הדמיה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית כדי למזער פלואורסצנטיות רקמות לא ספציפיות

אנו מייעלים תהליך עבודה IBEX שמשלב חסימת הפארין וזיהוי ספקטרלי כדי לדכא את הרקע ברקמות אנושיות עשירות באאוזינופיל. פלואורסצנציה אוטומטית וקשירת גרנולים אאוזינופילים מסתירים אותות אמיתיים. אנחנו מכוונים לשניהם כדי לאפשר מפות פלקס גבוהות נקיות.

כדי להתחיל, ציירו עיגול על סלייד הזכוכית סביב הרקמה המותקנת באמצעות עט פאפ כדי ליצור מחסום הידרופובי. הוסיפו כ-100 מיקרוליטר PBS לכל רקמה כדי להחזיר את הנוזל, ודגרו את הסלייד במשך כשתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את תרכובת הטמפרטורה האופטימלית של חיתוך. שאפו את ה-PBS מסביב לרקמה באמצעות פיפט פסטר זכוכית יניקה.

לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר חוסם לכל רקמה, ודגרו בטמפרטורת החדר בתא לחות למשך שעה. עכשיו שואף את הבופר החוסם באמצעות פיפטה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של כתמים מעורבבים לכל רקמה ודוגרו את המחסנית בתא לחות מכוסה בתוך מקרר בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

באופן דומה, יש להכין חתך שצובע בפלואורופור אחד בלבד ובקרה שלילית ללא צביעה כדי להגדיר את ספקטרום הפלואורופור והאוטופלואורסצנציה של הרקמות. לאחר שאיפת תערובת הצביעה, שטפו את הרקמה שלוש פעמים עם PBS, ושאבו את הנוזל אחרי כל שטיפה. התקן את הדגימה על מיקרוסקופ להדמיה.

התמקד בדגימה באמצעות מצב ניגודיות של שדה בהיר או הפרעות דיפרנציאליות. לאחר מכן עוברים למצב פלואורסצנציה ומגדירים את פרמטרי הרכישה הספקטרלית בהתאם לדרישות הניסוי. הקצה את הלייזרים המתאימים לפלואורופורים ששימשו בניסוי.

בחר מפצל קרן התואם לקווי הלייזר שנבחרו. אפשר לכל הגלאים ללכוד את כל ספקטרום הפליטה, ולהתאים את רזולוציית התמונה לאחת הרזולוציות המוגדרות מראש. או לבחור את הרזולוציה המקסימלית.

התאימו את גודל החור ליחידת אזור אחת לחתך אופטימלי. אופטימיזציה של הגדרות הלייזר לפני הרכישה. באמצעות חלק מוכתם בכל הסימנים, התחל מצב סריקה רציפה בעוצמת לייזר נמוכה.

כוון את הגיין הראשי של כל גלאי וכן את עוצמת הלייזר עד שכל הסמנים מזוהים עם יחס טוב בין אות לרקע. כוונן בדיוק את עוצמת הלייזר והחלף באיטרציה בין קטעי צביעה בודדים ורב-צבעים עד שכל אותות הפלואורופור נראים ללא רוויה יתר. הפעל את הופעת האריחים בתוכנת הרכישה והגדר את אזור רכישת האריחים סביב הרקמה כדי להבטיח כיסוי תמונה מלא.

אופטימיזציה של המיקוד לאזור רכישת האריחים במרכז הרקמה. לזהות תכונה מבנית ייחודית, כמו סט מובחן של תאים בסידור מוכר, שישמש כנקודת ייחוס ליישור בסבבי הדמיה מאוחרים יותר. כעת הפעל את תכונת Z-stack ועבור ללשונית Z-stack.

מתחת לשונית המרכז, הגדר את מספר הפרוסות לפחות לשש עם מרווח של לא פחות ממיקרומטר אחד בין הפרוסות. לחץ על כפתור המרכז כדי להגדיר את נקודת המיקוד הנוכחית שנקבעה בשלב הקודם כפרוסה האמצעית של הערימה. לחץ על כפתור התחלת ניסוי כדי להתחיל ברכישת תמונה.

לאחר סיום הרכישה, לחץ קליק ימני על התמונה הממוזערת של התמונה, בחר שמור בשם. בחר מיקום קובץ ושם לתמונה. גבה את נתוני התמונה כדי לאחסן את האחסון. הפר את המיקס של התמונה באמצעות אותן הגדרות אופטימליות שהוחלו במהלך רכישת אזור עם אריחים.

לכודת סנאפ מכל בקרה עם צביעה בודדת כדי לקבל את ספקטרום האות האמיתי, ומהבקרה הלא מוכתמת, ללכידת רקע או אוטופלואורסצנציה. השתמשו בתמונות אלו אך ורק לפירוק ספקטרלי. ודאו שהאזור הנבחר מייצג אות אמיתי על ידי בדיקת העוצמה והמורפולוגיה חסרות או שוות ערך לרמות הרקע בבקרה הלא מוצבעת, ושהמיקום של הסמנים תואם את דפוס התאים הצפוי שלו כגון ממברנה, התפלגות גרעינית, ציטופלזמית או מופרשת.

