li>Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+conformation+and+dynamics+are+determined+by+loop+length+and+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).</li>
<li>Kusi-Appauh, N., Ralph, S. F., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+G-quadruplex+biology+and+stability+using+single-molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Understanding G-quadruplex biology and stability using single-molecule techniques.</a> J Phys Chem B. 127 (25), 5521-5540 (2023).</li>
<li>Obi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+G-quadruplex+DNA+structures+in+Schizosaccharomyces+pombe+causes+single-strand+DNA+lesions+and+impedes+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).</li>
<li>Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+Werner+syndrome+helicase+and+DNA+polymerase+delta+specifically+facilitate+copying+of+tetraplex+and+hairpin+structures+of+the+d%28CGG%29n+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence.</a> J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).</li>
<li>Clayton Kaguni, L. S., A, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+pausing+in+in+vitro+DNA+synthesis+by+DNA+polymerase+a+from+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).</li>
<li>Sato, K., Martin-Pintado, N., Post, H., Altelaar, M., Knipscheer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+mechanism+of+G-quadruplex+resolution+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multistep mechanism of G-quadruplex resolution during DNA replication.</a> Sci Adv. 7 (39), (2021).</li>
<li>Castillo Bosch,, P,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FANCJ+promotes+DNA+synthesis+through+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures.</a> EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).</li>
<li>Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+through+G-quadruplex+motifs+is+promoted+by+the+Saccharomyces+cerevisiae+Pif1+DNA+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase.</a> Cell. 145 (5), 678-691 (2011).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+efforts+of+replicative+helicase+and+SSB+ensure+inherent+replicative+tolerance+of+G-quadruplex%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci.+%28Weinh%22%5BJournal%5D)">Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex.</a> Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).</li>
<li>Pham, S. Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+quadruplex+DNA-binding+nickel+Schiff+base+complexes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes).</a> Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).</li>
<li>Georgescu, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+asymmetric+polymerase+assembly+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).</li>
<li>Hansen, J. B., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+protein+concentration+determination+using+the+NanoDrop+2000c+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer.</a> J Vis Exp. 33, (2009).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeertsema%2C+HJ+%22in+DNA+Replication%3A+Methods+and+Protocols.%2C+eds+Vengrova%2C+S.%2C+Dalgaard%2C+J%22">in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J</a>. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+fast+polymerase+turnover+in+the+bacterial+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome.</a> eLife. 6, 23932(2017).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).</li>
<li>Sommers, J. A., Estep, K. N., Maul, R. W., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+DNA+synthesis+blockage+by+G-quadruplex+structure+and+bypass+facilitated+by+a+G4-resolving+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of DNA synthesis blockage by G-quadruplex structure and bypass facilitated by a G4-resolving helicase.</a> Methods. , 207-214 (2022).</li>
<li>Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+telomeric+G-quadruplexes+dramatically+inhibit+DNA+synthesis+by+replicative+and+translesion+polymerases%2C+revealing+their+potential+to+lead+to+genetic+change%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change.</a> PLoS One. 9 (1), 80664(2014).</li>
<li>Mueller, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-molecule+characterization+of+enzymes+involved+in+nucleic-acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism.</a> Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).</li>
<li>Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>תבנית DNA בקרה של 100 nt</td><td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA <td>משולבות תבנית בקרה ראשונית במבחני הרחבת פריימר</td></tr><tr><td>100 nt תבנית DNA יוצרת G4</td><td>טכנולוגיות DNA</td><td></td> משולבות <td>תבנית ראשונית ליצירת G4 במבחני הרחבת פריימר</td></tr><tr><td>15% ג'ל Mini-PROTEAN TBE-Urea, 12 בארות, 20 ומיקרו; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>אלקטרופורזה ג'ל</td></tr><tr><td>20 nt פריימר מסומן/ביוטיניל אוליגונוקלאוטיד</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td></td><td>נדרשות להרחבת פריימר של תבניות 100 nt</td></tr><tr><td>תבנית DNA בקרה 22 nt טכנולוגיות</td><td></td><td>DNA משולבות</td><td>תבנית בקרה ראשונית בניסויי ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי</td></tr><tr><td>22 nt תבנית DNA יוצרת G4</td><td>DNA משולב טכנולוגיות</td><td></td><td>תבנית ראשונית ליצירת G4 בניסויי ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי</td></tr><tr><td>24 x 24 מ"מ</td><td>Marienfeld Superior</td><td>100062</td><td>נדרש למיקרוסקופיה TIRF</td></tr><tr><td>3-aminopropyltriethoxysilane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>פונקציונליזציה של Coverslip</td></tr><tr><td>647 ננומטר לייזר</td><td>קוהרנטי</td><td>1196627</td><td>בחר אורך גל שיתאים לכתם/צבע של בחירה</td></tr><tr><td>מסנן פליטה 670 ננומטר</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>מבטיח שרק אורכי הגל הרלוונטיים מועברים לגלאי</td></tr><tr><td>אמרשם טייפון 5 הדמיה ביו-מולקולרית</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>ניתוח ג'ל</td></tr><tr><td>ביוטין-PEG-SVA (MW 5000)</td> <td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>פונקציונאליזציה</td></tr><tr><td>של דאוקסינוקלאוטידים תערובת תמיסת</td> <td>טריפוספטJena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>אבני בניין לשכפול</td></tr><tr><td>אמבט יבש דיגיטלי (115V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>פתרונות חימום</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>646563</td><td>הפחתת קשרי דיסולפיד</td></tr><tr><td>מצלמת EM-CCD Andor</td><td></td><td>iXon 897</td><td>לכידת סרטים של מולקולה בודדת</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F9037</td><td>דנטורציה של DNA במהלך מבחני שכפול DNA אנסמבל</td></tr><tr><td>מזרק אטום לגז, 1 מ"ל</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>קובטה מילוי לספקטרוסקופיה דיכרואיזם מעגלי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך עם CFI Apo TIRF 100x מטרת טבילת שמן</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>מקל על מיקרוסקופיה TIRF חד-מולקולה</td></tr><tr><td>J-810 ספקטרופוטומטר</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>מדידת ספקטרוסקופיה דיכרואיזם מעגלי</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>פונקציית Coverslip</td></tr><tr><td>NanoDrop One ספקטרופוטומטר</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>מדידת ריכוזי</td></tr> <tr><td>חלבון ותוויתNeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>קשירת תבניות DNA לכיסויים הפונקציונליים במהלך ניסויים של מולקולה אחת</td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>דרושים לבניית תאי זרימה</td></tr><tr><td>קוביית קוורץ, 10 מ"מ</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>מחזיק דגימה לספקטרוסקופיה דיכרואיזם מעגלי</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>משמש להזרמת מאגרים ומצעים דרך תא זרימה מיקרופלואידי,</td></tr><tr><td>מאגר Tris-EDTA</td>, <td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td>, <td>מאגר תמיסת DNA</td></tr>, <tr><td>שמרים פולימראז ודלתא;</td><td>מעבדת</td><td></td> מייקל <td>אודונל שכפול עמודת התפלת תבניות ה-DNA</td></tr><tr><td>Zeba spin, 7 K MWCO, 0.5 מ"ל</td><td>טיהור פולימראז</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td></tr></tbody></table>

