Name: בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: חקור את השפעותיהם הגנוטוקסיות של מעכבי FLT3 מסוג I ו-II בתאי 32D מוטנטיים באמצעות בדיקת שביט. המחקר מדגים נזק DNA משמעותי יותר ב-AC220 לעומת Gilteritinib לטיפול ב-AML.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. בניית מודל נזק ל-DNA בתאי 32D עם מוטציות FLT3-ITD 18
<ol>
	<li>התאוששות תאים<ol>
		<li>באמצעות מלקחיים, העבירו במהירות תאי FLT3-ITD מוטנטיים 32D שמורים בהקפאה (מאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס). אחזר קריוביאלים באמצעות מלקחיים וטבול אותם מיד באמבט מים מווסת טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס) למשך 60 שניות בדיוק להשלמת הפשרה מבוקרת. הערה: במהלך ההפשרה, יש לנער לסירוגין את הקריוביאלים באמבט המים כדי להבטיח חימום אחיד.</li>
		<li>צנטריפוגה את הדגימות השמורות בהקפאה ב-150 × גרם למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס ±-1 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטות סרולוגיות סטריליות תוך שמירה על הכדור הסלולרי.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של מצע גידול מלא (RPMI 1640 + 10% סרום בקר עוברי + 1% פניצילין/סטרפטומיצין) לצינור השימור בהקפאה. בצע טריטורציה עדינה באמצעות 10 מחזורי פיפטינג עוקבים (נפח 1 מ"ל) כדי להבטיח השעיה מלאה. העבירו את תרחיף התאים לתבנית תרבית תאים של 100 מ"מ והוסיפו 7 מ"ל של מדיום שלם כדי להשיג נפח סופי של 8 מ"ל.</li>
		<li>ערבבו בעדינות את כלי התרבות עם חמש תנועות אופקיות וחמש תנועות סיבוביות. שמור על תאים בחממה לחה בטמפרטורה של 37.0 מעלות צלזיוס ± 0.2 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ו-95% לחות. דגירה למשך 24 שעות לפני העיבוד הניסיוני.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הערכת כדאיות תאים<ol>
		<li>בחר תאים תלת-ממדיים מוטנטיים FLT3-ITD בשלב הצמיחה הלוגריתמית עם מצב תאי טוב לניסוי. הערה: לתאים בשלב הצמיחה הלוגריתמית יש בדרך כלל מחזור חלוקה קצר ותדירות גבוהה של חלוקת תאים.<ol>
			<li>התבונן במורפולוגיה ובמצב הצמיחה של תאים תלת-ממדיים שעברו מוטציה ב-FLT3-ITD באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. ודא שהקריטריונים לסף התפשטות התאים מתקיימים: חפש תאי che שהם בצורת כדורית בודדת עם קצוות חלקים, פיזור אחיד, מעט אגרגטים, גודל תא אחיד, שלמות קרום פלזמה שלמה ופסולת סלולרית &lt; 5%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>השתמש במונה תאים כדי לקבוע את ריכוז תרחיף התאים. הערה: מערבבים את מתלי התאים (10 מחזורי פיפטינג עוקבים באמצעות קצות סטריליים של 1 מ"ל במהירות פיפטה מקסימלית של 50%).</li>
		<li>תקנן את תרחיף התאים ל-2.0 ×-105 תאים/מ"ל במצע גידול מלא באמצעות דילול איטרטיבי. בעזרת פיפטה, הזרימו 50 מיקרוליטר לבארות המרכזיות (B2-G7) של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. מלאו את הבארות ההיקפיות (A1-H12) ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי כדי לשמור על לחות ולמזער את השפעות אידוי הקצוות.</li>
		<li>הכנת מדיום המכיל מעכב FLT3: בחר תשע בארות בצלחת תרבית תאים של 12 בארות וסמן אותן לפי סולם ריכוז מעכבי FLT3 (0, 3.90625, 7.8125, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 ו-1000 ננומטר). הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום שלם לבארות המסומנות 10.0 מיקרומטר ו-200 מיקרוליטר של מדיום שלם לבארות הנותרות.<ol>
			<li>דילול גילטריטיניב: הוסף 4 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר מגיב גילטריטיניב (גילטריטיניב בדימתיל סולפוקסיד) לכל אחת מהבארות המסומנות 1000 ננומטר באמצעות אקדח פיפטה וערבב היטב את התמיסה. פיפטה 200 מיקרוליטר של 1000 ננומטר גילטריטיניב לתוך הבארות המסומנות 500 ננומטר ומערבבים; ואז פיפטה 200 מיקרוליטר של 500 ננומטר גילטריטיניב לבארות המסומנות 250 ננומטר ומערבבים. בכל פעם, קחו 200 מיקרוליטר מהדילול הקודם לבאר הבאה וערבבו כדי להשיג את הריכוז הרצוי.</li>
			<li>דילול AC220: הוסף 4 מיקרוליטר של מגיב AC100 מיקרומטר AC220 (AC220 בדימתיל סולפוקסיד) לכל אחת מהבארות המסומנות 1000 ננומטר באמצעות אקדח פיפטה. בצע את שלב 1.2.4.1 עבור הבארות האחרות. הערה: ודא שתמיסת מלאי מעכבי FLT3 בפיפטה מועברת לחלוטין לבארות כדי למנוע שאריות תמיסה. ודא שהתמיסה מעורבבת היטב לפני שתמשיך בדילול.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>דגירה: הוצא מדיה המכילה מעכב FLT3 לבארות ייעודיות (50 מיקרוליטר לבאר) באמצעות פיפטה. שמור על צלחת 96 בארות בתנאי תרבית פיזיולוגיים (37.0 מעלות צלזיוס ± 0.2 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות) למשך 72 שעות ± 15 דקות בדיוק.</li>
