הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס
14 בנובמבר 2025
פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס, תוך שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות המזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית והחמצתה.
פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים למעקב אחר פרמאבוליזציה של ממברנה ליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס באמצעות גלאי פלואורסצנטי שמזהים שינוי בשלמות הממברנה הליזוזומלית ובהחמצה. האתגר בתחום הוא לאפיין את הדינמיקה של האברונים שנפגעו במהלך תהליך מוות התאים, ולהגדיר במדויק כיצד נזק זה אמור להוביל או לתרום להשמדת התא. כדי להתחיל, לוחח 5,000 תאים בשני מיליליטרים של מדיה DMEM עם תוספת אנטיביוטיקה לתוך צלחת זכוכית סטרילית.
הניחו את הצלחת באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני, ודגרו את התאים במהלך הלילה. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזי דקסטרן ירוקים ל-25 מיקרוגרם למיליליטר במדיום DMEM טרי עם אנטיביוטיקה כדי לדלל אותם. הוציאו את המדיום הישן מהצלחת והחליפו בשני מיליליטרים של מדיום DMEM המכיל בשר בקר.
הניחו את המנה באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני, ודגרו במשך 24 שעות כדי לאפשר הפנמת חרוזים לליזוזומים. עכשיו הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת LysoTracker במלאי אחד לשני מיליליטרים של מדיה DMEM טרייה. החלף את המדיום הישן בתמיסת הכתמים הזו.
דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעתיים. הפעל את רכיבי המערכת הקונפוקלית על ידי הפעלת המחשב האישי, מיקרוסקופ, כוח סורק, כוח לייזר, פליטת לייזר וכוח Leica. הפעל את בקרות הסביבה, כולל בקר הטמפרטורה שנקרא Cube, ובקר מערבל גז פחמן דו-חמצני, שנקרא Brick.
פתח את אספקת הפחמן הדו-חמצני והחמצן. כוון את בקר הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. הגדר את בקר הגז והלחות ל-5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות.
הרכיבו את תא ההדמיה. לאחר הצביעה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS, ואז הוסיפו שני מיליליטר של מדיום DMEM טרי. מרחו שמן טבילה על עדשת האובייקטיב לפני ההדמיה.
התקן את הצלחת על שלב המיקרוסקופ. כוון את עוצמת הלייזר ל-3% אך לא יותר מ-5% ואז כוון את הגיין בגלאי בתוכנת המיקרוסקופ כדי לייעל את האות. מזער את הרקע על ידי כיוון פס הניגודיות.
לרכוש תמונות בסיסיות של תאים לא מטופלים, המשמשים כתנאי בקרה. החזר את הפלטה למכסה הזרימה הלמינרי והוסיף אנטיביוטיקה מיליליטר אחת DMEM בתוספת מעודדי מוות תאי. בתוכנת הרכישה, הגדר את המצב ל-XYT, פורמט ל-512 על 512, מהירות ל-400, זום לשלוש, ממוצע קו לאחד, הצטברות קווים לשלוש, הצטברות פריימים לאחת, מרווח זמן לשלוש דקות, משך הזמן לשמונה שעות, והפעלת פוקוס אוטומטי.
לחץ על התחלה כדי להתחיל את רכישת הטיימלפס. הדמיה ראשונית אישרה נוכחות של פונקטות יציבות של LysoTracker ודקסטרן מסומן בפלואורסאין, מה שמעיד על ליזוזומים שלמים לפני הטיפול. ארבע שעות לאחר הטיפול ב-TSZ, הפלואורסצנציה של LyoTracker ירדה באופן ניכר, בעוד שהדקסטרן החל להראות פיזור ציטוזולי מפוזר, מה שמעיד על חדירות ראשונית לממברנת הליזוזומלית.
עד שמונה שעות לאחר הטיפול, האות של LysoTracker כמעט נעלם לחלוטין, בעוד שרבים מהתאים שמרו על פונקטות דקסטרן ירוקות עם אות ציטוזולי ירוק מפוזר. אנו מראים כי ניתן להמחיש ישירות את פרמאבוליזציה של ממברנת הליזוזום בתא חי העובר אינדוקציה נקרופטוטית. פרוטוקול זה מראה כי השילוב של חרוזי LysoTracker ו-dextran מאפשר ניטור בו-זמני של pH ליזוזומי ושחרור מטען בזמן אמת.