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת dna פולימראז ב-g-quadruplexes

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

עבור בדיקה זו, תוכננו שני מצעי דנ"א עם פריימר 20-nt עם תווית פלואורסצנטית: אחד המכיל רצף יוצר G4 (איור 1A, משמאל) ואחד חסר רצף זה (איור 1A, מימין). כדי לאשר שה-G-quadruplex הוא מחסום יעיל לפעילות פולימראז, סינתזת ה-DNA על ידי Pol δ נוטרה על ג'ל PAGE לדנטורציה. הפעילות של δ ה-Pol המסומן המטוהר על מצעי ה-DNA נבדקה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. איור 1B (משמאל) מראה כי ה-Pol המסומן פלואורסצנטי δ אינו מסוגל לסנתז מעבר ל-G-quadruplex. לפני תחילת הסינתזה (t = 0 דקות), קיימת פס המתאים ל-20 nt, המייצג את הפריימר המסומן שעבר דנטורציה מגדיל התבנית. לאחר 3 דקות, פס 20 nt זה הוסב לפס 60-nt, מה שמצביע על סינתזה שהתרחשה על כל ה-DNA ומאשר שהפולימראז נחסם לחלוטין על ידי מבנה ה-G-quadruplex. חסימה זו מרמזת על כך שהפולימראז לא יכול היה להתפתח או לעקוף את המבנה. לעומת זאת, הסינתזה של תבנית בקרה שאינה מכילה את הרצף היוצר G-quadruplex (איור 1A, מימין) ייצרה פס של 100-nt לאחר 3 דקות (איור 1B, מימין).
לאחר אישור הסינתזה על התבניות וחסימה יעילה על ידי ה-G-quadruplex, מדידות אלו חזרו על עצמן במיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה אחת כדי לנטר את התנהגות הפולימראז. תבניות ה-DNA נקשרו לכיסויים פונקציונליים (איור 2A) בתא זרימה מיקרופלואידי, והמיקום של כל מצע נקבע על ידי הדמיית הפריימר המסומן פלואורסצנטי. לאחר מכן, δ שכותרתו Pol נטען בנוכחות dNTPs כדי להתחיל סינתזה. בתוך FOV טיפוסי, נקודות בודדות עוקבות כדי לכמת באיזו תדירות Pol δ נקשר לדנ"א ומתנתק ממנו (איור 2B,C). על ידי מדידת העוצמה כפונקציה של זמן בכל מצע דנ"א, ניתן ליצור מסלולים של מולקולה בודדת (איור 2C, איור משלים 3). ניתן למדוד את "זמן השהייה" האופייני, או משך הזמן הממוצע שבו Pol δ נשאר קשור לתבנית. עבור מצע G4, זמן השהות נקבע כ-6 שניות ±-2 שניות, בעוד שעבור מצע הביקורת, הוא היה 10 שניות ±-3 שניות (איור 2D, איור משלים 4). בנוסף, עבור כל מסלול, ניתן לכמת את מספר הפעמים ש-Pol δ נקשר לתבנית. מספר אירועי הקישור למצע G4 גבוה בהרבה בהשוואה לתבנית הבקרה (איור 2E). בעוד שישנם מקרים של יותר מאירוע כריכה אחד בתבנית הבקרה עקב קשירה וביטול כריכה לימודית, יש עלייה ברורה במספר אירועי הקישור בממוצע עבור התבנית היוצרת G4. זה מצביע על כך שלאחר שהסינתזה נעצרת על ידי ה-G-quadruplex, הפולימראז הקשור מתנתק מה-DNA לפני שפולימראזים חדשים מהתמיסה עוסקים במחזור רציף של קשירה וניתוק. לפיכך, מבחן מולקולה בודדת זה מספק תובנה שאין שני לה לגבי האופן שבו פולימראזות DNA מגיבות למחסומי DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