		<li>יש להקצות 10 מיקרוליטר של מגיב CCK-8 לכל בארות הבקרה הניסיוניות והריקות באמצעות פיפטה. הגן על הצלחת מפני אור ודגר אותה בתנאים נורמוקסיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 2.0 שעות ± 10 דקות. הערה: הוצא את המגיב במהירות פיפטה נמוכה עם עומק טבילה של קצה 2 מ"מ כדי למזער את היווצרות הבועה. הימנע מבועות אוויר במהלך הוספת דגימה כדי למנוע הפרעה לקריאות OD.</li>
		<li>הסר את צלחת 96 הבארות מהחממה ומדוד את הספיגה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. רשום את התוצאות.</li>
		<li>חשב את אחוז העיכוב לפי נוסחת החישוב IC50 : עיכוב (%) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq1.jpg" style="margin: auto;"> × 100% באר הניסוי של התרופה מציינת בארות תאים שטופלו בתרופה. באר בקרת תאים מציינת בארות תאים שלא טופלו בתרופה. בארות בקרה ריקות מצביעות על מדיום בלבד ללא תאים.</li>
		<li>לנתח את נתוני התגובה למינון המנורמל באמצעות רגרסיה לא ליניארית, תוך שימוש במודל לוגיסטי של ארבעה פרמטרים. לחצו על הלחצן 'התאמת עקומה' להתאמת עקומה. גזור את ריכוז העיכוב החצי-מקסימלי (IC50) מהתכנסות המודל (R2 &gt; 0.98, סכום שיורי של ריבועים &lt; 0.15) וחשב את מרווחי הסמך של 95% באמצעות דגימה מחדש של 1000 איטרציות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ניסוי נזק ל-DNA של תאים תלת-ממדיים עם מוטציה ב-FLT3-ITD הנגרמת על ידי מעכב FLT3<ol>
		<li>בחר תאים 32D מוטנטיים FLT3-ITD המציגים קפיצת גדילה (זמן הכפלת האוכלוסייה &lt; 24 שעות) להערכת נזק ל-DNA.</li>
		<li>ספור את התאים (ראה שלב 1.2.2 לפרטים).</li>
		<li>זריעת תאים: התאם את צפיפות תרחיף התאים ל -1 × 106 תאים למנה, באמצעות צלחת בקוטר 6 ס"מ ו -4 מ"ל תרחיף תאים למנה.</li>
		<li>הכן שלושה שכפולים לכל ריכוז מעכב: 55 ננומטר גילטריטיניב: 4 מ"ל בינוני + 2.2 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר, 0.15 ננומטר AC220: 4 מ"ל בינוני + 6 מיקרוליטר של 100 ננומטר. מערבבים את התמיסות ומאזנים אותן ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות; יש לנער בעדינות את הצינורות כדי להבטיח ערבוב נאות. שאפו את המדיום המקורי והחליפו אותו ב-4 מ"ל לצלחת של מדיום טרי המכיל מעכב באמצעות פיפטות סרולוגיות סטריליות.</li>
		<li>דגירה על התאים המטופלים בתנאים פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות) למרווחים מוגדרים (0, 2, 4, 6 שעות). עבד בקרות זמן אפס באופן מיידי להערכת נזק ל-DNA בסיסי.</li>
		<li>בדיקת אי הכללה של Trypan blue<ol>
			<li>צנטריפוגה את התאים שנאספו ב -150 × גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים עם 1 מ"ל של מדיום תרבית.</li>
			<li>פיפטה 100 מיקרוליטר של תאים תלויים לתוך צינור צנטריפוגה מפלסטיק, מוסיפים 100 מיקרוליטר כתם כחול טריפן (2x), מערבבים בעדינות ומכתימים למשך 3 דקות.</li>
			<li>ספור את התאים (ראה שלב 1.2.2 לפרטים).</li>
			<li>חשב את כדאיות התא באופן הבא: % הישרדות תאים = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq2.jpg" style="margin: auto;"> × 100% הערה: רק דגימות עם כדאיות ≥90% עובדו לבדיקת השביט.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. הכנת ריאגנטים והכנת דגימת תאים
<ol>
	<li>אזנו את תמיסת הליזיס (המכילה 2.5 M NaCl, 100 מ"מ EDTA, 10 מ"מ טריס, pH 10, 1% טריטון X-100, 10% DMSO) ב-4 מעלות צלזיוס ±-0.5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות מקרר.</li>
	<li>ממיסים אגרוז נמס נמוך (LMA) ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן שומרים אותו באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות.</li>
	<li>הכן את מאגר האלקטרופורזה האלקליין (300 מ"מ NaOH, 1 מ"מ EDTA, pH &gt;13) על ידי שקילת 12 גרם NaOH באמצעות איזון אלקטרוני, פיפטה של 2 מ"ל של תמיסת EDTA של 500 מ"מ, ולאחר מכן הוספת ddH2O כדי ליצור עד 1 ליטר של המאגר.</li>
	<li>קצירת תאים<ol>
		<li>אסוף את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה מתלה התא בטמפרטורה של 800 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנטים באמצעות סינון ואקום.<ol>
			<li>השעו בעדינות את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם באמצעות קצות פיפטה רחבים של 1 מ"ל, ואחריהם 10 היפוכים אנכיים.</li>
			<li>ספור את התאים כמו בשלב 1.2.</li>
			<li>צנטריפוגה את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ב-150 × גרם למשך 5 דקות כדי להסיר את המדיום השלם. השעו מחדש את התאים השטופים ב-PBS נטול סידן ל-~5.0 ×-105 תאים/מ"ל.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. נוהל בדיקת שביט
