In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

כדי להבין את דינמיקת הרשת של מיקרו-מעגלים בניאו-קורטקס, חיוני לתעד בו זמנית את פעילותם של מספר רב של נוירונים. in vivo. הדמיית סידן היא השיטה היחידה המאפשרת לתעד את הפעילות של אוכלוסיית נוירונים צפופה ברזולוציה של תא בודד.

השיטה מורכבת מהשתלת חלון הדמיה גולגולתית, הזרקת צבע סידן פלואורסצנטי שיכול להיקלט על ידי מספר רב של נוירונים, ולבסוף תיעוד פעילות הנוירונים באמצעות הדמיית סידן בזמן-lapse. היי, אני פיימן מהמעבדה של קרלוס פורטר קאיו במחלקה לנוירולוגיה בבית הספר לרפואה של דיוויד גפן ב-UCLA. בסרטונים קודמים, המעבדה שלנו הדגימה הליך לביצוע קרניוטומיה והדמיית פוטון של זרימת הדם בעכברים.

היום נראה לכם הליך לביצוע הדמיית סידן in vivo to photon בעכברים. אז בואו נגיע לזה לפני שמתחילים. יש להכין את תמיסת הזרקת הצבע.

ראשית, הכינו את תמיסת מחוון הסידן הפלואורסצנטי. אנו משתמשים בצבעי אתיל אסטר או בקיצור בצבעי אם. אלה צבעים שיכולים להיקלט על ידי תאים כאשר הם מוזרקים מחוץ לתא, אנו משתמשים בדרך כלל בבאפט"א ירוק איברים 1:00 בבוקר או בשפעת או 4:00 בבוקר בריכוז של מילימול אחד.

ראשית אנו מכינים תמיסה של 20% של אוניק F1 27. ב-DMSO, אנו מחממים את התמיסה לפני השימוש כל יום עד שהיא צלולה. אנו ממיסים את מחוון הסידן ב 20% onic F1 27 DMSO למשך 15 עד 20 דקות לריכוז של 10 מילימולר.

לאחר מכן אנו מדללים את התמיסה למילימולרית אחת בתמיסה המכילה מילי-מולרית אחת 50 ו-ACL 2.5 KCL 10 ערימות, pH 7.4 ומערבולת למשך 10 עד 20 דקות נוספות. אנו מוסיפים 100 רומין גופרית מיקרו-מולרי 1 0 1 כדי לסמן אסטרוציטים באופן סלקטיבי וכדי לדמיין את הפיפטה במהלך הזרקת הצבע, אנו משתילים חלון גולגולת מעל האזור המיועד לצילום. הגישה הכללית לניתוח זה מתוארת על ידינו במאמר וידאו שפורסם בעבר, אך השינויים הבאים חשובים להזרקת צבע סידן.

קרניוטומיה קטנה יותר בקוטר של שני מילימטרים נעשית מעל אזור קליפת המוח, תוך הקפדה יתרה לא לפגוע בדורה הבסיסית. החלקת כיסוי מאובטחת במקומה מעל הגולגולת, אך מכסה רק חלקית את הגולגולת, ומשאירה רווח קטן בין קצה הגולגולת להחלקת מכסה הזכוכית כדי לאפשר מקום לפיפטה להיכנס לקליפת המוח בצורה אלכסונית לפני ההזרקה. באר רדודה עם מלט דנטלי מיוצרת סביב הגולגולת.

הבאר לניסויי הדמיית סידן צריכה להשתרע רחוק ככל האפשר בכיוון הרוסטרלי ולהיות רדודה מספיק כדי לאפשר הכנסת הזרקת מיקרו פיפטה, אנו מסננים את התמיסה עם מסנן צנטריפוגלי של 0.45 מיקרון מיד לפני ההזרקה. לאחר מכן העכבר מועבר לשלב המיקרוסקופ והראש משותק כפי שמוצג בסרטון שלנו על הדמיית זרימת הדם. לאחר מכן, אנו מושכים פיפטות מיקרו אלקטרודות זכוכית לקוטר קצה המניב שניים עד ארבעה מגה אוהם בהתנגדות.

