שיטה סטנדרטית לזיהוי ננו-צינורות מנהורים בתאי עור אנושיים ליישומים הנדסת רקמות

פיתחנו שיטות לזיהוי וניתוח אמין של ננו-צינורות המנהרות בין תאי העור האנושיים ולחקור את תפקידם הפוטנציאלי בהתחדשות העור. הפרוטוקול שלנו מיועד לדגימות קבועות או לתאי עור אנושיים ראשוניים. הוא שימושי במחקר הקשור לביולוגיית עור ולרגנרציה של רקמות.

כדי להתחיל, יש להפשיר ולגדל קרטינוציטים ופיברובלסטים דרמליים של בני אדם בצלחות בגודל 60 מ"מ המכילות את מדיום הגדילה המתאים. הוסיפו לתרביות הקרטינוציטים Y-27632 לריכוז סופי של חמישה מיקרומולרים במהלך ההחייאה. שמרו על כל התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עד שהן מגיעות לכ-80%.

לאחר מכן הסר את המדיום מהמנה התרבותית. שטוף את התאים לזמן קצר במיליליטר אחד של PBS כדי לשמור על pH פיזיולוגי ואוסמולריות במהלך הכביסה. שאפו את ה-PBS לחלוטין.

הוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA ופיזרו אותו באופן שווה על פני שטח התא. דגרו את המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1.5 עד 2.5 דקות. החזירו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

הוסיפו שני מיליליטרים של מדיום גדילה כדי לנטרל את הטריפסין. העבר את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט מצינור הצנטריפוגה.

החזירו את כדור התא לתוך מיליליטר עד שניים של מדיום וספרו את התאים באמצעות מונה אוטומטי. לאחר מכן, זרעו 12,000 פיברובלסטים דרמליים או 20,000 קרטינוציטים בכל באר של סלייד תא בן שמונה בארות בנפח סופי של 400 מיקרוליטר. לאחר הזריעה, נערו את התא היטב כדי לפזר את התאים באופן שווה ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-24 שעות.

לאחר הדגירה, ודאו אם המפגש התאים נמצא בסביבות 80% תחת מיקרוסקופ. כאשר התרביות מגיעות ל-80%, הוסף בעדינות כמה טיפות של תמיסה קיבועה, אחת ישירות לבאר התא, כדי להקדים את התאים. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר במשך ארבע דקות, כדי להבטיח שהקיבע יתפשט באופן שווה מבלי להפריע לתאים.

לאחר מכן שואבים את הפרה-פיקטיב מהבאר והוסיפו 140 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע טרייה, כדי להבטיח כיסוי מלא של פני הבאר. דגרו את המגלשה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את הקיבסטיב מהתא ומוסף 140 מיקרוליטר של כלוריד אמוניום 100 מילימולר כדי לכבות אלדהידים שנותרו.

דגרו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 30 דקות. שטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS למשך 30 שניות כל אחת בטמפרטורת החדר. במהלך כל שטיפה, יש פיפט עדין על הבופר לאורך דופן התא כדי למנוע שטיפת תאים או נזק לננו-צינורות המנהרות.

דגרו את התאים ב-140 מיקרוליטר של דילול נפח לנפח של 1:300 של אגולוטינין קמח חיטה ב-PBS. בצע את הדגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לתייג גליקופרוטאינים של ממברנת הפלזמה לצורך המחשה של ננו-צינורות מנהורים שמקורם בממברנה. אחר כך שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS למשך 30 שניות כל אחד.

לאחר מכן דגרו את התאים עם 140 מיקרוליטר של פאלואידין קונג'וגט מדולל אחד עד 250 פעמים ב-1% BSA למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS, דגרו אותם עם 140 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ובחושך. לבסוף, הוסיפו שתיים עד שלוש טיפות של מדיום התקנה לכל באר ודגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

אחסן את השקופיות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך לפחות 20 דקות עד להדמיה. בתרביות פיברובלסטים דרמליים, נצפו ננו-צינורות מנהורים כהקרנות ארוכות ודקות שמחברות תאים סמוכים עם ממברנות שמוצבעות באגלוטינין של נבט חיטה ו-F-אקטין מסומנים בפאלואידין. בתרביות קרטינוציטים אפידרמליים, נצפו גם ננו-צינורות מנהורים עם בליטות חיוביות אופייניות ל-F-אקטין מגשרים בין תאים סמוכים.

בתרבויות משותפות של פיברובלסטים דרמליים וקרטינוציטים אפידרמליים, ננו-צינורות מנהורים זוהו בעקביות בין פיברובלסטים דרמליים לקרטינוציטים אפידרמליים, כפי שהוצגו באמצעות צביעת ממברנה וציטוקרטין 5. ננו-צינורות המנהרות בתרבות המשותפת הציגו ארגון תאי שלד מגוון, כאשר דוגמאות הכילו רק F-אקטין, גם הסיבים, F-אקטין עם אלפא-טובולין חלקי, או רמות אלפא-טובולין נמוכות. האתגר המרכזי הוא שימור המנהרה בננו-צינורות.

זה דורש קיבוע עדין, תזמון נכון, ושימוש בתוספים קבועים שהוכנו זה עתה. באמצעות הפרוטוקול שלנו, ניתן למדוד את ננו-צינורות המנהרות בתנאי תא משתנים כדי לחקור את הפונקציות הפוטנציאליות שלהם. בעתיד, נסמן את המטוכונדריה פלואורסצנטית כדי לחקור את העברתן דרך ננו-צינורות מנהורים.