<ol>
	<li>הכן שקופיות בדיקת שביט ודגימות תאים מראש. מכינים תערובת של 10:1 (v/v) של אגרוז LMA ותרחיף תאים (5 × 105 תאים/מ"ל) בצינורות של 1.5 מ"ל בעזרת פיפטה ומערבבים בעדינות. הוצא 55 מיקרוליטר של תערובת תאי האגרוז על מגלשות שביט באמצעות פיפטה המוחזקת בזווית של 45 מעלות, תוך שמירה על מרחק של 2 מ"מ ממשטח המגלשה. מניחים את השקופיות המצופות בתערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למנוע אור. הערה: במהלך הוספת תערובת ה-LMA והתאים לשקופיות בדיקת השביט, הוצא את התרחיף לאט ובאופן שווה כדי למנוע היווצרות בועות ולהבטיח פיזור ג'ל הומוגני.</li>
	<li>טבלו את השקופיות המוצקות בתמיסת ליזה מקוררת מראש (המכילה 2.5 M NaCl, 100 מ"מ EDTA, 10 מ"מ טריס, pH 10, 1% טריטון X-100, 10% DMSO) ובצעו ליזה למשך ≥1 שעות ב-4 מעלות צלזיוס בתנאים מוגנים מאור.</li>
	<li>לאחר הליזיס, הסר את המגלשה מהליזאט והשתמש באקדח פיפטה כדי לשאוב כמה שיותר נוזלים סביב ההנעה. לאחר מכן הנח את המגלשה במאגר אלקטרופורזה אלקליין (300 מ"מ NaOH, 1 מ"מ EDTA, pH &gt;13) ושיווי משקל מראש למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס, תוך הקפדה על הימנעות מאור.</li>
	<li>אלקטרופורזה: מקם את המגלשות בתא אלקטרופורזה והוסף תמיסת אלקטרופורזה אלקליין מספקת כדי לטבול את השקופיות. אלקטרופורזה מוליכה ב-24 וולט (שווה ערך ל-0.74 וולט/ס"מ) עם זרם קבוע (300 mA) למשך 30 דקות באמצעות מאגר מאוזן מראש (4 מעלות צלזיוס) כדי למזער נזק ל-DNA.</li>
	<li>נטרול: לאחר אלקטרופורזה, השתמש באקדח פיפטה כדי לשאוב את תמיסת האלקטרופורזה האלקליין מהשקופית, הטביע את השקופיות למשך 2 x 5 דקות ב-dH2O, ולאחר מכן הטביע אותן באתנול 70% למשך 5 דקות. יבש את השקופיות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>מכתים: יש למרוח כמות של 100 מיקרוליטר של 1x כתם חומצת גרעין YeaRed לכל באר ולדגור למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה בתנאים מוגנים מפני אור. הסר את עודפי הכתמים על ידי שטיפה מימית עדינה ואחריה ייבוש תרמי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הדמיה: בצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה פי 4, עם רכישת תמונה דיגיטלית המתבצעת בתנאי חשיפה סטנדרטיים.</li>
</ol>
4. עיבוד נתונים
<ol>
	<li>בצע ניתוח תמונה כמותי כדי לקבוע פרמטרים סטנדרטיים של שביט, כולל DNA זנב (%), מומנט זנב זית ואורך זנב (מיקרומטר).<ol>
		<li>פתח את ממשק התוכנה (איור 5).</li>
		<li>ייבא/י תמונה לתוכנה, לחץ/י על ״קובץ״ ולאחר מכן לחץ/י על ״בחר קובץ ״ כדי לייבא את התמונה שברצונך לנתח לתוכנה. לאחר מכן, החזק את לחצן העכבר לחוץ וגרור עד להופעת תיבה כחולה. גרור את התיבה הכחולה כדי לוודא שהתא שברצונך לנתח מוקף בתוך התיבה. ניתן להשתמש באפשרות Adjust באיור כדי לכוונן את מיקום המסגרת כך שתכלול את התא כולו (איור 5).</li>
		<li>לפני שתתחיל בניתוח, לחץ על התחל ולאחר מכן לחץ על ניתוח. תוצאות ניתוח התא הבודד יוצגו בצד ימין תחת 'פרופילים'. לאחר ניתוח כל תא, לחץ על שמור. הפרמטרים שניתן לזהות מוצגים בצד ימין של 'פרופילים', והערכים המספריים של פרמטרים שונים מוצגים בתחתית. לבסוף, לחץ על קובץ | ייצוא תוצאות. התוצאות שהתקבלו כוללות את HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment, ו-OliveTailMoment.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swaminathan, M., Wang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+AML%3A+A+round-up+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for AML: A round-up for clinicians.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).</li>
<li>Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+flt3+mutations+in+AML%3A+Review+of+current+knowledge+and+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence.</a> Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+FLT3%2FAXL+inhibitor%2C+shows+antileukemic+activity+in+mouse+models+of+FLT3-mutated+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia.</a> Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).</li>
<li>Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).</li>
<li>Cortes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quizartinib%3A+A+potent+and+selective+FLT3+inhibitor+for+the+treatment+of+patients+with+FLT3-ITD-positive+AML%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML.</a> J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).</li>
