הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה
August 12th, 2025
אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיה ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות ותלת מימד של אורגנואידים באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה. פרוטוקול זה מפרט הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח תמונה חישובי, המאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות תרופות באורגנואידים חיים.
אנו שואפים לבסס שיטות הדמיה בזמן אמת ללא תוויות בעת ניטור שינויים ביופיזיקליים באורגנואידים חיים במהלך הפיתוח ובתגובה לתרופות. פרוטוקול זה מאפשר קנה מידה יעיל של הדמיה ובדיקות תרופות לא פולשניות באורגנואידים חיים הנתמכים על ידי מוטציה מונעת בינה מלאכותית ובחירת מרקם כמותי למחקר ביו-רפואי. אנו מתכננים לשלב עוד יותר הדמיה תלת מימדית ללא תוויות וניתוח שנתי למחקרי אורגנואידים ברזולוציה גבוהה ולא פולשניים במודלים של מחלות ורפואה מדויקת.
כדי להתחיל, שאפו את המדיום המושקע מכל באר של צלחת של 48 בארות המכילה את המטריצה החוץ-תאית. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת התאוששות תאים לכל באר ודגר בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעזרת פיפטה, אספו בעדינות את תרחיף האורגנואיד והעבירו אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה.
צנטריפוגה את הצינור ב -150 גרם למשך שלוש דקות, ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט. כדי לנתק את הגלולה מכנית, הושעו מחדש ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית ופיפטה את המתלה למעלה ולמטה 20 עד 30 פעמים באמצעות פיפטה P200 לפני צנטריפוגה למשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, הוסף מטריצה חוץ-תאית בינונית וטרייה, או ECM, ביחס של אחד לארבעה לגלולה ופיפטה בעדינות כדי לערבב היטב.
מחלקים 15 מיקרוליטר מהתערובת לכל כיפה לכל באר של צלחת של 48 בארות. הנח את הצלחת הפוכה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שעה כדי לאפשר פילמור של ה-ECM. לאחר פילמור, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר, ומלאו את הבארות החיצוניות הריקות ב- PBS.
כדי להכין את הדגימה להדמיה, הוציאו 15 מיקרוליטר של כיפת ECM אורגנואידית על צלחת הדמיה תחתונה מספר 1.5 ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. הניחו את הצלחת הפוכה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, הוסף בעדינות מספיק מדיום תרבית כדי לטבול את האורגנואידים במלואם.
חמישה ימים לאחר המעבר, שטפו את הדגימה פעמיים עד שלוש עם PBS מיד לפני ההדמיה. לאחר מכן, לצורך הדמיה, הפעל את הבקר הסביבתי. יחידת בקר החדר תגדיר אוטומטית את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת הפחמן הדו-חמצני ל-5%לחץ על כפתור הדלת כדי לפתוח את הדלת.
הוסף מים ליצירת שכבה דקה בתוך החדר. הנח את צלחת ההדמיה במחזיק הכלי, הכנס אותה לתא ההדמיה ואבטח אותה באמצעות סיכה כדי למנוע תנועה. סגור את הדלת כדי למנוע הפרעות אור חיצוניות.
כעת, הפעל את תוכנת TomoStudio X והיכנס. לחץ על התחל כדי לפתוח את החלון הראשי ולאחר מכן לחץ על הוסף פרויקט בפינה הימנית העליונה והקצה את הניסוי. ודא שנבחר סוג המדיום הנכון לשימוש מתאים במקדם השבירה.
לחץ על הבאר הרצויה בחלונית ולאחר מכן לחץ על צור בחלק העליון כדי לרשום את הבאר כדגימה. לאחר מכן, לחץ על הגדרת החזר ROI בפינה השמאלית העליונה כדי להגדיר את אזור העניין במנה. לאחר ההגדרה, לחץ על הפעל ניסוי בפינה השמאלית התחתונה כדי לפתוח את החלון רכישת תמונות.
לחצו על Load Vessel בפינה כדי להציג תמונת שדה בהיר. התאם את מיקום Z באמצעות לחצני Z ו-Z כדי להביא את התמונה למיקוד. בכרטיסייה הדמיה בודדת, התאם את גודל ההחזר על ההשקעה.
