הדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית של מולקולות DNA באמצעות ניגוד פנימי
6 במרץ 2026
פרוטוקול זה מספק פעולות מפורטות על הכנת דגימות, איסוף נתונים וניתוח ספקטרום פלואורסצנציה פנימי של DNA.
המחקר שלנו מציג את הפרוטוקול הראשון למדידת ספקטרום פלואורסצנטי פנימי של מולקולות DNA, המאפשר חקירה של תכונות אופטיות טבעיות ומאפיינים הקשורים לאישור רצפים. פרוטוקול זה מנצל פלואורסצנציה אנדוגנית להדמיה ספקטרוסקופית של DNA, תוך הימנעות מהפרעות נגרמות בתיוג, שגיאות קישור וצפיפות מסומנת לא עקבית בשיטות קיימות. כדי להתחיל, יש להמיס את דגימת ה-DNA במים דה-יוניים ללא נוקלאז לריכוז סופי של 100 מילימולר.
הכינו חמישה אליקוטים של מיקרוליטר של תמיסת ה-DNA כדי למזער מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים. אחסן את הצינורות הנוספים עם תמיסת המקור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בעזרת מגבון מעבדה, נקה בעדינות מגבון זכוכית.
הפיפט חמישה מיקרוליטרים מתמיסת ה-DNA של 100 מילימולר על סלייד הזכוכית הנקייה הטרייה ונתן לדגימה להתייבש במשך שעה עד שלוש כדי ליצור ג'ל DNA. בתוך מכסה אדים, יש להכין או את בופר הבטא-מרקפטואתנול או את בופר ההדמיה של DABCO לתמיכה בהחלפת תמונות סטוכסטית של מולקולות DNA. פיפט חמישה מיקרוליטר של בופר ההדמיה על ג'ל ה-DNA והניח כיסוי מעל הדגימה.
אם יש בועות בתוך הדגימה המכוסה, השתמשו בפינצטה כדי להסיר אותן. השגת מערך ננו-חורים מיוצר הכולל חורים בקוטר 100 ננומטר, במרווחים של ארבעה מיקרומטרים, מסודרים בשמונה שורות וחמש עמודות. הפעל את מערכת ה-sSMLM והכניס מסנני רוחב פס צרים ישירות מול המצלמה.
הנח את דגימת הכיול תחת מיקרוסקופ והדליק את מנורת המיקרוסקופ כדי להאיר את הדגימה. הגדר את זמן החשיפה ל-200 מילישניות לכל המסננים, אבל שנו ל-2,000 מילישניות עבור מסנן 750 ננומטר. לך ל-Acquire ו-Time Lapse מהיר כדי להתאים את מספר הפריימים ל-10 לכל פילטר.
לאחר הכיול, טעינו את דגימת ג'ל ה-DNA על שלב המיקרוסקופ כאשר צד הכיסוי פונה אל האובייקטיב ופתחו את תוכנת המצלמה לאיסוף נתונים. זהה את מיקום ה-Z המתאים באמצעות מערכת מעקב פוקוס אוטומטית וכיוון את המיקוד עד שנראה הבהוב סטוכסטי ברור. ודא שהאובייקטיב אינו נוגע בקצה הכיסוי כדי למנוע דליפת בופר לשמן הטבילה והפרעה למעקב.
רכוש כ-10,000 עד 30,000 פריימים עם עוצמת תאורה רצויה וזמן חשיפה של 30 מילישניות. לאחר רכישת הנתונים, אפשר לתוכנה לשמור את הנתונים בפורמט nd2 כברירת מחדל. השליך את מגלש הזכוכית בפח אשפה מאושר המיועד לזכוכית שבורה או פריטים חדים.
השליכו את כל המאגרים שנותרו למיכל הפסולת הנוזלית הכימית המיועד בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. פתח את Fiji והשתמש בתוסף ה-bioformats כדי לטעון את ערימת התמונה הגולמית שנרכשה מדגימת ה-DNA. בחר תמונה ואחריה מחסניות, Z Project, ובחר עוצמה מינימלית כסוג ההקרנה כדי ליצור את ההקרנה המינימלית של ערימת התמונה הגולמית.
בחר את מחשבון התמונה וחסר את ההקרנה המינימלית מערימת התמונה הגולמית. שמור את מערך הנתונים המוסר ברקע כקובץ TIF לניתוח ספקטרלי. לאחר מכן, בצע זיהוי לוקליזציה על ערימת תמונות גולמיות מסדר אפס באמצעות תוסף ThunderSTORM גרסה 1.3.
הגדר את הסף ל-1.2 פעמים גל סטיית התקן. F1, התקנת רדיוס לשלוש, וסיגמא ל-1.5 כדי לשחזר את תמונת הסדר האפס ולהוציא קואורדינטות אירוע פליטה. עבור מחסנית התמונות הגולמיות מסדר אפס שנחתכה, בחר תוסף ואחריו ThunderSTORM והפעיל ניתוח.
השתמש בפיג'י ובתוכנת הקוד הפתוח RainbowSTORM עם גרסת MATLAB החדשה מ-2020b כדי לעבד את נתוני הכיול ולקבל את הקשר בין הזזות אופקיים ואנכיות ואורכי גל. בצע זיהוי לוקליזציה על תמונות הכיול של חמשת אורכי הגל באמצעות תוסף ThunderSTORM. הגדר את הסף לחמש פעמים סטיית תקן, גל.