<li>Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+precision+medicine+for+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Towards precision medicine for AML.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).</li>
<li>Kantarjian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%3A+Current+progress+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions.</a> Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).</li>
<li>Miyamoto, K., Minami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge+molecular+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia.</a> Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).</li>
<li>Yang, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Precision therapy for acute myeloid leukemia.</a> J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+Principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+to+perform+the+alkaline+standard+and+enzyme-modified+comet+assay+in+human+biomonitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Genet+Toxicol+Environ+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).</li>
<li>Cotelle, S., Férard, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+in+genetic+ecotoxicology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Comet assay in genetic ecotoxicology: A review.</a> Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+Guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+comet+assay+for+assessing+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells.</a> Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).</li>
<li>Liu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flt3-itd+length+on+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+adavosertib+and+fimepinostat+on+acute+myeloid+leukemia+cells+by+enhancing+the+induction+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage.</a> Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).</li>
<li>Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+trioxide+induces+oxidative+stress%2C+DNA+damage%2C+and+mitochondrial+pathway+of+apoptosis+in+human+leukemia+%28hl-60%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells.</a> J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 מ' EDTA</td><td>ביוטיים</td><td>ST066</td><td></td></tr><tr><td>1x כתם חומצת גרעין YeaRed</td><td>יאסן</td><td>10202ES</td><td></td></tr><tr><td>תא 32D</td><td>קובייר</td><td>CBP60995</td><td></td></tr><tr><td>AC220</td><td>טרגטמול</td><td>T2066</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ספירת תאים-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ספירת תאים</td><td>צ'יוג'ינג</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור CO2</td><td>תרמו</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>פרויקט תוכנה לבדיקת שביט (CASP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת שביט&nbsp;</td><td>טרוויגן</td><td>ברקוד 4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>ציטציה 5</td><td>ביוטק</td><td>16280004</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>פאן</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>גילטריטיניב</td><td>טרגטמול</td><td>T4409</td><td></td></tr><tr><td>פריזמה GraphPad 9.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מהירה</td><td>תרמו</td><td>&nbsp; 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ פיפטות</td><td>ריינין</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ פיפטות</td><td>ריינין</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חנקן נוזלי</td><td>מווקריוג'</td><td>י"ד-175-216</td><td></td></tr><tr><td>פוטומטר מיקרו-פלייט Multiskan FC</td><td>תרמו</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>Na2OH</td><td>דמאו</td><td>1588</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סולארביו</td><td>עמ' 1020</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100x</td><td>ביוטיים</td><td>ג0222</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>ג'יבקו</td><td>C22400500BT</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תאים חיים טרינוקולרי</td><td>מוטיק</td><td>1.1001ה+12</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד</td><td>Haire</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת שביט לכימות נזק ל-dna בתאי 32d המבטאים מוטציה flt3 לאחר חשיפה למעכבי flt3 מסוג i ו-ii