לכוד אורגנואידים בשדה ראייה של 160 מיקרומטר על 160 מיקרומטר ורכוש ערימות בעומק של עד 140 מיקרומטר. נווט אל הכרטיסייה Time Lapse Imaging כדי להגדיר הדמיה לטווח ארוך ולהגדיר את משך הזמן וזמן המרווח הרצויים. לחץ על סריקה סמל כדי ללכוד את מיקום ההחזר הנוכחי על ההשקעה.
לחץ על כפתור BF כדי להתאים את ערכי העוצמה והחשיפה להדמיית שדה בהיר. הזז את תיבת ה-ROI בחלונית Preview כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה. לאחר בחירת ההחזר על ההשקעה הרצוי, לחץ על הוסף נקודה בתחתית, תיווצר רשימת נקודות ההדמיה.
כעת, לחץ על רכוש כדי להתחיל בהדמיה ולרכוש את נתוני התמונה הגולמיים. הפעל את שרת העיבוד של HTX על ידי לחיצה על שולחן העבודה סמל. גרור ושחרר קבצי תמונה גולמיים לשרת העיבוד של HTX.
נקישה תהליך כדי ליצור קובץ TCF מקובץ התמונה הגולמית. הפעל את TomoAnalysis Viewer על ידי לחיצה על סמל שולחן העבודה. טען את קבצי ה-TCF המעובדים על ידי גרירה ושחרור שלהם לחלון המציג.
לחץ פעמיים על תמונה ממוזערת של קובץ כדי לפתוח את הטומוגרמה של החזר ההשקעה. בחנו את התצוגה הדו-ממדית באמצעות ניווט במישורי X, Y, Z באמצעות פקדי זום, תנועה פנורמית וגלילה. לחצו על סמל תצוגת רינדור MIP משמאל כדי לעבור למצב רינדור תלת-ממד.
ניווט בתצוגה התלת-ממדית על-ידי סיבוב, שינוי גודל תצוגה וגלילה של התמונה. עבור פילוח תמונות מבוסס למידת מכונה, ייצא את קובץ התמונה TCF לפורמט HDF5 כדי להבטיח שהנתונים יהיו בפורמט רב מימדי, תואם ל-ilastik. פתח את ilastik ונווט אל פרויקט חדש.
בחר סיווג פיקסלים במקטע זרימת עבודה של פילוח ושמור את הפרויקט בתיקיה ייעודית. כדי לטעון את קובץ HGF5, נווט לכרטיסייה Input Data, לחץ על Add New File, בחר את ערכת הנתונים המתאימה של H5 וודא את הקצאות ערוצי התמונה הנכונות. כעת, נווט אל בחירת תכונה הכרטיסייה כדי לבחור תכונות כמו צבע, עוצמה, קצה ומרקם כדי לייעל את הפילוח.
בכרטיסייה Training, סמנו את האזורים האורגנואידים והאזורים שאינם אורגנואידים באמצעות משיכות מברשת בצבעים שונים. לחץ על Live Update כדי להציג תצוגה מקדימה של תוצאות הפילוח ולבצע התאמות, במידת הצורך. לאחר שתסיים, עבור לכרטיסייה ייצוא חיזוי.
בחר Simple Segmentation כמקור לייצוא תחזיות עם תוויות ולחץ על Export All. הגדר את פורמט הייצוא ל-H5 או TIFF בהתבסס על דרישות הניתוח. לניתוח הכמותי, פתח את קובץ הקידוד המשלים 2.
הקצה את נתיבי התיקיה המתאימים עבור קובץ המסיכה וקובץ ה- TCF המתאים בתוך קובץ ה- Script. הפעל את הקוד כדי להתחיל ניתוח כמותני. הקוד יחשב את נפח האורגנואיד, צפיפות החלבון ותכולת החלבון הכוללת עבור כל מערך נתונים.
איור זה ממחיש את שחזורי מקדם השבירה התלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה המשמשים להמחשת המורפולוגיה הכוללת של אורגנואידים במעי הדק. השחזורים המעובדים חושפים הבדלים מבניים מובהקים בין אורגנואידים שטופלו ברכב לבין אורגנואידים שטופלו בציספלטין בכל שלושת עומק החתכים האופטיים. אורגנואידים שטופלו בציספלטין הראו נפח גבוה משמעותית, צפיפות חלבון נמוכה יותר ותכולת חלבון כוללת גבוהה יותר, בהשוואה לאורגנואידים שטופלו ברכב 10 דקות לאחר הטיפול, מה שמעיד על נפיחות מבנית מוקדמת ושינוי בהרכב החלבון.
