התקדמות בפרופיל מטבולי של ספרואידים תלת מימדיים של גידולי מוח לבדיקת תרופות

מטרת המחקר היא לייעל את היווצרות שורשי התאים התלת-ממדיים לחקר חילוף חומרים של אנרגיה באמצעות טכנולוגיית סוסון ים, תוך התמקדות בפעילות מטבולית התנהגותית של התאים ותגובות לתרופות במודל הרלוונטי מבחינה קלינית שלנו. ממצאים אלה ישפרו מודלים של יציקת תרופות על ידי מתן ייצוג מדויק יותר של גידולי מוח, שיפור הערכת הטיפול וניתוח מטבולי לאסטרטגיות טיפול טובות יותר. התוצאות סללו את הדרך לחקירת האופן שבו חילוף החומרים האנרגטי משתנה במודלים תלת-ממדיים של ספרואידים, כיצד תרופות יוצאות מהשפעות על מסלולים מטבוליים, והמנגנונים שבאמצעותם שינויים מטבוליים תורמים להתפתחות עמידות הגידול לטיפול.

לאחר השעיית תאי U87 שנאספו ב-DMEM, יש לחמם את המדיום שאינו בשימוש ל-37 מעלות צלזיוס. שמור על מתלי התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בהתבסס על ספירת התאים הראשונית, יש לדלל את תרחיף התאים עם DMEM המכיל 10% FBS לנפח סופי של 20 מיליליטר, מה שמבטיח כ-200,000 תאים.

מערבבים היטב את תרחיף התא הסופי על ידי היפוך חוזר ונשנה. הוסף לאט 200 מיקרוליטר מהמתלה לאורך קצה כל באר בצלחת שקופה עם תחתית עגולה נמוכה במיוחד עם 96 בארות, ולאחר מכן אטום את הצלחת בחוזקה עם Parafilm כדי למנוע דליפה במהלך הצנטריפוגה. מניחים את הצלחת האטומה בצנטריפוגה ופועלים בחום של 200 גרם למשך שתי דקות כדי לגלול את התאים בתחתית כל באר.

הסר את הצלחת מהצנטריפוגה. הסר בזהירות את הפרפילם, והנח את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. להכנת תמיסת ציפוי, ממיסים חמישה מיליגרם פולי-D-ליזין ב -50 מיליליטר מים סטריליים, ומערבבים היטב את התמיסה עד להמסה מלאה.

הוסף 30 מיקרוליטר מתמיסת הציפוי לכל באר של צלחת הבדיקה המטבולית. ודא היעדר בועות על ידי ניעור עדין של הצלחת או שאיבת התמיסה העודפת. דגרו את הצלחת עם המכסה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שאפו את תמיסת הציפוי ושטפו את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר מים סטריליים.

יש לייבש את הצלחת באוויר למשך 30 דקות לפחות, ואז לחמם את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני למשך 30 דקות כדי לייצב את הציפוי. לאחר מכן, הוסף 175 מיקרוליטר של מדיום שחומם מראש לכל באר. שמור את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור נטול פחמן דו חמצני, עד שהיא מוכנה להעברת כדורי תאים.

העבירו את לוחות הכדורים למערכת הדמיה בעלת תכולה גבוהה לאחר חמישה ימי תרבית. כדי להגדיר את פרמטרי ההדמיה, הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת רמת הפחמן הדו-חמצני ל-5%התאם את סוג הצלחת, הערוצים וטווח המיקוד בהגדרות המערכת. לאחר מכן, רכשו תמונות ספרואידיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרות פי 10 ותוכנת ההדמיה, ולאחר מכן זהו בארות המכילות ספרואידים שלמים, ורשמו את מיקומם להעברה.

הקצה את הספרואידים השלמים לשתי קבוצות, קבוצת ביקורת עם שש בארות שכפול וקבוצת טיפול עם שש בארות שכפול לטיפול בפנופיבראט. הכן את תמיסת העבודה של פנופיברט במדיום טרי וטרום חם בריכוז האופטימלי. הסר בזהירות את לוחית החיבור הנמוכה ממערכת ההדמיה והנח אותה על משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

מקם את לוחית הבדיקה המצופה פולי-D-ליזין בסמוך אליה לצורך העברה, ולאחר מכן חתוך את קצה הפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי לאפשר שאיפה עדינה של ספרואידים של התא מבלי לגרום נזק. בעזרת קצה הפיפטה הגזום, שאפו בעדינות כל כדור שלם מתחתית הבאר שלו. העבירו כל כדור לבאר המתאימה של הצלחת המצופה, והניחו לו להתיישב למשך 20 שניות.

העבר את לוחות הבדיקה התלת-ממדיים למערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה. כדי לנתח את הנתונים המורפולוגיים, החל את מודול אזור המרקם כדי להפריד גס ספרואידים תלת-ממדיים מהרקע על ידי חלוקת תוכן התמונה לשלושה אשכולות בהתבסס על תכונות המרקם. החל את מודול מצא אזור תמונה כדי לחדד את ההפרדה של ספרואידים תלת-ממדיים מבודדים מראש באמצעות מאפייני גודל מבוססי נפח, כדי להבטיח הסרת זיהומים ושמירה על ספרואידים שלמים.

למדוד את הפרמטרים המורפולוגיים של הספרואידים התלת-ממדיים באמצעות מודול תכונות המורפולוגיה. החל את מודול בחירת האוכלוסייה כדי לסנן ולשמור רק ספרואידים מקוריים של תאים תלת-ממדיים, ולאחר מכן ייצא את תוצאות הנתונים המורפולוגיים. ספרואידים נוצרו באופן ניכר עד היום החמישי לתרבית, ושמרו על מורפולוגיה כדורית אחידה בכל הדגימות שנצפו.

ספרואיד מפורק עם שלמות מבנית משובשת בעליל נצפה גם ביום החמישי. ניתוח לאחר ההעברה גילה כי גם ספרואידים תלת מימדיים בביקורת וגם פנופיברט שטופלו בפנופיברט נותרו שלמים ברוב המקרים, אך חלק מהספרואידים שטופלו בפנופיברט התפוררו. קצב צריכת החמצן הופחת משמעותית בספרואידים שטופלו בפנופיברט בכל נקודות הזמן בהשוואה לקבוצת הביקורת.