וחשוב לקידום פרוטוקול התמונה של תא חי זה הוא היכולת שלו לנטר שינוי pH קטן וחדירות ממברנה ליזוזומלית בזמן אמת, וללכוד אירועים דינמיים שחסרים בניתוח נקודות קצה כמו ציטומטריית זרימה וצביעת שכבה אחת.
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות ממברנת הליזוזום במהלך נקרופטוזיס. הוא משתמש בחומרים מחשמלים פלואורסצנטיים כדי לזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית וחומציותה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מדעי המוח
- הדמיה של תאים חיים
רקע
- אפיון נזקי אברונים במהלך מוות תאים חיוני.
- הבנת תרומת נזק ליזוזומלי למוות התאים היא אתגר.
- הדמיה של תאים חיים מאפשרת תצפית בזמן אמת על תהליכים תאיים.
- חומרים מחשמלים פלואורסצנטיים יכולים להצביע על שלמות הליזוזום ושינויים ב-pH.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לניטור חדירות ממברנת הליזוזום.
- להמחיש שינויים בזמן אמת במהלך נקרופטוזיס.
- לשפר את ההבנה של הדינמיקה הליזוזומלית במוות התאים.
שיטות ששימשו
- הרכשת תאים ודגירה במדיום DMEM משלים באנטיביוטיקה.
- צביעה עם LysoTracker וחרוזי דקסטרן לדמיית ליזוזומים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית להדמיה של שינויים תאיים לאורך זמן.
- רכישת זמן-זיזה לניטור שלמות הליזוזום ו-pH.
תוצאות עיקריות
- הדמייה ראשונית הראתה ליזוזומים יציבים לפני גירוי נקרופטוזיס.
- לאחר הטיפול, נצפתה חדירות ממברנת הליזוזום.
- ניטור בזמן אמת גילה שינויים ב-pH הליזוזומלי ושחרור מטען.
- השיטה מאפשרת ללכוד אירועים תאיים דינמיים שהוחמצו בניתוחי נקודת סיום.
מסקנות
- הפרוטוקול מדמיין ביעילות שינויים בממברנת הליזוזום במהלך נקרופטוזיס.
- שילוב של LysoTracker וחרוזי דקסטרן מספק תובנות מקיפות.
- גישה זו מקדמת את המחקר של מנגנוני מוות תאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Real-time live-cell imaging of lysosomal membrane permeabilization (LMP) during necroptosis addresses a critical gap in understanding regulated cell death mechanisms relevant to target validation and mechanistic de-risking. This approach enables precise temporal mapping of organelle dysfunction, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Integrating dynamic LMP monitoring informs portfolio decisions by clarifying cell death pathways and potential intervention points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of lysosomal dysfunction as an early necroptosis event.
- Supports mechanistic de-risking by linking LMP to downstream cell death outcomes.
- Improves predictive confidence in target engagement and pathway interrogation.
- Facilitates triage of targets based on real-time functional readouts.
Screening & Assay Development
- Provides validated live-cell systems for quantitative assessment of lysosomal integrity.
- Enables reproducible, scalable imaging assays for compound screening.
- Delivers standardized, multiplexed readouts of pH changes and cargo release.
- Supports robust evaluation of candidate modulators affecting necroptosis pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic cell death markers with disease-relevant models when applicable.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of cell death mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying intervention windows and biomarker dynamics.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This live-cell imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic assessment of organelle integrity and cell death progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the sequence and causality of necroptosis events.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides real-time measurements of lysosomal pH and cargo release for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when disease relevance is established.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse cell death and organelle integrity studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death research.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on dynamic functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and confocal microscopy operation.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and environmental controls.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis.
- May require adaptation for different cell types or disease models.
- Limited by the need for real-time imaging infrastructure and fluorescent probe compatibility.