בעזרת מושך פיפטה, תערובת הצבע של מחוון הסידן נטענת על פיפטת הזכוכית. באמצעות מזרק מיקרו באמצעות מיקרו מניפולטור, מורידים את המיקרו פיפטה בעדינות על פני המוח באמצעות מטרה של פי ארבעה ואז ממוקמים בצורה עדינה יותר. תחת יעד של פי 40, נבחר מיקום מתאים להזרקה כך שיהיו מעט כלי דם או ללא כלי דם מעל.

כדי לטשטש את ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים, קצה המיקרו-פיפטה מדומיין ומתקדם לאט לתוך קליפת המוח לעומק של 200 מיקרומטר מתחת לדורה. כדי לבצע זאת בצורה מדויקת ככל האפשר, קריאת המיקוד Z של המטרה מוגדרת לאפס. ברגע שהדורה מדומה, אז המיקרו פיפטה מדומיינת וקריאת המיקוד Z נלקחת כאשר המיקרו פיפטה מורידה למוח ל-200 מיקרומטר מתחת לדורה.

לאחר מכן מזריקים את תערובת D בלחץ ב-10 PSI למשך דקה אחת. באמצעות פיקו שפיצר, אנו בדרך כלל מספקים שתיים עד ארבע זריקות של תערובת צבע הסידן AM המופרדת בחלל בכ-200 עד 300 מיקרון. גישת העמסה בתפזורת זו של זריקות חופפות מעט מבטיחה ששטח גדול כמו 600 על 600 מיקרון מוכתם כראוי להדמיית סידן.

ההדמיה מתחילה שעה לאחר הזרקת תערובת הצבע כדי לאפשר לצבע להתפזר ולהיספג על ידי נוירונים. הדמיה של שני פוטונים in vivo מתבצעת עם מיקרוסקופ שני פוטונים בהתאמה אישית באמצעות לייזר ספיר זיקית המכוון ל-800 עד 880 ננומטר וטכנולוגיית קיימברידג'. תמונות מראות גלוונומטר נרכשות באמצעות תוכנת סריקת תמונה שפותחה ב-Carl's Vida's.

עוצמת לייזר במעבדה היא בדרך כלל הרבה מתחת ל-70 מילי-וואט בדגימה. תמונות שדה שלם מתקבלות באמצעות יעד אולימפוס של 20 x 0.95 NA במהירות של 1.95 עד 15.63 פריימים לשנייה, חמש בגודל 12 על 2 56 פיקסלים עד 2 56 על 64 פיקסלים. סריקות קו נרכשות ב-500 הרץ במהלך ההדמיה.

בעלי חיים מוחזקים תחת פלואור קל, הרדמה של 0.6 עד 0.9% וגם מוחזקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות מכשיר של הרווארד. מכשיר בקרת טמפרטורה מקפיד לשמור על קצב הנשימה של בעלי החיים קרוב ככל האפשר ל-100 נשימות לדקה. רמה זו של שימוש בהרדמה היא הרמה הנמוכה ביותר שמשתק את בעל החיים, אך עדיין מאפשר רישום פעילות ספונטנית.

אז עכשיו בואו נסתכל על ניסוי הדמיית סידן טיפוסי. ישנם שני שלושה נוירונים של קליפת המוח הסומטו-סנסורית של עכבר לאחר הלידה לשמונה 10. היו מוכתמים ב-BTA am ירוק איבר וצולמו עם מטרה של 20 x 0.95 NA.

התמונות צולמו כל 0.512 שניות. סרטון זה בן שלוש דקות מראה הפעלה משותפת של חלקים גדולים של נוירוני הכתם הזה המתרחשת פעם עד פעמיים בדקה. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע הדמיית סידן in vivo של פעילות הרשת בשכבה השנייה שלוש של קליפת המוח.

יתרונה של שיטה זו על פני הקלטות אלקטרופיזיולוגיות הוא בכך שהיא פחות פולשנית ומאפשרת רישום פעילות ברשתות עצביות צפופות. בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע הגולגולת כדי לא לפגוע בדורה.

אפילו כמות קטנה של דימום תת-דוראלי תטשטש מאוד את ההדמיה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.