הקמת מודלים במבחנה של תרבית גרעיני שורש גב: גישות משלימות לחקירת הצלבה בין סרטן לעצב

המחקר שלנו מתמקד בהצלבה בין עצב סרטן, תוך שימוש בגרעיני שורש גב תלת מימדיים או צמחי DRG ותרביות מנותקות דו-ממדיות כדי לכמת נדידת גידול מונחית עצבים ולבדוק אסטרטגיות מולקולריות להגבלת האינטראקציה ביניהם. עם פרוטוקול זה, הקמנו תרביות DRG תלת-ממדיות ודו-ממדיות משלימות, ייעלנו את צמיחת הנויריטים והדגמנו עלייה בפלישת תאי סרטן לאורך הרחבות הנויריטים. התייחסנו למחסור במודלים הניתנים לשחזור הלוכדים הן אינטראקציות מורכבות ברמת התא והן ארכיטקטורת עצבים שלמה על ידי יצירת תרביות DRG דו-ממדיות ותלת-ממדיות משלימות מעכבר יחיד.

הפרוטוקול שלנו מניב אקספלנטים תלת-ממדיים ותרביות נוירונים דו-ממדיות מעכבר יחיד, תוך שמירה על מרקם זוויתי, מאפשר הדמיה בעלת תוכן גבוה, מפחית את השימוש בבעלי חיים ומאפשר לנו להשיג נתונים ברמת הרקמה ותא בודד בניסוי אחד. המודל שלנו פתח שאלות על אילו גורמים שנוצרו על ידי DRG מניעים פלישה, כיצד פעילות הנוירונים, הגיל והגנוטיפ מעצבים אותה, והאם התמקדות בקולטני גורמים נוירוטרופיים יכולה להפחית את התפשטות הסרטן מונחה נויריט. כדי להתחיל, הניחו עכבר שעבר המתת חסד על בטנו.

לגלח את הפרווה, תוך התמקדות באזור שמעל עמוד השדרה כדי לחשוף את פני הגב. רססו 70% אתנול על גב החיה. בעזרת מגבות נייר, נגב מהזנב לגולגולת כדי להסיר פרווה רופפת ולמנוע זיהום במהלך הדיסקציה.

בעזרת זוג מספריים מעוקרים, בצע חתך ישר לאורך קו האמצע הגבי מהזנב לגולגולת. בעזרת מלקחיים קהים, משוך את העור משני צידי החתך כדי לחשוף את עמוד השדרה. כעת, השתמש במספריים ומלקחיים טריים כדי למנוע זיהום ובצע חתך אופקי בקצה הזנב של עמוד השדרה.

לאחר מכן בצע שני חתכים אורכיים מקבילים משני צידי עמוד השדרה כדי לשחרר אותו. השתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את עמוד השדרה ולהסיר את רקמת החיבור שמסביב. כדי לשחרר את עמוד השדרה במלואו, בצע חתך בחלק העליון של עמוד השדרה ליד הגולגולת.

העבירו את עמוד השדרה לצלחת מקוררת מראש של 10 סנטימטרים המכילה HBSS עם סטרפטומיצין פניצילין הנשמר על קרח. לאחר מכן, השתמש במספריים קפיציים כדי להסיר את כל רקמת החיבור שנותרה מעמוד השדרה ולחשוף את החוליות. העבירו את עמוד השדרה הקצוץ לשלב מיקרוסקופ.

פצל בזהירות את העמוד לאורך המישור הסגיטלי בעזרת מספריים קפיציים. בעזרת מלקחיים עדינים הסר את חוט השדרה מהעמוד כדי לחשוף את גרעיני השורש הגבי לאורך שורשי עצבי עמוד השדרה. חותכים את עצבי עמוד השדרה בעזרת מספריים קפיציים.

לאחר מכן הסר את כל רקמת החיבור שמסביב מגרעיני השורש הגביים. בעזרת מלקחיים עדינים יש לחלץ בעדינות את גרעיני שורש הגב משורשי הגב. לתרבית שלמה, הנח את ה-DRGs בצלחת של שלושה סנטימטרים המכילה HBSS עם סטרפטומיצין פניצילין השמור על קרח.

השתמש בקצות פיפטה מקוררות מראש כדי להוציא שני מיקרוליטר של מטריג'ל צונן לכל באר של מגלשה עם תחתית זכוכית בת שמונה בארות המונחת בתוך צלחת של 10 סנטימטר על קרח. כדי למנוע פילמור מוקדם, פיפטה רק טיפה אחת בכל פעם. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי להניח גנגליון שורש גבי אחד על צלחת יבשה.

יש לסובב בעדינות כדי להסיר עודפי HBSS. לאחר מכן העבירו את גנגליון השורש הגבי הנקי לתוך טיפת המטריג'ל. לאחר העברת כל הגנגליונים לתוך הטיפות, דגרו את המגלשה עם תחתית הזכוכית באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לאפשר למטריגל להתפלמר.

לאחר מכן, הוסף בזהירות 200 מיקרוליטר של אמצעי תרבית משלימים חמים לכל באר. דגרו את המגלשה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לנטר את גרעיני השורש הגבי מדי יום לצמיחה עצבית וכדאיות.

