מידול מחלות מיטוכונדריאליות באמצעות אורגנואידים במוח: התמקדות באנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ

היקף המחקר שלנו הוא להבין מדדי מחלות מיטוכונדריאליות ולמצוא תרופות לטיפול בהן. האתגר הוא לשמור על היכולת לבצע בדיקות בקצב גבוה, גם אם הטכניקה כוללת יצירת אורגנואידים. כדי להתחיל, הסר את המדיום מלוחות תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כאשר הם בערך 70 עד 80% מתאחדים.

שטוף את התאים עם PBS. הוסף 350 מיקרוליטר של תמיסת אנזימים לתאים ודגם. הוסף 800 מיקרוליטר של מדיום התאמה לגזע כדי לעצור את התגובה.

לאחר העברת מתלה התא לצינור חדש, יש לצנטריפוגה אותו ב-190G למשך חמש דקות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תלה מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מדיום התמיינות. לאחר ספירת התאים, זרעו 3000 תאים ב-100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת חיבור נמוכה בצורת U בצורת 96 בארות.

דגרו במשך שישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו-חמצני. לאחר הדגירה, משתמשים בפיפטה רחבה כדי להעביר את האורגנואידים מלוח הבאר 96 לצלחת 10 סנטימטר. פיפט 50 מיקרוליטר של מדיום DMEM/F12 עם תוספת לכל באר של פלטת 96 באר חדשה.

אסוף את האורגנידים לשני צינורות של מיליליטר. הסר את המדיום בזהירות מבלי לשאוף את האורגנואידים, והוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום DMEM/F12 עם תוספת נוספת. לאחר שהוצאתי את השטיפה האחרונה, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מדיום טרי.

לאחר מכן העבר את האורגנואידים לצלחת בגודל 10 סנטימטר. הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום כדי להקל על איסוף כל אורגנואיד. העבר את כל האורגנואידים לכל באר בלוח 96 בארות באמצעות מיקרופיפטה שמכוונת ל-50 מיקרוליטר, ודגר במשך שלושה ימים.

ביום התשיעי, אסוף את האורגנואידים לצינורות של שני מיליליטר ושטוף שלוש פעמים עם DMEM/F12. לאחר מכן תלו מחדש את האורגנואידים במדיום ההתמיינות. העבר כ-10 אורגנואידים לכל באר ללוח של שישה קידוחים וכוון את הנפח הסופי של המדיום בכל באר לשני מיליליטר.

גידול את הצלחת באופן סטטי במשך שישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. ביום ה-15, אסוף את האורגנידים לצינורות של 15 מיליליטר. לאחר שמאפשרים לצינורות לשקוע, הוסיפו מדיום התמדה טרי עם תוספת B27 וויטמין A לאחר שהוצאת הסופרנטנט.

העבר כ-10 אורגנואידים לכל באר ללוח בן שישה בארות. תגדלו את האורגנואיד באופן סטטי במשך 15 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני. ציפוי את לוחות התרבית בתמיסת פולי-אל-אורניתין מדוללת.

דגרו את הצלחות ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הבארות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם PBS. עכשיו הוסיפו תמיסת למינין מדוללת לבארות.

דגרו את הצלחות לשלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, או כל הלילה. צנטריפוגה את המתלה האורגנואידי ב-200G למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והוסיף מיליליטר אחד של תמיסת אנזימים.

ערבבו היטב ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני הצנטריפוגה. לאחר הסרת הסופרנטנט והוספת מיליליטר אחד של תמיסת פיזור, שכב בזהירות את תמיסת הבידוד מתחת למתלה. אחר כך צנטריפוגה את המתלים ב-200G למשך חמש דקות.

עכשיו, פיפט מיליליטר אחד של מדיום נוירוני לתוך הצינור. מערבבים את התמיסה והעבירו את המתלה דרך מסננת 70 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר. לאחר ספירת התאים, זרעו את תליית התא בצפיפות של 100,000 תאים לסנטימטר רבוע על לוחות מצופים פולי-אל-אורניתין ולמינין.

החלף את המדיום כל ארבעה עד שבעה ימים עד יום 60. כדי לקבע את האורגנואידים לאימונופלואורסצנציה, תחילה קצרו את האורגנידים למיקרו-צינורות. שטוף את האורגנואידים עם PBS, ואז מקבע אותם ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הקיבוע שטוף את האורגנידים הקבועים שלוש פעמים עם PBS. אחסן את האורגנואידים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. 30 יום לאחר הזרעה לתרבות נוירונית דו-ממדית, הסר את מדיום התרבית מהצלחות.

אחר כך שטפו את התאים עם PBS. תקבע את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוציא את הפרפורמלדהיד, ואז שטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים.

אחסן את התאים הקבועים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש בהם. כדי לאסוף את האורגנידים עבור RTQPCR, העבר אותם למיקרו-צינורות. פיפטה PBS לתוך הצינורות כדי לשטוף את האורגנידים.

עכשיו, הוסיפו 350 מיקרוליטר של בופר ליזיס לאורגנואידים, ואז הקפיאו אותם בחנקן נוזלי. אחסן את הצינורות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אורגנואידים במוח המכילים נוירונים חיוביים ל-FOXG1 הושרו בהצלחה מקו IPSC 414C2 בביקורת בריאה ביום ה-30, ורשתות עצביות דו-ממדיות התקבלו ביום ה-60.

רמות ההטרופלסמיה של וריאנט M.3243A ל-G אושרו על ידי QPCR. הקווים השני עד השמיני היו בעלי הטרופלזמה נמוכה, והקווים שתיים עד שש היו בעלי הטרופלזמה גבוהה. אורגנואידים במוח שמקורם בקו ההטרופלזמה הנמוך שניים עד שמונה הציגו גדלים ומורפולוגיות דומות לאלו של ביקורת בריאה.

אורגנואידים שנוצרו מקו ההטרופלזמה הגבוהה שתיים עד שישה הציגו גודל מוקטן של 0.3 מילימטרים רבועים, ומורפולוגיה לא סדירה עם ערך מעגלי של 0.82. רוב הנוירונים שנשרתו מקו 414C2 וקו שניים עד שמונה היו חיוביים ל-FOXG1 בימים 30 ו-60. נוירונים חיוביים ל-FOXG1 זוהו לעיתים נדירות באורגנואידים או בנוירונים מתורבתים דו-ממדיים שמקורם בקו שניים עד שישי.

התוצאות שלנו מצביעות על כך שמודלים אורגנואידיים מבוססי IPSC שמקורם במטופלים מהווים פלטפורמה שימושית ללימוד מראות, מנגנונים ובדיקת סמים. השיטות הקונבנציונליות שלנו, עם זמן תרבית קצר ויעילות כלכלית, מציעות כלים מעשיים לחקר הפתופיזיולוגיה של MELIS. נרצה לחפש תרופות פוטנציאליות ל-MELIS באמצעות תרכובות עם מטופלים המאורגנים בעתיד.