פיתוח מודל קיבוע פנימי חדשני לשברים רדיאליים בעכברים: הערכת החלמת שבר ובידוד גנגליון שורש גב

שברים רדיאליים נפוצים מאוד ברחבי העולם והם הגורם המוביל לשברים בעצם הארוכה בגפיים. מודל השבר הרדיאלי של עכברים חיוני לחקר ריפוי שברים, סקר תרופות והערכת חומרים ביולוגיים במחקר אורתופדיה. מכיוון שהרדיוס של חולדות הוא יחסית דק, לוחות הפלדה והברגים המשמשים כיום בפרקטיקה קלינית אינם מתאימים לטיפול בשברים רדיאליים של חולדות.

כדי להתגבר על מגבלה זו, הפרוטוקול משלב באופן חדשני קיבוע תפרים ומחט טיטניום, ומקים מודל שבר רדיאלי יציב למחקר קיבוע פנימי. בפרוטוקול הצגנו גם את השימוש במערכת הדמיה מיקרו-CT של בעלי חיים כדי להבהיר את תהליך החלמת השברים בעכברים. הראינו גם את ההוצאה והתרבית של DRG במודל השבר של עכברוש, שישמש לחקר מנגנון הפגיעה ותיקון העצבים בשברים.

כלי הניתוח לשבר חולדה כוללים להב אזמל, ידית אזמל, מספריים ניתוחים, מחזיק מחט, מלקחיים המוסטטיים ומלקחיים רקמתי עם שיניים. זכר עכברוש ספרג דולי, בן כ-8 שבועות ומשקלו כ-200 גרם. הרדימו את העכברוש באמצעות מכונת הרדמה בגז איזופלורן ושמרו על הרדמה נשימתית לאורך כל הניתוח.

שמור על טמפרטורת חדר הניתוח על 28 מעלות צלזיוס. הנח את העכבר במצב צדדי. חשפו את הגפה הקדמית הימנית, וגלחו את השיער בעזרת מכונת תספורת. כיסו סדין סטרילי ועטפו חוסם עורקים סביב הגפה הקדמית הימנית הקרובה כדי להפחית דימום כירורגי.

הכינו את העור על ידי חילופי אלכוהול ובטאדין שלוש פעמים. יש ליצור חתך אורך של 1.5 ס"מ בצד הרדיאלי הגבי של האמה הימנית. הפרד את מרחבי השרירים וחשוף במלואו את רדיוס הגפה הקדמית הימנית.

השתמש במספריים כדי לחתוך את הרדיוס וליצור שבר רוחבי. כיוון המספריים יוצר זווית של 90 מעלות עם הרדיוס. קח מחט טיטניום בקוטר 0.8 מ"מ ואורך 10 מ"מ, והכנס אותה לשבר הרדיאלי לאורך הציר האורכי שלו.

תקבע את הרדיוס ואת מחט הטיטניום עם תפר. התפר נקשר בשלושה קשרים רצופים, ומחט הטיטניום הוחברה לרדיוס באמצעות ארבעה תפרים מופרעים. תפרו את צבע העור של התפר העודף וסגרו את העץ.

חטא את העור עם סקרבס בטדין. כסו את הפצע בגזה סטרילית ואבטחו אותו בתחבושות. העכברוש חזר להכרה לאחר ההרדמה ומצבו החלים היטב.

הרדימו את העכברוש באמצעות מכונת הרדמה בגז איזופלורן. הנח את העכבר במצב שכיבה בתוך תא הסריקה. התאימו את מיקום הגפיים והראש כך שמרכז את אזור הסריקה בשדה הראייה ושמרו על אוורור והרדמה רציפים לאורך כל ההליך.

דחפו את מיטת החיה הקבועה לתא הסריקה וסגרו את דלת החדר. פרמטרי הסריקה המיקרו-CT הוגדרו כך: מצב סריקה: סטנדרטי, זמן חשיפה: שתי דקות, שדה ראייה: 72 מ"מ, גודל ווקסל: 144 מ', קילווולט: 90; מיקרו-אמפרים: 88, פילטר: תלת-ממד-רך. נתוני הסריקה מועברים אוטומטית לתוכנה, ונוצרת תמונת CT תלת-ממדית.

הפרד את רקמות המטרה. ייצא את התמונות המעובדות. חתך את עמוד השדרה, הסר את גופי החוליות מ-C1 עד C7.