צנטריפוגה צינור חרוטי בנפח 15 מיליליטר המכיל גרעיני שורש גב מאוגדים ב-200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוצאת ה-HBSS, שטפו את הגרעינים בחומר משלים שחומם מראש, והקישו בעדינות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור למשך חמש דקות ב-200G כדי לגלול את ה-DRG.

החלף את המדיה במיליליטר אחד של תמיסת פפאין. יש לערבב בעדינות ולדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמות למשך 20 דקות, תוך ערבוב עדין כל חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטר של חומר משלים כדי לנטרל את הפפאין, וערבבו בעדינות.

צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400G כדי לגלול את גרעיני השורש הגביים. לאחר הוצאת הסופרנטנט, הוסיפו מיליליטר אחד של קולגנאז מסוג IV בתמיסת Dispase II, ודגרו שוב. הוסף 4.5 מיליליטר של חומר משלים כדי לנטרל את תמיסת האנזים, לערבב בעדינות ולצנטריפוגה.

לאחר הוצאת הסופרנטנט, הוסיפו חמישה מיליליטר של חומר משלים. לאחר מכן הוסף Dnase I כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2 מיליגרם למיליליטר. גרעיני השורש הגבי אמורים להופיע כעת כגוש רופף, המעיד על עיכול מלא.

לדיסוציאציה מכנית, השתמש בקצה פיפטה מסנן של 1,000 מיקרוליטר כדי לשבש את תמיסת הגרעינים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים. עברו לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר וחזרו על הטריטורציה על ידי פיפטה ארבע עד חמש פעמים. סנן את המתלה העכור שנוצר דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן יש לשטוף בהדרגה את המסננת עם 10 מיליליטר מדיה כדי להבטיח העברה מלאה של תאים. צנטריפוגה את תרחיף התאים המסוננים למשך חמש דקות ב-1,000G כדי לגלול את התאים. הסר את המדיה מהגלולה, והשהה מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מדיה משלימה.

הסר את כל שאריות PBS מהבארות של מגלשת תחתית הזכוכית בת שמונה הבארות. מחלקים את תרחיף גרעיני השורש הגבי המנותק לבארות המצופות בקולגן, ודוגרים. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לנטר את התאים שמקורם בגרעיני השורש הגבי מדי יום, להעריך את כדאיות התאים וצמיחת העצבים לתרבות משותפת של כל גרעיני העכבר עם תאים סרטניים שאב תחילה את המדיה מתרביות DRG שלמות בשקופית תחתית הזכוכית בת שמונה הבארות.

בעזרת פיפטה מוסיפים בעדינות 200 מיקרוליטר מתרחיף התאים הסרטניים לבאר המכילה את טיפת המטריגל וגרעיני השורש הגביים. דגרו את מגלשת התרבות המשותפת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. רענן את המדיה מדי יום על ידי שטיפה אחת עם 200 מיקרוליטר של מדיה משלימה מחוממת, והוסף 300 מיקרוליטר של מדיה טרייה.

לתרבית משותפת של גנגליונים מנותקים ותאי הסרטן, שאפו את המדיה מתרביות ה-DRG המנותקות בשקופית תחתית הזכוכית בת שמונה הבארות. לאחר מכן מחלקים בעדינות 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים הסרטניים לכל באר לפני הדגירה. הקמת DRG הייתה פחות יעילה בהיעדר תוספי מזון והרחבת נויריט הופחתה באופן ניכר.

DRGs שלמים מבעלי חיים מבוגרים יותר ייצרו הרחבת נויריט פחות שופעת ויותר מובחנת ותאי גליה מינימליים, מה שהקל על הדמיה של אינטראקציות בין תאי סרטן העצב. הדיסוציאציה של נוירוני DRG באמצעות שני שלבים אנזימטיים הביאה להתאוששות גבוהה יותר של תאי עצב. תוך 24 שעות מהתרבית, תאים שאינם עצביים, כגון תאי שוואן, מקרופאגים ופיברובלסטים, התגלו, בעוד שנויריטים הנובטים מתאים שמקורם ב-DRG נצפתה וגדלה עוד יותר לאחר 72 שעות.

תאים סרטניים שנזרעו בתוספות טרנסוול מצופות מטריג'ל פלשו לעבר תאי HEC293, אך לא לעבר נוירוני DRG לאחר 24 שעות של דגירה. תרביות DRG שלמות שקועות בטיפת מטריג'ל אפשרו התפשטות נויריט החוצה דרך המטריצה לכיוון הפריפריה. עם מיקום זהיר של ה-DRG במרכז הטיפה, המספק הרחבה מקסימלית של נויריט מבלי לגדול מעבר לגבולות.

תאים סרטניים התיישבו לאחר 12 שעות של תרבית משותפת סביב גבול טיפת המטריגל המכילה את ה-DRG. לאחר 72 שעות של תרבית משותפת, תאי סרטן פלשו למטריגל ונעו לעבר הגנגליון, עם אינטראקציה ישירה בין הרחבות תאי גנגליון שורש הגב לתאים סרטניים. תרבית משותפת של תאים שמקורם ב-DRG מנותקים עם תאים סרטניים אפשרה הדמיה מפורטת של אינטראקציות בין תאים בודדים.