הבנת השינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוגרפים פלואורסצנטיים דינמיים ותלת מימדיים

מטרת המחקר שלנו היא לצפות בשינויים ברשתות המיטוכונדריאליות ולחקור כיצד רשתות מיטוכונדריאליות אלה משתנות בתגובה לתנאים תאיים. אנו משתמשים בכלי קוד פתוח כמו פיג'י ופייתון, המשלבים ספריות קיימות עם פקודות מאקרו וסקריפטים מותאמים אישית כדי להפוך את ניתוח המורפולוגיה המיטוכונדריאלית לאוטומטי מנתוני מיקרוסקופיה פלואורסצנטיים מורכבים. השגת נתונים ומדדים כמותיים אמינים המתארים את הדינמיקה של ביקוע מיטוכונדריאלי והיתוך עם לוקליזציה שלהם בתלת מימד נותרה אתגר.

סטנדרטיזציה ליצירת נתונים כזו אינה זמינה בדרך כלל. לכן, קיים ידע מוגבל על ביקוע ספציפי לתא ותדירות היתוך ולוקליזציה תוך תאית. הוספנו זיהוי חיים של ביקוע והיתוך מיטוכונדריאלי למדדי המחקר הזמינים.

ועל ידי שילוב אלה עם ספירת המבנה המיטוכונדריאלי, הצלחנו להגדיר מדד חדש להבנת הדינמיקה של הרשת המיטוכונדריאלית. הממצאים שלנו מאפשרים לנו לאפיין פרמטרים ספציפיים של ביקוע והיתוך ספציפיים לתא, ולראשונה לקבוע אם המערכת המיטוכונדריאלית נמצאת בשיווי משקל או בשיווי משקל. זה מונע פרשנות שגויה של פנוטיפים בבריאות ומחלות ומספק מסגרת ברורה לדיווח מדויק.

כדי להתחיל, פתח את הקובץ הגולמי ב-ImageJ. התאימו את הגדרות הצבע כדי לשפר את הנראות של אזור העניין, אך אל תגדירו דבר. שכפל את התמונה בהתאם למספר התאים הבודדים שיש לנתח.

אם קיימים תאים מרובים בשדה תצוגה, נווט אל ניתוח, כלים והשתמש בכלי Synchronized Windows ובכלי Freehand Drawing כדי לצייר אזור עניין סביב תא מעניין, ולאחר מכן בחר Edit ובחר Clear Outside כדי לבודד את התא שנבחר. פצלו את הערוצים האדומים והכחולים זה מזה ושמרו את התעלה המיטוכונדריאלית כקובץ tif. כדי ליצור פונקציית פיזור נקודה או PSF, פתח מחדש את התמונה הגולמית.

לאחר מכן פתח את תוסף מחולל PSF על ידי בחירת תוספים, לאחר מכן בחירה במחולל PSF ובחירת המודל האופטי התלת-ממדי של זאב נולד. פתח את פרטי התמונה של התמונה הגולמית על ידי בחירה ב-Image, ולאחר מכן בחירה ב-Show Information או על ידי לחיצה על I במקלדת. גלול לתחתית חלון פרטי התמונה.

בחר באפשרות גודל ועומק הווקסל ושנה את אורך הגל ל-568 ננומטר. הגדר את גודל הפיקסל XY ל- 166.1 ננומטר, צעד Z ל- 200 ננומטר. הגדר את גודל XYZ כך שיתאים לרזולוציית תמונה של 512 x 512, והגדר את ערימת Z כך שתכלול 10 פרוסות Z.

לחץ על הפעל. שמור את ה- PSF כקובץ tif בתיקייה משלו. נווט אל תוספים, בחר פקודות מאקרו ולאחר מכן בחר ערוך, ולאחר מכן Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm כדי לגשת למאקרו דה-קונבולוציה. ערוך את שורות הקלט והפלט כנדרש ולחץ על הפעלה כדי להפעיל את המאקרו. לשיפור וטשטוש ניגודיות תמונה, נווט אל תוספים, בחר פקודות מאקרו, בחר ערוך ופתח את עיבוד מקדים.