איור 1: בדיקת הארכת פריימר אנסמבל. (A) ייצוג סכמטי של מצעי הדנ"א. מצע G4 (משמאל) מכיל רצף יוצר G-quadruplex, בעוד שמצע הבקרה (מימין) לא. (B) בדיקת הרחבת DNA ראשונית של ה-G4 הדרוך ומצעי ה-DNA הבקרה המראים כי שמרים בעלי תווית פלואורסצנטית Pol δ חסומים לחלוטין על ידי ה-G-quadruplex. ג'ל ה-PAGE מראה את השכפול של תבניות ה-DNA לאורך זמן, וכתוצאה מכך הסטה של הפריימר המסומן 20 nt למוצר 60-nt עבור המצע G4 (משמאל), והמוצר 100-nt עבור תבנית הבקרה (מימין). M מייצג סולם המכיל 20 nt, 60 nt ו-100 nt אוליגוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
איור 2: מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת. (A) ייצוג סכמטי של בדיקת הרחבת פריימר של מולקולה אחת באמצעות שמרים מסומנים AF647 Pol δ. (B) FOV טיפוסי המתקבל מבדיקת מולקולה בודדת. כל נקודה מייצגת פול עם תווית פלואורסצנטית δ הנקשרת לתבנית DNA. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (C) (למעלה) מולקולה לדוגמה מבדיקת המולקולה הבודדת המציגה קשירת הפעלה/כיבוי כאשר δ Pol מחליף. (למטה) מסלול מולקולה בודדת של אותה מולקולה המראה את העוצמה לאורך זמן הניסוי. הקו השחור מייצג את התאמת מודל מרקוב הנסתר (HMM) לנתונים. (D) זמן השהייה של Pol δ על מצע G4 (סגול) ועל מצע הבקרה (אפור). הקווים מייצגים התאמות אקספוננציאליות, ומעניקים אורך חיים של 6 שניות ±-2 שניות על מצע G4 ו-10 שניות ±-3 שניות על מצע הבקרה. (E) מספר אירועי הקישור של Pol δ למצעי DNA בודדים. המספר החציוני של אירועי הקישור על מצע G4 (סגול) הוא 3.5, בהשוואה למצע הבקרה 1 (אפור). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: ספקטרוסקופיה CD. ספקטרום CD של רצף יוצר G4 (סגול) ובקרה (אפור) במאגר TE המכיל 200 מ"מ של KCl ב-25 מעלות צלזיוס. השיא האופייני ב-260 ננומטר, ואחריו השיא השלילי ב-240 ננומטר, אופייני ל-GQ תוך-מולקולרי מקביל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 2: בניית תאי זרימה. (A) סכמטי של החלקים הבודדים של תא הזרימה. בלוק ה-PDMS המרובע יושב על גבי כיסוי המיקרוסקופ. לאחר מכן, חלקים אלה מותאמים יחד בתוך המכסה והתחתון של מחזיק תא הזרימה. (ב) תא הזרימה השלם. ניתן להכניס צינורות לכל צד של בלוק ה-PDMS כדי ליצור את התעלות שדרכן ניתן להזרים חוצצים דרך ההתקן באמצעות מיקרופלואידיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 3: מסלולים של מולקולה בודדת. (A) מסלול לדוגמה של מולקולה שעוברת אירוע קישור יחיד במהלך מסגרת הזמן של 10 הדקות של הניסוי. (B) מסלול לדוגמה של מולקולה שעוברת אפס אירועי קשירה במהלך מסגרת הזמן של 10 הדקות של הניסוי. הקו השחור ב-(A) ו-(B) מייצג את התאמת מודל מרקוב הנסתר (HMM) לנתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 4: זמני שהייה. (A) זמן השהייה של Pol δ על מצע G4. הקו מייצג את ההתאמה האקספוננציאלית, ומעניק אורך חיים של 6 שניות ± 2 שניות. (B) זמן השהייה של Pol δ על מצע הבקרה. ההתאמה האקספוננציאלית מעניקה אורך חיים של 10 שניות ± 3 שניות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 5: בקרת פוטו-הלבנה. התרשים מציג את הזמן הממוצע עבור אנזים שמרים בודד המסומן ב-AF647 Pol δ לעבור פוטו-הלבנה על ידי לייזר 647 ננומטר. הקו מייצג את ההתאמה האקספוננציאלית, ומעניק אורך חיים של 39 ± 6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">שניות.</a>

