הדמיית אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס מבוססת ברקוד DNA לניתוח דגימות FFPE ממלנומה עכברית מתוכנתת מחדש גנטית

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ואימות פאנל אימונופלואורסצנטי מולטיפלקס לחקר רקמות FFPE של עכברים ומדגימים את התועלת שלו על ידי חקר דגימות ממודל מלנומה שטופלו בננו-חלקיקים המספקים DNA פלזמה, המקודדים אותות אימונולוגיים לתכנות מחדש של מיקרו-סביבת הגידול. התחום היה חסר פרוטוקולי אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס שפותחו ואומתו בקפדנות התואמים לרקמות FFPE משובצות פרפין קבועות בעכבר.

הטמעת פרפין קבועה בפורמלין משמרת את מורפולוגיה הרקמה לטווח ארוך, קלה לטיפול ולאחסון ומאפשרת יצירת מיקרו-מערכי רקמות לצפייה במספר דגימות בשקופית אחת.

הדמיית פרוטאומיקה מרחבית תשפר את ההדמיה והניתוח של מיקרו-סביבה מורכבת של גידול, ובסופו של דבר תסייע בחיזוי תגובות חיסוניות, מה שיכול לתרום לפיתוח טיפולים טובים יותר.

אנו נשתמש בפרוטוקול זה כדי לאפשר פרופיל מרחבי משופר של מודלים של גידולי עכברים על פני סוגי גידולים רבים נוספים ואיברים חיסוניים שונים.

