Name: הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: למדו הדמיית תאים חיים לניטור חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס באמצעות סמנים פלואורסצנטיים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שינויים בחומציות ובשחרור מטען ליזוזומלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development and diseases.</a> Genes Dev. 32, 327-340 (2018).</li>
<li>Kang, K., Park, C., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Necroptosis at a glance.</a> J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).</li>
<li>Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+pathways+of+apoptotic%2C+necroptotic%2C+pyroptotic%2C+and+ferroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death.</a> Mol Cell. 84, 170-179 (2024).</li>
<li>Zhang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3%2C+an+energy+metabolism+regulator+that+switches+TNF-induced+cell+death+from+apoptosis+to+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis.</a> Science. 325, 332-336 (2009).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Cho, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-driven+assembly+of+the+RIP1-RIP3+complex+regulates+programmed+necrosis+and+virus-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation.</a> Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+is+a+key+receptor+interacting+protein+3+downstream+component+of+TNF-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cell+death+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cell death at a glance.</a> J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).</li>
<li>Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+cell+death%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges.</a> Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).</li>
<li>Alu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lysosome+in+regulated+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">The role of lysosome in regulated necrosis.</a> Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).</li>
<li>Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1-associated+lysosomal+permeabilization+is+cathepsin+B+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).</li>
<li>Vanden Berghe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%2C+necrosis+and+secondary+necrosis+converge+on+similar+cellular+disintegration+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features.</a> Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+polymerization-induced+lysosomal+membrane+permeabilization+promotes+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis.</a> Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).</li>
<li>Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B+knockout+mice+are+resistant+to+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+hepatocyte+apoptosis+and+liver+injury%3A+implications+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications.</a> Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+quantification+of+lysosomal+membrane+permeabilization%3A+a+hallmark+of+lysosomal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death.</a> Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).</li>
<li>Barral, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+to+analyze+lysosome+morphology%2C+positioning%2C+motility+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function.</a> Traffic. 23, 238-269 (2022).</li>
<li>Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+detecting+lysosome+quantity+and+membrane+permeability+in+acute+myeloid+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines.</a> STAR Protoc. 5, 103309(2024).</li>
<li>Ferrari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+quality+control+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases.</a> Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).</li>
<li>Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+stress+in+cardiovascular+diseases%3A+therapeutic+potential+of+cardiovascular+drugs+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions.</a> Biomedicines. 13, (2025).</li>
<li>Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lysosomes+in+human+disease%3A+from+basic+research+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).</li>
<li>Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).</li>
<li>Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+phosphatase+PGAM5+functions+at+the+convergence+point+of+multiple+necrotic+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways.</a> Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).</li>
<li>Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+live-cell+fluorescence+imaging+conditions+to+minimize+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity.</a> J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).</li>
<li>Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+lysosomal+membrane+permeabilization+using+acridine+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange.</a> Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).</li>
<li>Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+selective+elimination+of+damaged+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes.</a> Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>תאי HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>תאי סרטן המעי הגס</td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ</td><td>חברת MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>לייקה</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים ירוקים דקסטרן</td><td>תרמופישר</td><td>D1820</td><td>דקסטרן, פלואורסציין, 10,000 מגה-וואט, אניוני, ליזין ניתן לתיקון</td></tr><tr><td>ה-Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker אדום DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>סוג טבילה בשמן HF</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין (P/S)&nbsp;</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>מלח זרחן (PBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>סמאק מימטי (S)</td><td>BV6, ApexBio, קטלוג</td><td>B4653</td><td>ריכוז סופי, 1 מ"מ</td></tr><tr><td>The Brick&nbsp;</td><td>שירותי הדמיית חיים</td><td>13685</td><td>בקר CO2 למיקסר גז</td></tr><tr><td>הקובייה</td><td>שירותי הדמיית חיים</td><td>CBO2A</td><td>מיקרוסקופים של תא בקרת טמפרטורה</td></tr><tr><td>פקטור נמק הגידול אלפא (TNF-&alpha; - T)</td><td>פפרוטק</td><td>30001A100UG</td><td>ריכוז סופי, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>ריכוז סופי, 20 מ"מ</td></tr></tbody></table>