הדמיית זמן-lapse במשך 24 שעות הראתה כי אורגנואידים שטופלו ברכב שמרו על שלמות מבנית, בעוד שאורגנואידים שטופלו בציספלטין חוו התדרדרות מבנית מתקדמת, כולל קריסת קריפטה ודיסוציאציה מוגברת של תאים, מה שמרמז על נזק ציטוטוקסי תלוי זמן. מעקב כמותי אישר כי אורגנואידים שטופלו ברכב גדלו בנפח ובתכולת החלבון לאורך זמן, בעוד שאורגנואידים שטופלו בציספלטין הראו ירידה תלוית זמן בשני הפרמטרים, מה שמצביע על כך שציספלטין דיכא את הצמיחה וגרם לפירוק תאי. צפיפות החלבון נותרה יציבה באורגנואידים שטופלו ברכב, אך ירדה בהדרגה באורגנואידים שטופלו בציספלטין במהלך תקופה של 24 שעות, מה שמרמז על התמוטטות במבנה התא והגדלת המרחב החוץ-תאי עקב פילינג.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מציג פרוטוקול להדמיה תלת-ממדית, ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות, של אורגנואידים, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות לתרופות. הגישה משתמשת בהולטומוגרפיה בעלת קוהרנטיות נמוכה, ומגדילה את היכולת לנטר שינויים ביופיזיים במהלך התפתחות האורגנואידים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום מחקר
- ביולוגיה של אורגנואידים
- טכניקות הדמיה ביו-רפואיות
- ניתוח תגובות לתרופות
רקע
- חשיבות של הדמיה לא פולשנית באורוגנואידים חיים
- שימוש ב-AI לבחירת מרקם כמותי
- רלוונטיות במודלים של מחלות ורפואה מדויקת
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הולטומוגרפיה להדמיית אורגנואידים
- תרביות אורגנואידים חיות
- ניתוח כמותי מונחה AI של נתוני הדמיה
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מבני אורגנואידים בזמן אמת
- יכולת להעריך תגובות לתרופות בצורה לא פולשנית
- הדגמה של אינטגרציה עם ניתוח חישובי לתובנות משופרות
מסקנות
- השיטה מציגה גישה חדשנית להדמיית אורגנואידים ברזולוציה גבוהה.
- היא מספקת תובנות קריטיות לגבי תכונות ביופיזיות והשפעות תרופתיות בהקשר ביולוגי חי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Label-free, high-resolution 3D imaging of intestinal organoids using low-coherence holotomography enables real-time, quantitative assessment of organoid morphology and drug response without phototoxicity or sample perturbation. Integration with machine learning segmentation delivers scalable, unbiased analysis of viability and structural changes, supporting predictive confidence in early discovery and preclinical research. This workflow enhances translational continuity and de-risks mechanistic evaluation for organoid-based disease modeling and pharmaceutical screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables non-invasive, quantitative interrogation of organoid growth and viability under experimental conditions.
- Supports mechanistic de-risking by tracking real-time morphological and biophysical changes in response to candidate compounds.
- Facilitates functional target validation through unbiased, label-free monitoring of organoid structure and protein content.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible imaging outputs for high-throughput compound screening in organoid systems.
- Delivers quantitative metrics such as volume, protein density, and content to support assay development and optimization.
- Enables scalable, machine learning-driven segmentation for consistent feature extraction across large datasets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant organoid models for translational biomarker discovery and drug response profiling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal, real-time tracking of organoid responses.
- Reduces biological ambiguity in preclinical decision-making by providing quantitative, time-resolved readouts of cytotoxicity and structural integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, screening, and preclinical research by providing a unified, label-free imaging and analysis platform for organoid-based studies.
- Discovery Biology: Quantitative, real-time imaging supports hypothesis testing and mechanistic pathway clarification in organoid models.
- Screening: Machine learning segmentation and quantitative outputs enable reproducible, high-throughput screening workflows.
- Analytics: Provides volumetric, protein density, and content measurements for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and supports biomarker-driven evaluation of drug effects.
- Enterprise Reuse: Adaptable across organoid systems, supporting broad implementation and portfolio-wide standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organoid-based assays.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging and analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early, quantitative assessment of drug effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust, translationally relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, advanced imaging, and machine learning-based segmentation.
- Demands access to low-coherence holotomography instrumentation and computational analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various organoid systems but may require optimization for specific tissue types or experimental endpoints.
- Dependent on robust data management and integration with downstream analytics for high-throughput studies.
