Name: In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למד הדמיית סידן דו-פוטונית in vivo בשכבות 2/3 של קליפת המוח בעכברים. שיטה זו מאפשרת הקלטת פעילות נוירונים ברזולוציית תא בודד לחקר דינמיקת רשתות עצביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות אולגה Garaschuk לדיונים מועיל על אופטימיזציה של העמסה מרבית האינדיקטורים סידן.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון פלורסנט אינדיקטור סידן. אנו משתמשים בצבעי אסתר acetoxymethyl, או בקיצור AM צבעים. אלה הם צבעים שניתן לנקוט על ידי תאים כאשר הוא מוזרק extracellularly. אנו משתמשים בדרך כלל אורגון-Green-BAPTA 01:00 או Fluo, 04:00 בריכוז של 1 מ&quot;מ. צבעים AM ניתן להשיג Invitrogen ב 50 בקבוקונים מיקרוגרם. אנחנו הראשונים להכין פתרון 20% Pluronic F-127 ב DMSO. אנו חם הפתרון לפני השימוש בכל יום עד ברור שלה. אנו לפזר את החיווי הסידן F-127/DMSO Pluronic 20% במשך 15-20 דקות עד לריכוז של 10 מ&quot;מ. לאחר מכן, אנו לדלל הפתרון 1mm בתמיסה המכילה, במ&quot;מ: 150 NaCl, KCl 2.5, 10 Hepes, pH 7.4. בנוסף, 100 Sulforhodamine 101 מיקרומטר נכלל בדרך כלל האסטרוציטים התווית לדמיין את פיפטה במהלך ההזרקה. אנחנו לסנן את הפתרון לפני זריקה עם מסנן 0.49 מיקרון צנטריפוגלי (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתל חלון הגולגולת מעל האזור להיות צילמו. יש לנו <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">תיאר את הגישה הכללית של יופיטר</a> , אך את השינויים הבאים חשובים הזרקת צבע סידן: הפוך craniotomy קטן של 2 מ&quot;מ בקוטר מעל אזור בקליפת המוח של עניין, מטפלת קיצוני לא לפגוע הדורה הבסיסית. Secure coverslip במקום על craniotomy, אבל רק חלקית לכסות את craniotomy, השארת רווח קטן בין הקצה של craniotomy לבין coverslip זכוכית כדי לאפשר מקום טפטפת כדי להזין את קליפת המוח בעקיפין. לפני הזריקה, לעשות גם רדוד במלט שיניים סביב craniotomy. גם צריך להאריך מקורי כמו הכיוון להיות רדודים מספיק כדי לאפשר החדרת micropipette להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר הועברו בשלב של המיקרוסקופ לבין לשתק את הראש, כפי שמוצג שלנו <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">וידאו על הדמיה זרימת הדם</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך microelectrode pipettes זכוכית בקוטר טיפ מניב 2-4 מגה אוהם התנגדות, חולץ בעזרת פיפטה. עומס מחוון סידן לצבוע לערבב על פיפטה הזכוכית באמצעות microsyringe. שימוש micromanipulator, בעדינות להוריד את micropipette על פני השטח של המוח באמצעות המטרה 4X, אשר אז ממוצבת היטב תחת מטרה 40X. בחר מיקום מתאים הזרקה, כך יש מעט או ללא כלי דם המכסה כדי לטשטש את ההדמיה. באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ, את קצה פיפטה הוא מדמיין מתקדמים לאט לתוך קליפת המוח, עד לעומק של 200 מיקרומטר מתחת הדורה. לאחר מכן, הלחץ להזריק את התערובת לצבוע ב PSI 10 דקה 1 באמצעות Picospritzer. אנחנו בדרך כלל לספק 2-4 זריקות של תערובת סידן לצבוע בבוקר, המופרדים בחלל בכ 200-300 מיקרון. גישה זו טוען עיקר זריקות מעט חופפות מבטיח כי שטח גדול כמו 600 x 600 מיקרון הוא מוכתם כראוי הדמיה סידן. בגין 1 שעה הדמיה לאחר ההזרקה של התערובת AM לצבוע, כדי לאפשר לצבוע כדי מפוזר להיות נלקח על ידי נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ב-vivo שני הפוטונים הדמיה עם מנהג עשה מיקרוסקופ שני הפוטונים באמצעות TI-Sapphire Chameleon לייזר (מכוון 800-880 ננומטר) וקיימברידג&#39; מראות טכנולוגיה גלונומטר. אנו לרכוש תמונות באמצעות תוכנת ScanImage שפותחה במעבדתו של קארל סוובודה (Pologruto et al., 2003). כוח לייזר היא בדרך כלל הרבה מתחת 70 mW ב המדגם. תמונות שדה שלם או נרכשים באמצעות 20X (0.95 NA) או 40X (0.8 NA) מטרות אולימפוס, בשעה 1.95-15.63 מסגרות לשנייה (512 x 256 פיקסלים 256 x 64 פיקסלים). סריקות קו נרכשים על 500 הרץ. במהלך הדמיה, בעלי חיים נשמרים תחת הרדמה isoflurane אור (0.6-0.9%), ו נשמרים גם ב 37 מעלות צלזיוס טמפרטורה באמצעות מנגנון הרווארד התקן הבקרה. טיפול הוא נלקח כדי לשמור על קצב הנשימה של בעלי חיים קרוב ל 100 נשימות / דקה ככל האפשר. רמה זו של שימוש הרדמה היא הרמה הנמוכה ביותר שמגביל את בעל החיים, אבל עדיין מאפשר פעילות ספונטנית שיירשמו. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