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

בדיקת השביט שימשה באופן שיטתי כדי לכמת פרופילי נזק דיפרנציאלי ל-DNA הנגרמים על ידי גילטריטיניב ו-AC220 בשורות תאים מוטנטיות FLT3. ניתוחים הראו כי ההבדל בנזק ל-DNA בין אוכלוסיות תאים שלא טופלו ב-gilteritinib ו-AC220 לא היה מובהק סטטיסטית (P &gt; 0.05). עליות תלויות מינון בערכי ה-DNA של הזנב (%) ו-Olive Moment Tail (OMT) השיגו מובהקות סטטיסטית (P &lt; 0.05) לאחר חשיפות של 2-6 שעות. OMT מייצג את המכפלה של % ה-DNA בזנב ואת 'המרחק בין מרכז הכובד של הקרינה של ראש-זנב'. הבדלים בדנ"א זנב (%) וזנב מומנט זית (OMT) מצביעים על כך ש-...

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a class III receptor tyrosine kinase, exhibits a mutation frequency of approximately 30% in acute myeloid leukemia ...

comet-assay-to-quantify-dna-damage-flt3-mutant-expressing-32d-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

בדיקת השביט היא אמצעי פופולרי לאיתור נזק לדנ"א. מחקר זה מתאר גישה להפעלת שקופיות בגרסאות מייצגות של בדיקת השביט. גישה זו הגדילה משמעותית את מספר הדגימות תוך הפחתת זמן הריצה של הבדיקה, מספר מניפולציות השקופיות והסיכון לפגיעה בג'לים.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל לימפוציטים מסוג T זיכרון. כאן אנו מדגימים כיצד לגרום DTH פעיל חולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

רגולציה T תאים: הפוטנציאל הטיפולי לטיפול דחייה וסוג אני סוכרת

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל זיכרון T (TEM) לימפוציטים. כאן אנו מדגימים כיצד להפעיל את אנטיגן ספציפי לערמונית תאים TEM, לגרום DTH המאמצת בחולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן...

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

חקור את השפעותיהם הגנוטוקסיות של מעכבי FLT3 מסוג I ו-II בתאי 32D מוטנטיים באמצעות בדיקת שביט. המחקר מדגים נזק DNA משמעותי יותר ב-AC220 לעומת Gilteritinib לטיפול ב-AML.

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

גלה סרטונים נוספים