הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה

אנו שואפים לבסס שיטות הדמיה בזמן אמת ללא תוויות בעת ניטור שינויים ביופיזיקליים באורגנואידים חיים במהלך הפיתוח ובתגובה לתרופות. פרוטוקול זה מאפשר קנה מידה יעיל של הדמיה ובדיקות תרופות לא פולשניות באורגנואידים חיים הנתמכים על ידי מוטציה מונעת בינה מלאכותית ובחירת מרקם כמותי למחקר ביו-רפואי. אנו מתכננים לשלב עוד יותר הדמיה תלת מימדית ללא תוויות וניתוח שנתי למחקרי אורגנואידים ברזולוציה גבוהה ולא פולשניים במודלים של מחלות ורפואה מדויקת.

כדי להתחיל, שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת של 48 בארות המכילה את המטריצה החוץ-תאית. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת התאוששות תאים לכל באר ודגר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעזרת פיפטה, אספו בעדינות את תרחיף האורגנואיד והעבירו אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה.

צנטריפוגה את הצינור ב -150 גרם למשך שלוש דקות, ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט. כדי לנתק את הגלולה מכנית, הושעו מחדש ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית ופיפטה את המתלה למעלה ולמטה 20 עד 30 פעמים באמצעות פיפטה P200 לפני צנטריפוגה למשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, הוסף מטריצה חוץ-תאית בינונית וטרייה, או ECM, ביחס של אחד לארבעה לגלולה ופיפטה בעדינות כדי לערבב היטב.

מחלקים 15 מיקרוליטר מהתערובת לכל כיפה לכל באר של צלחת של 48 בארות. הנח את הצלחת הפוכה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שעה כדי לאפשר פילמור של ה-ECM. לאחר פילמור, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר, ומלאו את הבארות החיצוניות הריקות ב- PBS.

כדי להכין את הדגימה להדמיה, הוציאו 15 מיקרוליטר של כיפת ECM אורגנואידית על צלחת הדמיה תחתונה מספר 1.5 ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הניחו את הצלחת הפוכה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, הוסף בעדינות מספיק מדיום תרבית כדי לטבול את האורגנואידים במלואם.

חמישה ימים לאחר המעבר, שטפו את הדגימה פעמיים עד שלוש עם PBS מיד לפני ההדמיה. לאחר מכן, לצורך הדמיה, הפעל את הבקר הסביבתי. יחידת בקר החדר תגדיר אוטומטית את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת הפחמן הדו-חמצני ל-5%לחץ על כפתור הדלת כדי לפתוח את הדלת.

הוסף מים ליצירת שכבה דקה בתוך החדר. הנח את צלחת ההדמיה במחזיק הכלי, הכנס אותה לתא ההדמיה ואבטח אותה באמצעות סיכה כדי למנוע תנועה. סגור את הדלת כדי למנוע הפרעות אור חיצוניות.

כעת, הפעל את תוכנת TomoStudio X והיכנס. לחץ על התחל כדי לפתוח את החלון הראשי ולאחר מכן לחץ על הוסף פרויקט בפינה הימנית העליונה והקצה את הניסוי. ודא שנבחר סוג המדיום הנכון לשימוש מתאים במקדם השבירה.

לחץ על הבאר הרצויה בחלונית ולאחר מכן לחץ על צור בחלק העליון כדי לרשום את הבאר כדגימה. לאחר מכן, לחץ על הגדרת החזר ROI בפינה השמאלית העליונה כדי להגדיר את אזור העניין במנה. לאחר ההגדרה, לחץ על הפעל ניסוי בפינה השמאלית התחתונה כדי לפתוח את החלון רכישת תמונות.

לחצו על Load Vessel בפינה כדי להציג תמונת שדה בהיר. התאם את מיקום Z באמצעות לחצני Z ו-Z כדי להביא את התמונה למיקוד. בכרטיסייה הדמיה בודדת, התאם את גודל ההחזר על ההשקעה.

לכוד אורגנואידים בשדה ראייה של 160 מיקרומטר על 160 מיקרומטר ורכוש ערימות בעומק של עד 140 מיקרומטר. נווט אל הכרטיסייה Time Lapse Imaging כדי להגדיר הדמיה לטווח ארוך ולהגדיר את משך הזמן וזמן המרווח הרצויים. לחץ על סריקה סמל כדי ללכוד את מיקום ההחזר הנוכחי על ההשקעה.

לחץ על כפתור BF כדי להתאים את ערכי העוצמה והחשיפה להדמיית שדה בהיר. הזז את תיבת ה-ROI בחלונית Preview כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה. לאחר בחירת ההחזר על ההשקעה הרצוי, לחץ על הוסף נקודה בתחתית, תיווצר רשימת נקודות ההדמיה.