[קריין] כדי להתחיל, אופים את שקופיות הרקמה FFPE בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת יש לקרר את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני שמתחילים בדפרפיניזציה והחזרת נוזלים. לאחר מכן, דגרו את השקופיות בתמיסת קסילן פעמיים למשך חמש דקות כל אחת כדי להסיר פרפין, ולאחר מכן החזירו לחות לרקמה על ידי הזזת המגלשות דרך 100% אתנול פעמיים למשך חמש דקות כל אחת. הנח את השקופית ברצף בתמיסות אתנול של 90%, 70%, 50% ו-30% למשך חמש דקות כל אחת. שוטפים את המגלשות פעמיים במים מזוקקים למשך חמש דקות כל אחת. בצע אחזור אנטיגן, ולאחר מכן השתמש בתמיסת הלבנה טרייה כדי להלבין את הרקמה פעמיים למשך 45 דקות לפני ביצוע צביעת נוגדנים. לאחר מכן, בצע את צביעת הנוגדנים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס באמצעות תא פלסטיק. לאחר הצביעה, הסר את תא הפלסטיק ואסוף את קוקטייל הנוגדנים שהוחל בעבר. שטפו את השקופיות פעמיים במאגר מכתים למשך שתי דקות כל אחת. דגרו את השקופיות בצנצנת מכתים המכילה 40 מיליליטר תמיסת קיבוע לאחר צביעה למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו אותן עם PBS שלוש פעמים למשך שתי דקות כל אחת. כעת העבירו את השקופיות למתנול קר כקרח למשך חמש דקות, לפני שטיפה עם PBS. מרחו 200 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע סופית על כל שקופית מתחת לתא לחות. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו שוב את השקופיות ב-PBS למשך שלושה מחזורים של שתי דקות כל אחד. אם הדמיה מיד, נגב את השקופית סביב הרקמה באמצעות טישו נטול מוך. לחץ על תא הזרימה למשך 30 שניות באמצעות ציוד הרכבת תאי זרימה. אם הדמיה מאוחר יותר, אחסן את השקופית מבלי להחיל את תא הזרימה במאגר האחסון בארבע מעלות צלזיוס. כאשר אתה מוכן לצלם, העבר את השקופיות ממאגר האחסון ל-PBS למשך 10 דקות לפני החלת תא הזרימה. לאחר מכן, הכן מאגרי DMSO פועלים על סמך מחזורי ההדמיה הרצויים. הכן את פתרון מלאי המדווח הנדרש למספר הכולל של מחזורי הדמיה. פיפטה 250 מיקרוליטר של תמיסת מלאי מדווח וחמישה מיקרוליטר מכל מדווח לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה שחורים או ענבריים של מיליליטר. מעבירים את התמיסה לצלחת שחורה של 96 בארות ואוטמים אותה בנייר כסף. כעת הפעל את התקן ההדמיה והשתמש במנהל המכשירים כדי להגדיר את הפרמטרים וזמני החשיפה. הנח את לוחית הדיווח במכשיר ולאחר מכן הנח את השקופית במחזיק המיקרוסקופ כדי להתחיל בהדמיה. רכוש תמונות של רקמות מוכתמות. התקן את הגרסה העדכנית ביותר של תוכנת ניתוח פתולוגיה דיגיטלית. לחץ על צור פרויקט ובחר תיקיית יעד עבור שטח הפרויקט. לאחר מכן, לחץ על הוסף תמונות, ולאחר מכן בחר קבצים. לאחר מכן נווט לקובץ QuP TIFF המופק מהדמיה אימונופלואורסצנטית מרובה. קבעו את סוג התמונה לפלואורסצנטיות, שמרו על קביעות ברירת המחדל ולחצו על 'ייבוא'. אם אתה משתמש ב-QuPath, לחץ פעמיים על התמונה החדשה כדי לפתוח סביבת עבודה, ולאחר מכן הקש File ו-Save מעת לעת כדי לעקוב אחר שינויים בפרויקט. החלף את הגדרות התצוגה והתצוגה של הסמן באמצעות כלי הבהירות והניגודיות בסרגל הכלים. השתמש בכלי המברשת או השרביט כדי לצייר הערה סביב כל מקטע הרקמה. הגדר הערה זו כרקמה מלאה תוך אי הכללת עור או אזורים שאין לנתח. החזק את מקש ALT לחוץ כדי ליצור ביאורים שליליים או לכווץ גבולות. כעת בחר את ההערה על ידי לחיצה על הכרטיסייה ביאורים ולחיצה על אובייקטים ואחריהם הערות, ולאחר מכן לחץ על שכפל ביאורים נבחרים. הפעל את ערוץ SOX 10 ולאחר מכן כווץ את ההערה המשוכפלת כדי להגדיר את אזור הגידול באמצעות ALT + מברשת/שרביט כלי. כעת בחר את ביאור הרקמה המלא. לאחר מכן עבור אל אובייקטים ואחריהם ביאורים והרחב ביאורים. הגדר את רדיוס ההרחבה למיקרומטר אחד ולחץ על הפעל. שנה את שם ההערה החדשה הזו להרחבת רקמות מלאה. בחר את ביאור הגידול, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הוסף בהירארכיה. בחר מחדש את ביאור הגידול ולאחר מכן עבור אל אובייקטים, ביאורים וכעת לחץ על הפוך הגדר את ההערה החדשה הזו כ-Stroma וחזור על הפעולה עבור כל חלקי הרקמה. כדי להפעיל פילוח תאים, לחץ על תמונה הכרטיסייה כדי למצוא את רוחב הפיקסלים וגובה התמונה. הורד את התוסף StarDist מ-GitHub. ייבא את קובץ StarDist.jar סיומת QuPath ל-QuPath. הורד גם את קבצי הסקריפט הגרוביים של StarDist וקובץ המודל מ-GitHub. עבור כל קטע רקמה, בחר הערות גידול וסטרומה. בסרגל ההגדרות, לחץ/י על ״אוטומציה״ ולאחר מכן על ״עורך התסריטים״ כדי לפתוח את ממשק התסריט. פתח את סקריפט פילוח התאים המתאים של StarDist המתאים לגודל הפיקסלים של התמונה. כאשר תתבקש, בחר StarDistcellsegmodel.pb עבור פילוח תאים. לאחר פילוח התאים שמור את התמונה, ולאחר מכן לחץ ברצף על מדידה, ייצוא מדידות, בחר את התמונות המתאימות והגדר את סוג הייצוא כתאים ואת המפריד כ-.csv. בחר מיקום קובץ פלט ולאחר מכן לחץ על אכלס כדי לכלול מדדים רלוונטיים. עבור כל סמן שושלת שישמש באשכולות או בפנוטיפ, בחר ערך ממוצע אחד לייצוא. לנורמליזציה של נתונים פרוטאומיים, פתח את קובץ ה- CSV המיוצא וחתוך את כותרות העמודות כדי לשמור על שם הסמן בלבד. לאחר התקנת הגרסה העדכנית ביותר של R & R Studio, הורד את סקריפט הנורמליזציה של הסמן .r מ-GitHub והפעל אותו כדי לסנן תאים על סמך גודל גרעיני. בצע נורמליזציה מינימלית/מקסימלית עבור כל סמן. לאחר השלמתו, שמור את קובץ ה- CSV החדש עם הנתונים המנורמלים. צימוד ברקוד DNA של נוגדנים אושר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל חלבון, המראה רצועות נוספות באזור השרשרת הכבדה. הדמיה אימונופלואורסצנטית מרובה של גידולי צד B16-F10 שטופלו בננו-חלקיקים 4-1BBL/IL-12 ואנטי-PD1 מערכתי הראתה ביטוי סמן חיסוני מובהק על פני חלקי הגידול. אשכולות FlowSOM זיהו טווח רחב יותר של עוצמות ביטוי סמנים בהשוואה לפנוטיפ Seurat, עם הפרש עוצמה מקסימלי של כ-0.7 לעומת 0.5. פנוטיפ FlowSOM גם סיווג מספר גבוה יותר של מקרופאגים לתת-סוגים M1 ו-M2. כימות צפיפות המקרופאגים הראה כי FlowSOM זיהה צפיפות גבוהה יותר של מקרופאגים M1 ו-M2 בהשוואה ל-Seurat, בעוד ש-Seurat סיווג יותר מקרופאגים כאחרים. ניתוח מרחבי גילה כי למקרופאגים M2 ותאי הרג טבעיים היו המרחקים המינימליים הממוצעים הגבוהים ביותר לאחר הטיפול ומקרופאגים M1 היו נפוצים יותר סביב תאי CD8 T.