היתרון של שיטה זו על פני הקלטות אלקטרו היא שזה פחות פולשני ומאפשר הקלטות של פעילות צפופה רשתות נוירונים עצביים. כאשר עושים את זה הליך זה חשוב לזכור לטפל קיצוניים בעת ביצוע craniotomy לא לפגוע הדורה. אפילו כמות קטנה של דימום עם subdural מאוד לטשטש את ההדמיה.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 ב-DMSO</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>מסנן צנטריפוגלי (0.45 micron)</td><td>ריאגנט</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo 2-photon סידן הדמיה ב layer 2 / 3 של עכברים

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד. השיטה מורכבת השתלת חלון הדמיה גולגולתי, הזרקת סידן פלורסנט אינדיקטור צבע זה יכול להיות נלקח על ידי מספר גדול של נוירונים ולבסוף להקליט את פעילותם של הנוירונים עם הדמיה זמן לשגות סידן שימוש ב-vivo two מיקרוסקופ פוטון. שיתוף הזרקת astrocyte ספציפי צבעים מאפשרת להבדיל בין הנוירונים האסטרוציטים. הטכניקה ניתן לבצע בעכברים לבטא מולקולות ניאון subpopulations ספציפיים של נוירונים כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות רשת של קבוצות שונות של תאים.

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

כדי להבין את הדינמיקה הרשתית של מעגלים זעירים (microcircuits) בנאוקורטקס, חיוני להקליט בו-זמנית את הפעילות של מספר רב של נוירונים.

כדי להבין את הדינמיקה הרשתית של מעגלים זעירים (microcircuits) בניאוקורטקס, חיוני להקליט בו-זמנית את הפעילות של מספר רב של נוירונים in vivo. דימוי סידן הוא השיטה היחידה המאפשרת להקליט פעילות של אוכלוסיית נוירונים צפופה ברזולוציה של תא בודד.השיטה מורכבת מהשתלת חלון הדמיה קרניאלית, הזרקת צבע סידן פלואורסצנטי שיכול להיספג על ידי מספר רב של נוירונים, ולבסוף הקלטה של פעילות הנוירונים באמצעות הדמיית סידן בשיטת time-lapse. שלום, אני פיימן מהמעבדה של קרלוס פורטר קאיו במחלקה לנוירולוגיה בבית הספר לרפואה דייוויד גפן ב-UCLA. בסרטונים קודמים, המעבדה שלנו הדגימה הליך לביצוע קרניאוטומי והדמיה של זרימת דם בעכברים בשיטת דו-פוטון.היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע דימיון סידן בשיטת שני-פוטון in vivo בעכברים. בואו נתחיל. לפני תחילת העבודה, יש להכין את תמיסת ההזרקה של הצבע.ראשית, הכינו את תמיסת האינדיקטור הפלואורסצנטי לסידן. אנו משתמשים בצבעי אתיל-אסטר, או בקיצור צבעי AM. אלו הם צבעים שסופגים על ידי תאים כאשר הם מוזרקים באופן חוץ-תאי; בדרך כלל אנו משתמשים ב-organ green BAFTA 1:00 AM או ב-flu oh 4:00 AM בריכוז של 1 mM.ראשית נכין תמיסה של 20% של onic F1 27 ב-DMSO. נחמם את התמיסה מדי יום לפני השימוש עד להפיכתה לשקופה. נהמס את אינדיקטור הסידן ב-20% onic F1 27 DMSO למשך 15 עד 20 דקות עד להשגת ריכוז של 10 milli

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.

סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

כאן, אנו מציגים הליך לביצוע בקנה מידה גדול Ca 2 + הדמיה עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים נעים באופן חופשי. מאות תאים פעילים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, ראש רכוב יחד עם בדיקה מנסר פריזמה.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

למד הדמיית סידן דו-פוטונית in vivo בשכבות 2/3 של קליפת המוח בעכברים. שיטה זו מאפשרת הקלטת פעילות נוירונים ברזולוציית תא בודד לחקר דינמיקת רשתות עצביות.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

גלה סרטונים נוספים