כעת, לחץ על רכוש כדי להתחיל בהדמיה ולרכוש את נתוני התמונה הגולמיים. הפעל את שרת העיבוד של HTX על ידי לחיצה על שולחן העבודה סמל. גרור ושחרר קבצי תמונה גולמיים לשרת העיבוד של HTX.

נקישה תהליך כדי ליצור קובץ TCF מקובץ התמונה הגולמית. הפעל את TomoAnalysis Viewer על ידי לחיצה על סמל שולחן העבודה. טען את קבצי ה-TCF המעובדים על ידי גרירה ושחרור שלהם לחלון המציג.

לחץ פעמיים על תמונה ממוזערת של קובץ כדי לפתוח את הטומוגרמה של החזר ההשקעה. בחנו את התצוגה הדו-ממדית באמצעות ניווט במישורי X, Y, Z באמצעות פקדי זום, תנועה פנורמית וגלילה. לחצו על סמל תצוגת רינדור MIP משמאל כדי לעבור למצב רינדור תלת-ממד.

ניווט בתצוגה התלת-ממדית על-ידי סיבוב, שינוי גודל תצוגה וגלילה של התמונה. עבור פילוח תמונות מבוסס למידת מכונה, ייצא את קובץ התמונה TCF לפורמט HDF5 כדי להבטיח שהנתונים יהיו בפורמט רב מימדי, תואם ל-ilastik. פתח את ilastik ונווט אל פרויקט חדש.

בחר סיווג פיקסלים במקטע זרימת עבודה של פילוח ושמור את הפרויקט בתיקיה ייעודית. כדי לטעון את קובץ HGF5, נווט לכרטיסייה Input Data, לחץ על Add New File, בחר את ערכת הנתונים המתאימה של H5 וודא את הקצאות ערוצי התמונה הנכונות. כעת, נווט אל בחירת תכונה הכרטיסייה כדי לבחור תכונות כמו צבע, עוצמה, קצה ומרקם כדי לייעל את הפילוח.

בכרטיסייה Training, סמנו את האזורים האורגנואידים והאזורים שאינם אורגנואידים באמצעות משיכות מברשת בצבעים שונים. לחץ על Live Update כדי להציג תצוגה מקדימה של תוצאות הפילוח ולבצע התאמות, במידת הצורך. לאחר שתסיים, עבור לכרטיסייה ייצוא חיזוי.

בחר Simple Segmentation כמקור לייצוא תחזיות עם תוויות ולחץ על Export All. הגדר את פורמט הייצוא ל-H5 או TIFF בהתבסס על דרישות הניתוח. לניתוח הכמותי, פתח את קובץ הקידוד המשלים 2.

הקצה את נתיבי התיקיה המתאימים עבור קובץ המסיכה וקובץ ה- TCF המתאים בתוך קובץ ה- Script. הפעל את הקוד כדי להתחיל ניתוח כמותני. הקוד יחשב את נפח האורגנואיד, צפיפות החלבון ותכולת החלבון הכוללת עבור כל מערך נתונים.

איור זה ממחיש את שחזורי מקדם השבירה התלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה המשמשים להמחשת המורפולוגיה הכוללת של אורגנואידים במעי הדק. השחזורים המעובדים חושפים הבדלים מבניים מובהקים בין אורגנואידים שטופלו ברכב לבין אורגנואידים שטופלו בציספלטין בכל שלושת עומק החתכים האופטיים. אורגנואידים שטופלו בציספלטין הראו נפח גבוה משמעותית, צפיפות חלבון נמוכה יותר ותכולת חלבון כוללת גבוהה יותר, בהשוואה לאורגנואידים שטופלו ברכב 10 דקות לאחר הטיפול, מה שמעיד על נפיחות מבנית מוקדמת ושינוי בהרכב החלבון.

הדמיית זמן-lapse במשך 24 שעות הראתה כי אורגנואידים שטופלו ברכב שמרו על שלמות מבנית, בעוד שאורגנואידים שטופלו בציספלטין חוו התדרדרות מבנית מתקדמת, כולל קריסת קריפטה ודיסוציאציה מוגברת של תאים, מה שמרמז על נזק ציטוטוקסי תלוי זמן. מעקב כמותי אישר כי אורגנואידים שטופלו ברכב גדלו בנפח ובתכולת החלבון לאורך זמן, בעוד שאורגנואידים שטופלו בציספלטין הראו ירידה תלוית זמן בשני הפרמטרים, מה שמצביע על כך שציספלטין דיכא את הצמיחה וגרם לפירוק תאי. צפיפות החלבון נותרה יציבה באורגנואידים שטופלו ברכב, אך ירדה בהדרגה באורגנואידים שטופלו בציספלטין במהלך תקופה של 24 שעות, מה שמרמז על התמוטטות במבנה התא והגדלת המרחב החוץ-תאי עקב פילינג.