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה מאפשרים רכישת תמונות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לניטור LMP בזמן אמת. איור 1 ממחיש ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי, מציפוי תאים ועד רכישת תמונה. ביום 0, 5,000 תאי HT-29 צופו והודגרו במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר 24 שעות (יום 1), התאים הודגרו עם חרוזי דקסטרן עם תווית פלואורסצאין (25 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 24 שעות נוספות באותם תנאים. חרוזים אלה מופנמים על ידי אנדוציטוזיס ותנועה לליזוזומים, שם הם מצטברים ומופיעים כפונקטה בהירה. ביום השני (יום הניסוי), התאים טופלו בצבע LysoTracker רגיש ל-pH (1 מיקרומטר) למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. LysoTracker מתרכז ומציג פלואורסצנטיות חזקה בתוך תאים חומציים, כגון אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים. שלושים דקות לפני ההדמיה, מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי הופעלה ויוצבה, כולל בקרי טמפרטורה, גז ולחות, כמתואר בשלב 4 של הפרוטוקול. תא ההדמיה הורכב, כפי שמודגם באיור 2. נעשה שימוש בלייזרים של 488 ננומטר (ירוק) ו-555 ננומטר (אדום).
לאחר הדגירה עם LysoTracker, התאים נשטפו בזהירות שלוש פעמים עם PBS, ונוספו 2 מ"ל של DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S. הצלחת הועברה למיקרוסקופ, וטיפה אחת של שמן טבילה נמרחה על מטרת טבילת השמן 63x/1.40 NA. לאחר מכן הותאמו עוצמת הלייזר ורמות הרקע כדי לייעל את תנאי ההדמיה, כמתואר בשלב 5.5. של הפרוטוקול. התמונות הראשוניות שלנו אישרו את נוכחותם של פונקטה יציבה של Lysotracker ושל דקסטרן המסומן על ידי פלואורסצאין, מה שמעיד על ליזוזומים שלמים (איור 3). התמונות הבסיסיות נרכשו לפני T/S/Z ושימשו כבקרה. לא הופעל רכב.
לאחר קביעת הגדרות ההדמיה והמיקרוסקופיה הראשוניות, הצלחת הוחזרה למכסה הזרימה הלמינרית, ונוספה 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% P/S, המכילים 100 ננוגרם/מ"ל TNF-α (T), 500 ננומטר SMAC חיקוי (S) ו-100 מיקרומטר Z-VAD-FMK (Z). ההדמיה המשיכה במיקרוסקופ הקונפוקלי באמצעות פרמטר רכישת ההדמיה המתואר בשלב 6 של הפרוטוקול. כפי שמוצג באיור 3, בסרט המשלים S1 ובסרט המשלים S2, הירידה המתקדמת בפלואורסצנטיות LysoTracker בתאים שטופלו ב-T/S/Z שימשה כאינדיקטור מוקדם לשינוי ליזוזומלי. אובדן זה לווה ולעיתים התרחש במקביל לשטף של דקסטרן המסומן בפלואורסצאין מהליזוזומים לתוך הציטוזול (הסטה מנוקבת למפוזרת), המצביעה על LMP. לאחר 8 שעות, כמעט כל אות Lysotracker נעלם, עם זאת, תאים רבים עדיין שמרו על פונקטה ירוקה עם אות ירוק ציטוזולי, מה שמרמז על אובדן שיפוע pH ליזוזומלי לפני LMP מלא ושחרור מטען.
<img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="איור 1"> 
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי. (נוצר ב-BioRender.com) בתחילה, 5,000 תאים צופו (0 שעות) והודגרו במשך 24 שעות; לאחר מכן, נוספו חרוזי דקסטרן (25 מיקרוגרם/מ"ל) והודגרו למשך 24 שעות נוספות. לאחר 48 שעות, LysoTracker (1 מיקרומטר) נוסף והודגר למשך שעתיים. התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS (שלב 1), ולאחר מכן נוספו 2 מ"ל של DMEM טרי בתוספת 10% FBS ו-1% P/S (שלב 2). הגדרות המיקרוסקופיה הותאמו (שלב 3), והתאים טופלו ב-TNF-α (T), חיקוי SMAC (S) ומעכב פאן-קספאז Z-VAD-FMZ (Z) (שלב 4), לפני רכישת תמונה של תאים חיים (שלב 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="איור 2"> 
איור 2: דיאגרמה של מערך תא ההדמיה. (A) מחזיק הדגימה, (B) תא הדגירה של הגז, ו-(C) המכסה העליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="איור 3"> 
איור 3: תמונות מייצגות של תאי HT29 לפני ואחרי טיפול ב-T/S/Z. התאים נצבעו בחרוזים אדומים של Lysotracker וירוק דקסטרן וטופלו ב-TNF-α (T), חיקוי SMAC (S) ומעכב פאן-קספאז Z-VAD-FMZ (Z). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.</a>
סרטון משלים S1: קיטועי זמן של תאי HT29 שהודגרו עם חרוזים ירוקים של דקסטרן וטופלו ב-T/S/Z. התאים נוטרו במשך יותר מ-6 שעות כדי להעריך את התגובה התאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>
סרטון משלים S2: קיטועי זמן של תאי HT29 שהודגרו באדום LysoTracker וטופלו ב-T/S/Z. התאים נוטרו במשך יותר מ-6 שעות כדי להעריך את התגובה התאית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

Necroptosis, a form of regulated necrosis, culminates in cell membrane rupture. Our lab and others have discovered that lysosomal membrane ...

live-cell-imaging-lysosomal-membrane-permeabilization-during

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא...

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

AlPcS2a-mediated chromophore-assisted laser inactivation (CALI) הוא כלי רב עוצמה לחקר נזק מרחבי-זמני של שלפוחיות תוך-תאיות (IVs) בתאים חיים.

גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

פרוטוקול זה מתאר מנגנון לשימוש במיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה כדי להמחיש את האינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים המסומנים ב-mEosEM ו-APEX2, בהתאמה.

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה דו-צבעונית להדמיית אינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים

למדו הדמיית תאים חיים לניטור חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס באמצעות סמנים פלואורסצנטיים. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר שינויים בחומציות ובשחרור מטען ליזוזומלי.

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

גלה סרטונים נוספים