מבחן אימונופלואורסצנציה מרובה לצורך הערכה מרחבית של סמני הזדקנות ב-vivo

הניתוח המרחבי של תאים מזדקנים חשוב להבנת תרומתם לתהליכים כמו הזדקנות, סרטן, חיסון והומאוסטזיס התקין של הרקמות. זיהוי תאים זקנים מתבסס על פרופילינג של מספר סמנים ביולוגיים. הדמיית אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס מאפשרת פרופילינג בקצב תפוקה גבוה בתוך חתך רקמה אחד.

כדי להתחיל, יש לוודא כי חלקי הרקמה בעובי 5 מיקרומטר, המוטמעים בפורמלין, מוטמעים בפרפין, או FFPE, בגודל מקסימלי של 4 על 2 סנטימטרים מרובעים מותקנים במרכז על מגגות מיקרוסקופ טעונות חיובית ונראים בבירור בתוך חלון הצפייה של מחזיק השקף ללא כיסוי. בצע את שלבי הכנת הדגימה, בין אם ידנית באמצעות תא הסרה או אוטומטית באמצעות צבע אוטומטי. הניחו את המגלשות המוכנות בתוך מחזיק המחסנית ללא כיסוי.

יישר את הקצוות העליונים והימניים מול העצירות המתכתיות. נעול את המחסנית במקום בשתי הידיים בו זמנית כדי לסובב את הקמיים הפלסטיים למצב סגור של המנעול. וודא שהמגלשה יושבת שטוחה לחלוטין ואינה מתנדנדת בתוך המחזיק.

הנח את ה-ClickWell, הכניס תא מעל הסלייד, וצבוט את הצד בשתי ידיים כדי להגביל לחץ ולמנוע שבירות. טען את פתח הקליק ב-2 מיליליטר של מדיה הרכבה המכילה 50% גליצרול במי מלח מפוזר בפוספט דרך פתח הכניסה. הוסיפו תווית ברקוד לצד השמאלי של השקופית בכל כיוון, ואז המשיכו להדמיה.

לבחירת אזורים וניתוח אוטופלואורסצנציה, פתח את Mx Workflow גרסה 4204, תוכנת רכישת תמונות מולטיפלקס. לחצו על כלים כדי לבחור את פרוטוקול Publisher. בחלון הקופץ של Multiplex Protocol Publisher, הזן את שם הפרוטוקול.

לחצו על Create Setup Round, ואחר כך הוסיפו את סבב הפרוטוקול הבא כדי ליצור מספר סבבים של תיוג ביומרקרים. לחץ על פרסום, ואז בחר אישור בחלון הקופץ. רכוש את ערוץ Cy3 לתמונות H&E וירטואליות.

לחצו על Slide, ואז Create New Batch. לאחר בחירת שם הפרוטוקול, הזן את מזהה השקף. לחץ על Add Slide ואז בחר Create Batch ליצירת תהליך ניסוי במולטיפלקס. פתח את תוכנת הרכישה של Cell DIVE.

לחץ על טעינה כדי לטעון את השקופית למיקרוסקופ. בתפריט הנפתח של הכלים, לחצו על סמל הרשת כדי להגדיר את האזורים הרצויים והשתמשו בכלי Move כדי למקם מחדש את האזורים שהוגדרו. לאחר מכן, השתמשו בכלי Draw כדי לבטל בחירת שדות שאינם נדרשים, תוך הבטחה שלכל שדה תצוגה יש לפחות שני שדות תצוגה סמוכים כדי למנוע בעיות תפירה, ולחצו על Save Regions.

בחלון זרימת העבודה של Mx, לחץ על Viewer QC כדי לפתוח את דף הצופה של Cell DIVE ולהציג את תמונת הרקמה בהגדלה של פי 10. לחץ על אייקון תיקון התמונה כדי לכוון את בהירות התמונה ולחץ על 'שלח בקרת איכות' כדי לבחור 'מעבר וטעינה מחדש של שקופית' בחלון הקופץ. ברגע שהתמונה נטענת מחדש, לחץ על Add ROI כדי לצייר ולהתאים את האזורים המעניינים.

בחר את שדות הראייה הרצויים וחזור על הוספת ה-ROI. לאחר מכן, לחץ על שלח למעבדה. טען את השקופית כדי להתחיל את רכישת התמונה של 20x אוטופלואורסצנטיה.

בתפריט Imaging QC, בחר בתיבת הסימון המתאימה למזהה הספציפי של השקף, ואז לחץ על Viewer QC. התקרב לתמונה הטעונה כדי לסרוק אזורים או ארטיפקטים לא מפוקוסים. בדוק את תמונות הרקע של כל ערוץ, שיוחסר מהאות הביומרקר הסופי. לחץ על 'שלח בקרת איכות', ואז בחר 'מעבר ויציאה' כדי ליצור תמונות רקע.

לפני צביעת סמנים ביולוגיים רציפים, צנטריפוגה את הנוגדנים בעוצמה של 13,000 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להגביל ארטיפקטים. הכינו את תמיסת הנוגדן בדילול של 1 ל-200 בסליין בופר פוספט, או PBS, המכיל 0.3% אלבומין סרום בקר, או BSA. הסר את מדיית ההרכבה על ידי פיפטינג מהפורט של ClickWell.

ושטוף שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של PBS המכיל 0.01% Tween 20 או PBST למשך 5 דקות. הוסף 350 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לפורט כדי להבטיח כיסוי מלא של הדגימה בתוך תא הצביעה. דגרו שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הפיפט את תמיסת הנוגדנים מפורט ClickWell. ולשטוף שלוש פעמים עם 2 מיליליטר PBST למשך 5 דקות. הוסיפו 2 מיליליטר של מדיה להרכבה.

הכנס את מחזיק ה-ClickWell למיקרוסקופ וטען את השקופית כדי להתחיל בהדמיית 20x ביומרקרים. בצע את בקרת האיכות, באמצעות עורך המיזוג ואפשרויות תיקון התמונה, והגיש את הערכת בקרת האיכות של התמונה. הוציא את המדיה המורכבת מהפורט של ClickWell ושוטף שלוש פעמים עם 2 מיליליטר PBST למשך 5 דקות.

הכינו את תמיסת השבלת הצבע טרייה לפני השימוש. לאחר הסרת PBST, הוסיפו 2 מיליליטר של תמיסת נטל צבע לכל שקופה. הדגרה במשך 15 דקות במחזיק המגלשה.

הוציא את תמיסת ההשבתה של הצבע מהפורט של ClickWell ושוטף עם 2 מיליליטר PBST למשך 5 דקות. הוסיפו 2 מיליליטר של מדיה להרכבה והכנסו את מחזיק ClickWell למיקרוסקופ כדי להתחיל הדמיה אוטומטית ספציפית לסבב 20x אוטופלואורסצנציה. התקדמו את תהליך העבודה על ידי העברת שלבי בקרת איכות כפי שמונחים על המסך לאחר סיום העבודה.

חזור על הצביעה הסדרתית, השבתת הצבע והדמיית מולטיפלקס למספר הסמנים הנדרש, והמשך עד לסיום. השתמש בתוכנת HALO לבחירת ערוצים שונים להמחשת מיקום הסמנים באזורים שונים בליבת הרקמה. לחץ על ניתוח ובחר תמונה שלמה כדי לנתח את המדדים הכמותיים של סמנים בודדים.

לחצו על תוצאות כדי לראות את המספר הכולל של התאים בליבת הרקמה שנבדקה ואת תת-הקבוצה של התאים שמבטאים סמנים ספציפיים. בהשוואה לשיטה האוטומטית המבוססת על צביעת שקופיות, שיטת הסרת תא ההסרה הידנית הביאה לתדירות גבוהה יותר של ארטיפקטים של רקמה שמאופיינים במיוחד בהתנתקות רקמה וכן בליבות אובדן או החליקות. כימות שבוצע באמצעות תוכנת פתולוגיה דיגיטלית על רקמת לבלב מייצגת גילה שתאי p16 חיוביים היו קשורים לרמות LB1 נמוכות יותר ולהפך, מה שמראה פרופיל תואם לדפוסי סמנים הקשורים להזדקנות.

מפת חום מנורמלת בציון Z ממחישה את התפלגות הפנוטיפ השלילי של למין-B1 השלילי להזדקנות p16 על רקמות שונות, וחושפת ריכוזים גבוהים של תאי זקנה בריאות, בלוטות יותרת הכליה והיותרת יותרת המוח התואמים לרמות p16 מוגברות וירידה ב-LB1. לעומת זאת, התוספתן, בלוטת הלימפה והטחול הציגו הזדקנות נמוכה, תוך שמירה על ביטוי גבוה של LB1 ו-p16 נמוך. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של שילוב של סמנים ביולוגיים של הזדקנות, מבנים ומערכת החיסון בתוך שקופית מיקרוסקופית אחת.

על ידי שילוב מספר סמנים בתוך דגימה אחת, ניתן לבצע ניתוח מרחבי של ארכיטקטורת הרקמה והתפלגות תאי הזקנה. יישומים עתידיים כוללים פרופילינג רחב היקף של סמנים ביולוגיים של הזדקנות בין סוגי רקמות שונים ואינטגרציה עם אומיקס מרחבי לפתרון טוב יותר של הטרוגניות תאית.