IJM כדי לגשת למאקרו העיבוד המקדים. בצע חיסור רקע על ידי הגדרת רדיוס הכדור המתגלגל ל-6. הגדר את Sigma Filter Plus כך שהרדיוס יוגדר פי 1 מגורם קנה המידה.

מספר הפיקסלים בשימוש הוא 2, ושבר הפיקסלים המינימלי הוא 0.2, מה שמבטיח שהתוסף מוגדר להיות חריג יותר. כוונן את הגדרות CLAHE על-ידי קביעת התצורה של גודל הבלוק ל- 64, סלי ההיסטוגרמה ל- 256, השיפוע המרבי ל- 2.5 והגמא ל- 0.8 ולאחר מכן לחץ על הפעל. פתח קובץ מעניין שהשתנה באמצעות התהליך המקדים.

ijm פקודות מאקרו ב-ImageJ. נווט אל תוספים ובחר סף אדפטיבי. הגדר את הסף המקומי לממוצע משוקלל והתאם את גודל בלוק הפיקסלים לפי הצורך.

לחץ על תצוגה מקדימה והתאם את גודל הבלוק כך שיכלול בבירור כמה שיותר מיטוכונדריה. שנה את ערך החיסור עבור כל תא כדי לבטל את הרקע המיותר, ושים לב למיקרוגרף המתקבל. למיטוב הזמן, מיין תמונות לקבצים בהתאם לערך החיסור שהוחל.

כעת נווט אל תוספים, בחר פקודות מאקרו, בחר ערוך ופתח את סף. ijm כדי לגשת למאקרו הסף. ערוך את סקריפט המאקרו כדי להגדיר את נתיבי הקלט והפלט הנכונים, גודל הבלוק ולהחסיר ערכים.

לחץ על הפעל כדי להפעיל את המאקרו. פתח עד 10 מיקרוגרפים ספופים השייכים לאותו מצב טיפול. נווט אל תמונה, ערימות, כלים ובחר שרשור ולאחר מכן לחץ על OK.To הסר שאריות פונקטה קטנות שנותרו מאחור על ידי סף, עבור אל תוספים, ולאחר מכן מסנני תמונה אינטגרליים ולאחר מכן בחר הסר חריגים.

השתמש בתצוגה מקדימה כדי לכוונן את גדלי X ו- Y כדי להסיר מקטעים. שמור את הקובץ המשורשר כקובץ TIF. לבסוף, נווט אל תוספים, פקודות מאקרו, עריכה QuickTest_new.ijm.

ערוך את שורות נתיב הקלט והפלט כדי להצביע על הספריות המתאימות, לחץ על הפעל והצג באופן חזותי את לוקליזטור האירועים המיטוכונדריאלי או תוצאות MEL. הדינמיקה המיטוכונדריאלית נבדקה לאורך זמן כאשר פונקטה אדומה מסמנת אירועי ביקוע ופונקטה ירוקה מסמנת אירועי היתוך בתצוגות תלת מימד ודו-ממדיות כאחד. רשתות מיטוכונדריאליות הראו הבדלים ספציפיים לטיפול במבנה לאורך זמן עם צורות מוארכות ומחוברות יותר בתאים שטופלו במטפורמין ורשתות מקוטעות מאוד בתאים שטופלו במטפורמין CCCP Baf.

קבוצת המטפורמין CCCP Baf הראתה פעילות ביקוע ואיחוי גבוהה משמעותית מאשר קבוצת הביקורת או המטפורמין בלבד, מה שמרמז על עיצוב מחדש מיטוכונדריאלי מוגבר. לקבוצה זו הייתה גם ספירת מיטוכונדריה גבוהה משמעותית, העולה בקנה אחד עם פיצול מוגבר. נפח המיטוכונדריה ירד משמעותית באותה קבוצה, מה שתמך עוד יותר במעבר לביקוע.

עם זאת, כאשר מנורמל למספר המיטוכונדריאלי, קבוצת המטפורמין בלבד הפגינה את הפעילות הדינמית היחסית הגבוהה ביותר, מה שמצביע על כך שמטפורמין לבדו מקדם רשת שיפוץ פעילה ויעילה יותר, בעוד שטיפול משותף מניע תחלופה מבנית נרחבת אך פחות יעילה.