חתכו את עמוד השדרה הצווארי לאורך הקווים האמצעיים הקדמיים והאחוריים, המחולקים לחצי שמאלי וימני. השתמשו במלקחיים עם רקמות שיניים כדי להרים את ה-DRG, הרימו אותו בעדינות ואז השתמשו במספריים לניתוח כדי לחתוך את סיבי העצב. העבר את DRGs שהופקו לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם מדיום חילוץ.

שים על הקרח. שאף לאט והשליך את מדיום החילוץ. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת עיכול ואנזימים מעורבת.

עכלו באמבט מים של 37 מעלות למשך 60 עד 70 דקות. הפיפט כמות מתאימה של תמיסת הפיברונקטין לתוך צלחת פטרי וציפו אותה בתנור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר העיכול, שאוף, וזרוק את תמיסת האנזים העיכול המעורבת הפועלת.

איסוף סינון, צנטריפוגה ב-70 x גרם למשך 8.5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף ולזרוק את הסופרנטנט בצינור הצנטריפוגה. הוסיפו 1 מ"ל של מדיום שלם כדי להחזיר את המשקע.

תוציא את צלחת הפטרי. זרוק את תמיסת הפיברונקטין ושטוף פעמיים עם PBS. הסנן את התאים לתוך צלחת פטרי, הוסיף 1 מ"ל מדיום שלם.

הניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 8-12 שעות. הדמיית המיקרו-CT אישרה את ההצלחה בהקמת מודלים של עכברים לשבר רדיאלי ומודל קיבוע פנימי לשברים רדיאליים בעכברושים. 20 יום לאחר המידול, ניתוח מיקרו-CT של חולדות SD בקבוצת מודל השבר הראה פרוגנוזה חיובית.

נצפתה היווצרות יבלת כגישרת בין קצות השבר, עם מיזוג הדרגתי והשמדה הדרגתית של קו השבר, התואם את שלב האיחוד המוקדם של העצמות. התמונות הראו קו שבר מטושטש באזור המדומה, מה שמרמז כי רקמת העצם באתר השבר החלימה ברובה. ביום החמישי עד השישי לאחר בידוד DRG, תאי העצב מציגים חשיפה נרחבת לציטופלזמה.

בשלב זה, כל גופי התאים העצביים והסינפסות הסובבות אותם ניתנים להבחנה ברורה. מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה שימשה לצילום תאי עצב ביום השישי של התרבית. כפי שמוצג באיור 9, בטא III-טובולין הוצג כפלואורסצנציה ירוקה.

תאי בטא III-טובולין חיוביים, כולל גופי תאי DRG ואקסונים, צופו בירוק, והפלואורסצנציה הכחולה מייצגת את גרעיני הנוירונים שצובעו על ידי DAPI. חולדות הן מודל קלאסי לחקר מנגנון ריפוי השברים בשל הרקע הגנטי הברור שלהן ומחזור הרבייה הקצר שלהן. עם זאת, קוטר הרדיוס הקטן של כ-1-1.5 מ"מ הופך את ההתאמה למכשיר קיבוע פנימי קליני לבלתי אפשרי, מה שמגביל מאוד את השימושיות שלו במחקר ריפוי עצבים-עצם.

בתגובה לבעיה זו, מחקר זה הציע באופן חדשני את שיטת הקיבוע הפנימית המשולבת של מחט טיטניום עם תפר. ההיגיון המרכזי הוא להחליף את הקיבוע הקשיח של הברגים בקשירת תפרים גמישה, מה שיכול להפחית את הפגיעה העצבית היאטרוגנית ולספק סביבה מכנית יציבה. פרוטוקול זה סיפק חזרתיות וסטנדרטיזציה לבניית המודל.

התפרים ומחטי הטיטניום משמשים לקיבוע פנימי במודלים של שבר רדיאלי של חולדות. החלמת השברים נבדקת באמצעות מיקרו-CT. נוירוני ה-DRG הראשוניים מבודדים ומגודלים לאחר בדיקות ריפוי שבר.

בפרוטוקול, אנו משלבים באופן חדשני תפרים ומחטי טיטניום לקיבוע פנימי יציב במודל השבר הרדיאלי של חולדות. ההחלמה של השברים הוערכה באמצעות מיקרו-CT, ונוירוני DRG ראשוניים בודדו וגודלו לצורך בדיקה נוספת.