Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

Jiani Ge; Yunfan Sun; Jingsheng Hua; Yuanhong Huang; Yi Wang; Dandan Tang; Taoyun Wang; Jinli Li; Yanfeng Deng; Song-Bai Liu

doi:10.3791/68469

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

Full Text

838 Views

04:36 min

October 17, 2025

DOI: 10.3791/68469-v

Jiani Ge*^1,2, Yunfan Sun*³, Jingsheng Hua*⁴, Yuanhong Huang⁵, Yi Wang², Dandan Tang¹, Taoyun Wang¹, Jinli Li⁶, Yanfeng Deng⁷, Song-Bai Liu^1,2

¹Department of Chemistry and Life Sciences,Suzhou University of Science and Technology, ²Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology,Suzhou Vocational Health College, ³Department of Hematology,The Second Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine,Taizhou University, ⁵National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology,The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁶Department of Radiation Oncology,The Affiliated Hospital of Soochow University, ⁷Department of Medical Ultrasound,Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study employs the comet assay to evaluate the genotoxic effects of type I and type II FLT3 inhibitors on FLT3 mutant 32D cells, highlighting significant DNA damage caused by AC220 compared to Gilteritinib. The findings contribute critical insights toward optimizing therapeutic strategies in acute myeloid leukemia (AML).

Key Study Components

Research Area

Genotoxicity evaluation in cancer
Therapeutic resistance in AML
Combination therapy strategies

Background

The importance of targeting FLT3 mutations in AML
Mechanisms of resistance against existing therapies
Role of DNA damage in cancer treatment efficacy

Methods Used

Comet assay for quantifying DNA damage
FLT3 mutant 32D cells as the biological model
Usage of type I and type II FLT3 inhibitors

Main Results

AC220 induces more significant DNA damage compared to Gilteritinib
Quantitative data shows increased tail DNA percentage post-treatment
Statistically significant damage noted across all time points measured

Conclusions

This research demonstrates differential genotoxic effects of FLT3 inhibitors on mutant cells
Findings support the development of targeted combination therapies to combat AML therapeutic resistance

Frequently Asked Questions

What is the comet assay used for in this study?

The comet assay is utilized to quantify DNA damage induced by FLT3 inhibitors in mutant cells.

What are FLT3 inhibitors?

FLT3 inhibitors are targeted therapies designed to treat FLT3-mutant acute myeloid leukemia (AML).

Why is DNA damage important in cancer therapies?

DNA damage can determine the efficacy of cancer treatments by affecting the cell's ability to replicate and repair.

What were the main findings regarding AC220?

AC220 was found to cause more severe DNA damage in FLT3 mutant cells compared to Gilteritinib.

How does this study inform future cancer treatments?

The findings suggest potential for developing combination therapies that exploit DNA damage vulnerabilities in resistant cancer cells.

What model system was used in this research?

The study used FLT3 mutant 32D cells as the model system for testing genotoxic effects.

What is the significance of the observed DNA damage?

The severity of DNA damage can indicate therapeutic effectiveness and inform treatment decisions in AML.

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לכימות ההבדל בנזק ל-DNA הנגרם על ידי מעכבים מסוג I וסוג II בתאים מוטנטיים מסוג FLT3 באמצעות יישום מבחן השביט.

אנו משתמשים בבדיקת השביט כדי להעריך באופן שיטתי את הגנוטוקסיות של מעכבי FLT3 מסוג I וסוג II על תאים מוטנטיים 32D FLT3, ומספקים נתונים קריטיים לאופטימיזציה קלינית ב-AML. במהלך ההליכים, כלי מיקרו-כירורגי לטיפול לא נכון ישנה את השקופית, וכתוצאה מכך אובדן דגימה. מחקרים מצביעים על כך ש-AC220 כמעכב מסוג II גורם נזק חמור יותר ל-DNA לתאים מוטנטיים של FLT3, ומספק תובנות חיוניות לפיתוח טיפולים משולבים על ידי ניצול פגיעות נזק ל-DNA כדי להתגבר על עמידות טיפולית.

לחקור את מנגנון הפעולה של מעכבי FLT3 בטיפול ב-AML, ולפתח אסטרטגיות טיפול משולבות של תרופות כפולות או מרובות תרופות המבוססות על מעכבי FLT3. כדי להתחיל, הכינו תערובת של 10 לאחד של נקודת התכה נמוכה ותרחיף תאים בצינורות של 1.5 מיליליטר בעזרת פיפטה, וערבבו בעדינות. חלקו 55 מיקרוליטר של תערובת תאי האגרוז על שקופיות שביט באמצעות פיפטה המוחזקת בזווית של 45 מעלות.

לאחר מכן, הניחו את השקופיות המצופות בתערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בסביבה חשוכה. טבלו את המגלשות המוצקות בתמיסת ליזה מקוררת מראש ודגרו למשך שעה לפחות בארבע מעלות צלזיוס, והגנו על המגלשות מפני אור. לאחר הליזה, הסר את השקופיות מתמיסת הליזיס.

בעזרת אקדח פיפטה, שאבו בזהירות כמה שיותר נוזלים שאריות מסביב למשוט. לאחר מכן, הניחו את המגלשות במאגר אלקטרופורזה אלקליין ואפשרו להן להתאזן מראש למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס בחושך. כעת, הנח את השקופיות לתוך תא האלקטרופורזה.

כדי לטבול את המגלשות במלואן, הוסף מספיק תמיסת אלקטרופורזה אלקליין מקוררת מראש. הפעל אלקטרופורזה ב-24 וולט עם זרם קבוע למשך 30 דקות באמצעות מאגר מאוזן מראש כדי להפחית את נזק ה-DNA. לאחר אלקטרופורזה, השתמש באקדח פיפטה כדי לשאוב את מאגר האלקטרופורזה האלקליין מסביב למגלשה.

טבלו את המגלשות במים מזוקקים כפולים למשך חמש דקות, ולאחר מכן טבלו את המגלשות ב-70% אתנול למשך חמש דקות. מניחים את השקופיות באינקובטור המוגדר על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לייבוש. לאחר מכן, יש למרוח כמות של 100 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין YeaRed על כל באר בשקופית.

דגרו את המגלשות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס בסביבה מוגנת מאור. שוטפים את השקופיות בעדינות במים כדי להסיר עודפי כתמים ומייבשים אותם באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. בדיקת השביט שימשה באופן שיטתי כדי לכמת פרופילי נזק דיפרנציאלי ל-DNA הנגרמים על ידי גילטריטיניב ו-AC220 בשורות תאים מוטנטיים FLT3.

ניתוח כמותי של אחוז ה-DNA בזנב אישר ששתי התרכובות מגבירות משמעותית את נזק ה-DNA לאחר שעתיים, ארבע ושש שעות, כאשר AC220 מייצר רמות נזק גבוהות יותר מאשר גילטריטיניב בכל נקודת זמן. כל מדידות הזנב המומנט שיקפו את מגמת ה-DNA של הזנב עם עליות מובהקות סטטיסטית עבור שני הטיפולים משעתיים עד שש שעות וערכי OTM גבוהים יותר שנצפו בקבוצת AC220 לאורך כל הדרך.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos