הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes
4 באפריל 2025
פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.
עבודתנו מתמקדת בפיתוח ושימוש במתודולוגיה של מולקולה בודדת לחקר דינמיקה במערכות ביולוגיות מורכבות. בפרט, אנו מעוניינים ללמוד כיצד מתנהגים פולימראזות DNA כאשר נתקלים במחסומים, במקרה זה, G-quadruplexes. פיתחנו שיטת מולקולה בודדת המבוססת על הדמיה פלואורסצנטית המאפשרת לנו לראות את ההתנהגות של פולימראזות DNA בודדות כאשר אנו נתקלים ב-G-quadruplex.
בבדיקה שלנו, זיהינו מסלול חילופין שלא אופיין בעבר לדלתא של DNA פולימראז עם פגיעה ב-G-quadruplexes, שבו הפולימראז ייפול ואחד חדש ייקשר מחדש. עם פיתוח הפרוטוקול שלנו, סוף סוף ענינו על השאלה: כיצד מתנהגים פולימראזות DNA שונות כאשר הן נתקלות ב-G-quadruplex, כפי שאנו יכולים לראות בזמן אמת כיצד הקינטיקה והמכניקה משתנות עם הזמן? כדי להתחיל, הסר החלקת כיסוי פונקציונלית מוואקום והנח אותה על מתלה מיקרו צינור מלא חלקית במים כדי ליצור סביבה לחה.
פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם לתוך צינור, ואז הוסף תמיסת NeutrAvidin של 25 מיקרוליטר וערבב היטב. מורחים את התמיסה על פני החלקת הכיסוי ומניחים לה לדגור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בקופסה הלחה. לאחר מכן, שטפו את החלקת הכיסוי במים, ואז יבשו אותה באמצעות גז חנקן.
הנח בלוק פולידימתילסילוקסן בהתאמה אישית על החלקת הכיסוי בתוך מחזיק תא זרימה. הכנס צינורות פוליאתילן לחורים בתא הזרימה. כעת, מחממים מינון של מיליליטר אחד של מאגר חסימת טווין, 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה ומאגר שכפול ל-40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לשחרר גזים מהתמיסות.
יש לפרק את התמיסות בתא ואקום למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 800 מיליבר מתחת ללחץ האטמוספרי. מרחו טיפת שמן על המטרה. קח תא זרימה בנוי והנח אותו על במת המיקרוסקופ.
לאחר מכן, הרם את המטרה כדי לעמוד בתלוש הכיסוי. הכנס את צינור הכניסה למאגר חסימת Tween נטול הגז וחבר את השקע למשאבת המזרק. לאחר מכן, משוך לאחור את המזרק כדי למשוך את מאגר חסימת הטווין דרך הצינור לתוך התעלה.
הזרם 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפה נטול גז לתוך התעלה בקצב של 100 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף את מאגר החסימה של טווין. כעת, יש לדלל את תמיסות תבנית ה-DNA ל-0.5 פיקומולר ב-500 מיקרוליטר של מאגר שכפול. תן ל -150 מיקרוליטר מהתמיסה לזרום לתעלה בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה.
האירו את הדגימה באמצעות לייזר של 647 ננומטר בכ-900 מילי-וואט לסנטימטר רבוע במישור הדגימה כדי להמחיש תבניות DNA בודדות. ברגע שצפיפות מספקת של כתמים נראית לעין, זרמו בתמיסה טרייה של מאגר שכפול כדי לשטוף עודפי DNA. עבור לשדה ראייה חדש וצלם תמונה של ה-DNA כדי לקבוע את מידת הקו-לוקליזציה בין הפולימראז המסומן למצע ה-DNA.
לאחר השלמתו, הגדל את עוצמת הלייזר כדי להלבין את הכתמים הנותרים. לאחר מכן, הכינו תמיסת פולימראז המכילה דיתיותרייטול, dNTPs ובדיקה פלואורסצנטית במאגר השכפול. זרימה של 100 מיקרוליטר מתמיסת הפולימראז בקצב של חמישה מיקרוליטר לדקה לתעלה.
לאחר שהדגימה נמצאת במיקוד וזווית הקרינה הכוללת של ההשתקפות הפנימית הותאמה, הגדר את עוצמת הלייזר של 647 ננומטר לכ-900 מילי-וואט לסנטימטר רבוע במישור הדגימה. התחל לדמות את שדה הראייה למשך הזמן הרצוי. רצף ה-G-quadruplex חסם את סינתזת הדלתא של פולימראז כפי שמצוין על ידי נוכחות של פס 60 נוקלאוטידים בג'ל הדף, בעוד שמצע הבקרה ללא ה-G-quadruplex ייצר פס של 100 נוקלאוטידים.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת אישרה כי לדלתא פולימראז היה זמן שהייה קצר יותר של שש פלוס מינוס שתי שניות על מצע ה-G-quadruplex, בהשוואה למצע הבקרה, שהיה לו זמן שהייה של 11 פלוס מינוס שלוש שניות. מספר אירועי הקישור של דלתא פולימראז היה גבוה משמעותית על מצע ה-G-quadruplex בהשוואה לביקורת, מה שמרמז על מחזורי קשירה וביטול קשירה מרובים עקב חסימת הסינתזה.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הדינמיקה של DNA פולימרזים בעת שהם נתקלים במבני G-quadruplex, המהווים מכשולים משמעותיים במהלך השכפול של ה-DNA. באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת, המחקר מ可מפה את התנהגותו של DNA polymerase delta בודד בעת שהוא מקשר עם מבנים מורכבים אלו, ובכך חושף נתיב חליפי שלא אופיין בעבר.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מחקר
- דינמיקה של שכפול DNA
- מתודולוגיה של מולקולה בודדת
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- תפקיד DNA פולימרזות בשחזור
- השפעת מבני G-quadruplex על פעילות הפולימרז
- חשיבותה של ויזואליזציה בזמן אמת בתהליכים ביולוגיים
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקה המבוססת על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- בדיקה של שכפול DNA ברמה של מולקולה בודדת
- הסדרה ניסויית מותאמת אישית הכוללת תאי זרימה והארה בלייזר
תוצאות עיקריות
- זיהוי נתיב חליפין חדש עבור פולימראז דלתא בעת מפגש עם G-quadruplexes
- זמן שהייה קצר יותר נצפה על מצע G-quadruplex בהשוואה לבקרה
- הסקה על מחזורי קישור וניתוק מרובים עקב חסימת הסינתזה
מסקנות
- מחקר זה מדגים את ההתנהגות המורכבת של DNA polymerases בתגובה למכשולים בשכפול
- הממצאים משפרים את ההבנה של מנגנוני שכפול DNA ומסייעים במחקר גנטי עתידי
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת של דינמיקת ה-DNA polymerase ב-G-quadruplexes נותנת מענה לאתגר קריטי בהבנת נאמנות השכפול ויציבות הגנום. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על התנהגות הפולימראז במפגש עם מכשולים ב-DNA, ובכך מספקת מידע להפחתת סיכונים מכניסטיים וביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי. גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי הבהרה של האופן שבו מכונה השכפול מגיבה למבני DNA מורכבים הרלוונטיים למחלות ולמטרות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תגובת ה-DNA polymerase לחסימות מסוג G-quadruplex.
- מבהיר את המסלולים המכניסטיים העומדים בבסיס השהיית השכפול ואירועי חליפה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות עבור חלבונים המעורבים בתחזוקת הגנום.
- משפר את הביטחון החזוי בבחירת מטרות המושפעות ממבנים שניוניים של DNA.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקל על פיתוח של בדיקות כמותיות של מולקולה בודדת לפעילות פולימראז.
- מאפשר מדידה הדירה של קינטיקת קישור וזמני שהייה במכשולים של DNA.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה להערכת אינטראקציות חלבון-DNA תחת תנאים מוגדרים.
- מכין מערכות מתוקפות לסריקה המשכית של מודולטורים המשפיעים על דינמיקת הפולימראז.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מספק תובנה מכניסטית לגבי עקה של השכפול הרלוונטית למודלים של מחלות.
- מתואם עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קישור התנהגות הפולימראז לחוסר יציבות גנומית.
- תומך ברצף מהגילוי המולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות לתחזוקת הגנום.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים של מועמדים המווסתים את דיוק השכפול של ה-DNA.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת פלואורסצנציית מולקולה בודדת זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לתיקוף במודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי השהיית פולימראז והחלפה ב-G-quadruplexes.
- סריקה: מספק מדדים כמותיים של אירועי קישור וזמני שהייה לצורך מוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מספק פלטים סטטיסטיים על קינטיקה של פולימראז לצורך השוואה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנונים מולקולריים לבין מודלים של עקה בשכפול הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר אינטראקציות מגוונות בין DNA לחלבונים ברזולוציה של מולקולה אחת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בביולוגיה של שכפול.
- ערך תפעולי: Standardization של בדיקות מולקולה בודדת לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי הבהרה של מעורבות המטרה במכשולים של DNA.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות ומסלולים לתחזוקת הגנום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מולקולה בודדת ובתכנון מערכי בדיקה במיקרופלואידיקה.
- דורש מכשור ייעודי לדימוג בזמן אמת ולניתוח כמותי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הבדיקה ושל פרשנות הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה לסובסטראטים שונים של DNA או למטרות חלבוניות שונות.
- קיבולת העיבוד והיכולת להרחבה מוגבלות על ידי יכולות הדימוג והניתוח.