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

single-molecule-fluorescence-visualization-dna-polymerase-dynamics-at

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שילוב רומן רב עוצמה של nanophotonics (QD-סריג) ו מיקרופלואידיקה לחקור את היווצרות polyplexes polyelectrolyte, אשר צפוי לספק שליטה טובה יותר וסינתזה של polyplexes אחיד להתאמה אישית עבור חומצה מבוססי גרעין עתיד הרפוי.

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

מחקר זה מציג הליך ניסיון מפורט כדי למדוד דינמיקת לולאות של גדילי הדנ"א כפול באמצעות פלואורסצנטי התהודה העברת אנרגיה מולקולה בודדת (סריג). הפרוטוקול מתאר גם כיצד לחלץ את צפיפות הסתברות הלולאה נקראת גורם J.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) הן בדיקות כימיות שימושיות לזיהוי ואפיון מבני G-quadruplex בתבניות DNA במבחנה. פרוטוקול זה מפרט את ההליך לביצוע תגובות חיטוט עם B-CePs ולפתרון תוצרי תגובה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה.

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ"א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

חקור את הדינמיקה של DNA פולימראז דלתא בנוכחות מבני G-quadruplex באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה אחת. השיטה חושפת מסלול חילוף חדש של הפולימראז בעת מפגש עם מחסומי שכפול.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

גלה סרטונים נוספים