פתח את תמונת הסנאפה בתוכנה. לחץ על לשונית ההסרה ובחר אחד מכלי בחירת האזורים תחת לשונית הכלים הלא מעורבבים, צייר אזור עניין או ROI סביב האות החיובי כדי לייצר את הספקטרום של אותו אזור. השווה כל ספקטרום שנוצר לספקטרום הפליטות התיאורטי של הפלואורופור המתאים.

ודא שהאזור מייצג במדויק את האות האמיתי. תן שם לכל ספקטרום לפי זהות הפלואורופור, ותשמור אותו במאגר הספקטרלי. לאחר מכן, טען את התמונה המצופה ופתח את כלי ההפרדה.

השתמשו בכפתור הפלוס כדי להוסיף את ספקטרום הייחוס לכל פלואורופור לרשימת הפירוק. לחץ על כפתור ההפרדה הליניארית כדי להפריד את האותות הספקטרליים ולשמור את התמונה הלא מעורבבת. הכינו את תמיסת ההלבנה במכסה אדים.

באמצעות מרית מיקרו, שקלו 10 מיליגרם ליתיום בורוהידריד ישירות לתוך יבשה. הוסיפו בזהירות 10 מיליליטר מים אולטרה-טהורים לתוך הבקבוק וערבבו עד שהתרכובת נמסה לחלוטין. הוסיפו כ-100 מיקרוליטר מהתמיסת ההלבנה הטרייה לכל חלק רקמה באמצעות פיפטת זכוכית של פסטר ודוגרו את המחסניות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בתוך מכסה האדים.

אם ההלבנה של Brilliant Violet מתה, העבר בזהירות את הסלייד למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי ובחר את המסנן הצבעוני. למקד את הדגימה ולהאיר אותה בעוצמה מלאה. כעת השתמש במטרת 5X כדי להשיג שדה תאורה גדול יותר והנמיך את הבמה לחלוטין כדי למנוע כל מגע בין הסלייד לאובייקטיב או למארז.

לבסוף, יש לשחרר את תמיסת הליתיום בורוהידריד מכל באר באמצעות פיפטת זכוכית פסטר ולהחזיר אותה לבקבוק המקורי של תמיסת ההלבנה. שטפו את המחסניות שלוש פעמים עם בופר דילול ודחפו את המחסניות במשך כשלוש דקות במהלך כל כביסה. הוסיפו את תערובת הנוגדנים וצבעו את הדגימה כפי שהודגמו קודם.

בצביעת רקמת פוליפ לא מטופלת עם CD3, CD4 ו-CD20 הראו פלואורסצנציה גרנולרית לא ספציפית עזה באזורים עשירים באאוזינופיל. בעוד שאות ממברנה אמיתי היה נוכח בעוצמה נמוכה יותר. טיפול מוקדם בחלב רזה של 5% לא חסם לחלוטין פלואורסצנציה לא ספציפית, וגם הפחית את עוצמת האות בפלואורופור כמו AF 532.

טיפול מקדים של דאב הפחית פלואורסצנציה לא ספציפית מ-CD20, CD3 ו-CD4, אך גם הפחית את עוצמת האות האמיתית בערוצים מרובים, כולל DAPI ו-AF 532. טיפול מוקדם בהפארין חסם ביעילות קישור לא ספציפי תוך שמירה על עוצמת אות גבוהה עבור CD3, CD4, CD20 ו-DAPI. הפארין חסם אות לא ספציפי באופן תלוי בריכוז, עם דיכוי מלא שהושג ב-10 יחידות וללא השפעות מזיקות בריכוזים גבוהים.

מערכת הדמיה תלת-מסלולית הפחיתה את זמן הרכישה, אך הכניסה דימוי צולב כולל דימום דרך AF 594 לתוך תעלת ה-PE, ושיפור האוטופלואורסצנציה של הרקמות בעקבות עירורים מרובים בלייזר. הדמיה ספקטרלית ביטלה כמעט את כל הרקע והדיבור הצולב, תוך הפחתת זמן הרכישה ושיפרה את יחס האות לרקע. הדמיית IBEX ספקטרלית של פוליפ אף אנושי חשפה מבנים אפיתליאליים המסומנים על ידי EpCAM.

תאי מערכת החיסון כגון לימפוציטים חיוביים ל-CD3 ו-CD20 חיוביים, וכלי דם המבטאים CD31 ו-CD34. טיפול בהפארין ביטל את קישור הגרנולים מבלי להפחית את האות, ושמר על דיכוי רקע חזק לאורך מחזורי IBEX. פירוק ספקטרלי מפחית דליפה דרך, ואוטופלואורסצנציה מגבירה את האות לרקע, ומאיץ משמעותית את רכישת הפאנלים המרובים לעומת קונפוקלי מרובה מסלולים.

דבר זה מאפשר פרוטאומיקה מרחבית חזקה ורקמות מאתגרות, התומכות במיפוי מדויק של מצב תא וניתוח ברמת השכונה.