Name: חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו להשתמש בחיישני BRET למדידת פעילות חלבון G בתאי HEK293 חיים בתגובה לליגנדים של קולטני GPCR. שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של איתות תאי וזיהוי ליגנדים מוטים לפיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs.</a> Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Advances+in+structures%2C+mechanisms%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">protein pathways.</a> Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).</li>
<li>Hepler, J. R., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">G proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).</li>
<li>Van Unen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+FRET+sensors+for+robust+measurement+of+G%CE%B1i1%2C+G%CE%B1i2+and+G%CE%B1i3+activation+kinetics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells.</a> PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2411 (2001).</li>
<li>Galés, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+activation-promoted+structural+rearrangements+in+preassembled+receptor-G+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).</li>
<li>Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+constitutive+G+protein-coupled+receptor+activity+with+BRET-based+G+protein+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors.</a> Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).</li>
<li>Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+GPCR+functional+assays+based+on+resonance+energy+transfer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).</li>
<li>Scott-Dennis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+membrane-based+Gi-CASE+biosensor+assay+for+profiling+compounds+at+cannabinoid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors.</a> Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).</li>
<li>Violin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+signaling+and+desensitization+elucidated+by+quantitative+modeling+of+real-time+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics.</a> J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).</li>
<li>Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+isoproterenol+modulation+of+beta-adrenergic+receptor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics.</a> Life Sci. 38, 309-315 (1985).</li>
<li>Thomas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+receptor+binding+analyses+of+cannabinoid+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists.</a> J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).</li>
<li>Schihada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+GPR35+have+distinct+extracellular+N-termini+that+allosterically+modify+receptor-transducer+coupling+and+mediate+intracellular+pathway+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias.</a> J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6664">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68463">10.3791/68463</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68463">BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

<table><tbody><tr><td>לוח גידול מתקדם עם 96 בארות, לבן עם תחתית שטוחה שקופה, עם מכסה, ביו-אחד של גריינר</td><td>דאצ'ר</td><td>655983</td><td></td></tr><tr><td>סרט לבן של BrightMax ClearLine</td><td>דאצ'ר</td><td>760245</td><td></td></tr><tr><td>ClarioSTAR LVF</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DPBS מותאם, ללא כלוריד סידן ומגנזיום כלוריד, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתאים</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו' s Modified Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAX</td><td>סיגמא</td><td>D0822</td><td>חם ב-37 ומעלות גבוה; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Venus</td><td>אדג'ין</td><td>168122</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ מתנה מגונאר שולטה</td></tr><tr><td>Galphas (איזופורם קצר)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-Venus</td><td>אדג'ין</td><td>168124</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ מתנה מגונאר שולטה</td></tr><tr><td>HEK-293T עם ביטוי יציב של CB1R (HEK CB1)</td><td></td><td></td><td>מתנה נדיבה ממר גוזמן (אוניברסיטת קומפלוטנסה, מדריד, ספרד)</td></tr><tr><td>HEK-293T מסוג פראי (משקל HEK)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופרוטרנול</td><td>סיגמא</td><td>I6504</td><td>ממוסס ב-H20 ונשמור ב-&ndash; 20 ודרגה C</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>תוסף Opti-MEM I מופחת בסרום מדיום GlutaMAX</td><td>פישר</td><td>11564506</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 דגל בטא-2-אדרנרגי-רצפטור תג FLAG C-ter</td><td></td><td></td><td>מתנה נדיבה של ד. פרייס (IINS, בורדו)</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-(ריק)-TAG</td><td>אדג'ין</td><td>138209</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פולי-אל-ליזין (PLL)</td><td>סיגמא</td><td>RNBL7086</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>ניצחון-55,212-2</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>10009023</td><td>ממיס ב-DMSO ונשמור ב-&ndash; 20 ודרגה C</td></tr></tbody></table>

חיישנים ביולוגיים של חלבון g מבוססי bret למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון g בתאים חיים

BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of transmembrane receptors, playing a crucial role in cellular signaling by transducing ...

bret-based-g-protein-biosensors-for-measuring-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

שיטות פשוטות לזיהוי הפעלה סלקטיבית של חלבוני G על ידי קולטנים מצומדים לחלבון G נותרו אתגר יוצא דופן באיתות תאים. כאן, חיישנים ביולוגיים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) של Fӧrster פותחו על ידי קשירה זוגית של פפטידי חלבון GPCR ל-G כדי לחקור שינויים קונפורמטיביים בריכוזים מבוקרים בתאים חיים.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ  במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

למדו להשתמש בחיישני BRET למדידת פעילות חלבון G בתאי HEK293 חיים בתגובה לליגנדים של קולטני GPCR. שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של איתות תאי וזיהוי ליגנדים מוטים לפיתוח תרופות.

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים