ב Ovo Xenografting של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) שמקורם בחולה (PDX-ALL)

היקף המחקר הוא ביולוגיה של סרטן, תוך התמקדות בזיהוי אסטרטגיות טיפוליות לטיפול בסרטן. מודל הלוקמיה הלימפובלסטית החריפה שמקורו בחולה ביצית מוגבל על ידי חלון ניסוי קצר יחסית של כ-10 ימים, המגביל מחקרים ארוכי טווח על התקדמות לוקמיה לימפובלסטית חריפה או תגובה לתרופות מעבר למסגרת זמן זו. פרוטוקול זה קובע שיטה מהירה וחסכונית להשתלת ביציות של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה שמקורם בחולה, כולל שושלות תאי B ותאי T.

פרוטוקול זה מייצג כלי מבטיח לסינון תרופות פרה-קליניות, מחקרים מכניסטיים וגישות רפואה מותאמות אישית בחקר לוקמיה. תיבחן היתכנות השימוש במודל ה-ovo xenograft שהוקם ליישומים פרה-קליניים. כדי להתחיל, העבירו את הביצים שנרכשו לאינקובטור גלגול לח המוגדר בכ-50 עד 60% לחות וטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס.

דגרו את הביצים בחממה זו למשך 10 ימים לאחר ההפריה. העבירו את דגימות הדם לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר ודללו כל דגימה שלוש פעמים באמצעות שני נפחים של PBS. לאחר צנטריפוגה של הדגימה יחד עם מדיום שיפוע צפיפות, אספו את שכבת המעיל של תאים חד-גרעיניים מהממשק והעבירו אותה לצינור סטרילי חדש של 15 מיליליטר.

הוסף 10 מיליליטר PBS לצינור וצנטריפוגה את הצינורות ב-300 גרם למשך חמש דקות כדי להסיר את רכיבי הסרום הנותרים. השעו מחדש את התאים הגלולים במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים.

השעו מחדש את התאים במדיום הקפאה המורכב מ-10% DMSO ב-FBS. העריכו את כדאיות התאים באמצעות בדיקת אי הכללת הטריפן הכחול והקפיאו את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס ואחסנו אותם בחנקן נוזלי. לאחר מכן, העבירו 1.5 מיליון תאי T HEK 293 עם וקטור הפלסמיד הרצוי באמצעות ליפופקטמין 3000 ודגרו על התאים שעברו טרנספקט למשך יומיים.

קצרו את הסופרנטנט המכיל לנטי-וירוס מהבארות וסננו אותו דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת. העבירו את הסופרנטנט הנגיפי המסונן לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגה ב-20,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. לצורך תיוג, צלח 1 מיליון תאים למיליליטר של קווי תאי SEM ותאי T MOLT3 מבשרי תאי B וכן תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה B או T שמקורם בחולה לתוך צלחות בנות שש בארות המכילות RPMI 1640 עם 10% FBS.

דמיין תאים עם תווית mCherry תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביום 10, בדוק את כלי הדם של עוברי הגוזלים באור כדי להעריך את כדאיות העובר, שטוף בעדינות את פני השטח של כל ביצה עם 70% אתנול. בעזרת מקדחה ידנית, קדחו לתוך תא האוויר של כל ביצה כדי ליצור חלון קטן בקוטר של כשני סנטימטרים.

אטמו את החלון שנוצר בעזרת סרט דבק שקוף והחזירו את הביצים לחממת פחמן דו חמצני של 5%. ביום ה-11, הזריקו 10 מיליון תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה המסומנים ב-mCherry לכלי הדם של העוברים המתפתחים באמצעות מחטים בגודל 34. לאחר איטום החלון, החזירו את הביצים לחממת פחמן דו חמצני של 5% ועקבו אחר כדאיות העובר מדי יום.

ביום ה-15, נתחו את כלי הדם מהעוברים. הניחו אותם על שקופיות זכוכית וצלמו קסנוגרפטים מוצלחים באמצעות מיקרוסקופ מנתח המצויד ביכולות פלואורסצנטיות. אוספים דם מכלי הדם של עוברי עוף באמצעות מזרק סטרילי עם מחט בגודל 32.

העבירו את הדם לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר המכיל הפרין וצנטריפוגה ב-226 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. סמן תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי B עם נוגדני FITC CD10 אנושיים ונוגדני PE CD19 אנושיים ותאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T עם נוגדנים FITC CD4 אנושיים ונוגדני PE CD8 אנושיים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות. שטפו את התאים המסומנים פעמיים באמצעות PBS המכיל 1% BSA וניתוח באמצעות זרימה ציטומטרית קולוניזציה של כלי הדם על ידי קווי תאים SEM ו-MOLT3 נראו בבירור ארבעה ימים לאחר ההזרקה, מה שאישר השתלה מוצלחת בכלי הדם המתפתחים של עוברי התרנגולות.

תאי B-all ו-T-all שמקורם בחולה הראו אותות פלואורסצנטיים חזקים בכלי הדם ארבעה ימים לאחר ההזרקה, מה שמעיד על קולוניזציה פעילה והתפשטות בכלי הדם. ציטומטריית זרימה הראתה עלייה משמעותית בתאים חיוביים ל-CD10/CD19 בעוברים שהוזרקו עם SEM ותאי B-all שמקורם בחולה ארבעה ימים לאחר ההזרקה בהשוואה לבקרות שנאספו שש שעות לאחר ההזרקה. באופן דומה, תאים חיוביים ל-CD4/CD8 היו גבוהים משמעותית בעוברים שהוזרקו עם MOLT3 ותאי T-all שמקורם בחולה ארבעה ימים לאחר ההזרקה.