F1, התאמת רדיוס לשלוש, וסיגמא ל-1.5 לשחזור לוקאליזציות ננו-חורים בסדר אפס ולוקאליזציות ספקטרליות מתאימות בסדר ראשון. קבל תמונה ממוצעת של כל נתוני כיול ומתאים את הסף בטווח של חמש עד עשר פעמים גל סטיית התקן. F1 ועד 80 לוקליזציות מתקבלות לכל תמונת כיול.
הרץ את RainbowSTORM ולחץ על גלישה תחת כיול ספקטרלי כדי לטעון את קבצי CSV לכל אורך גל כיול. לאחר מכן לחץ על שמור קובץ כיול כדי לאחסן את קובץ הכיול. השתמש בגרסה 3.11.7 מותאמת אישית של סקריפט פייתון כדי לחלץ את כל נתוני הספקטרום המלא.
לאחר מכן הגדר את מסלולי הקבצים הנכונים בסקריפט Python עבור ערימת התמונה המוחסרת ברקע בפורמט TIF משלב החיסור הקודם של הרקע. הגדר את נתיב הקובץ עבור קובץ CSV הלוקליזציה שנוצר משלב ניתוח הלוקליזציה וקובץ הכיול בפורמט MAT שנוצר משלב הכיול. לאחר מכן קבע את ההזזה האופקית ל-925 עד 984 פיקסלים עבור נתוני 532 ננומטר שנאספו באמצעות DWP תלת-ממדי התואם לחלון ספקטרלי של 525 עד 750 ננומטר, כדי להבטיח כיסוי מעבר לטווח המסננים של 590 עד 650 ננומטר.
כוונן את ההזזה האנכית ל-23 פיקסלים עבור נתוני 488 ננומטר ו-532 ננומטר שנאספו באמצעות DWP תלת-ממדי, בהתבסס על עקומת הכיול הספקטרלית שהושגה באמצעות RainbowSTORM. לבסוף, ליניאריזציה של הספקטרום הלא-ליניארי באמצעות התאמת פולינומים מסדר שלישי לניתוח השוואה וסיווג מאוחר יותר. הכיול הספקטרלי בוצע, מה שאפשר מדידת ההזזות האופקיות והאנכיות המקבילים בין התמונות מסדר אפס לתמונות מסדר ראשון.
זה אפשר מיפוי עקומת כיול בין מיקום הפיקסל לאורך הגל. הספקטרום הלא ליניארי והספקטרום הליניארי המומר תחת עירור של 532 ננומטר התקבלו עבור GC alter, המתייחס לסוג של מולקולת DNA דו-גדילית. העקומה הירוקה ייצגה את הספקטרום הממוצע.
ספקטרום הפליטה הליניארית הלא-ליניארית וההמומרת של A10C10, סוג של מולקולת DNA חד-גדילית, התקבלו תחת עירור של 488 ננומטר, כאשר העקומה הכחולה מייצגת את הספקטרום הממוצע. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים למדוד ספקטרום פלואורסצנטי פנימי של מולקולות DNA חד-גדיליות וכפולות מסונתזות באמצעות הדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית. איתור מדויק של מיקום Z הוא קריטי, שכן דגימות ג'ל DNA חסרות מידע מבני ודורשות מיקוד מדויק לצפייה בהבהובים סטוכסטיים.
עבודות עתידיות יכולות להתרחב למדידת פלואורסצנציה פנימית של ה-RNA והחלבון, תוך שילוב מודלים חישוביים לחיזוי רצפים ודימות כרומטין ללא תווית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדימות גנומי in situ ללא סימון של מולקולות DNA באמצעות מיקרוסקופיית לוקליזציה של מולקולה בודדת ספקטרוסקופית (sSMLM). על ידי ניצול הפלואורסצנציה העצמית של ה-DNA, השיטה מאפשרת דימות ברזולוציה-על ואנליזה ספקטרלית ללא צורך בסמנים פלואורסצנטיים חיצוניים, ובכך משמרת תכונות מולקולריות טבעיות ומונעת ארטיפקטים הקשורים לסימון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוסקופיה ברזולוציה-על
- דימוג גנומי
- ספקטרוסקופיה
- ביופיזיקה
רקע
- דימות ברזולוציה-על מסורתי מסתמך על סימון פלואורסצנטי, שעלול לשבש את התפקוד התאי ולהוביל לאי-דיוקים.
- קיימים צרכים לשיטות דימות ללא סימון לצורך ויזואליזציה מדויקת ובצפיפות גבוהה של כרומטין ו-DNA בקנה מידה ננומטרי.
- פלואורסצנציה אינהריטית של DNA מציעה פתרון פוטנציאלי לדימות ברזולוציה גבוהה שאינו פולשני.
- שיטות קיימות מתקשות בהשגת צפיפות סימון עקבית ועלולות שלא ללכוד את התכונות האופטיות הטבעיות.
מטרת המחקר
- פיתוח והדגמה של פרוטוקול למדידת ספקטראי פלואורסצנציה אינטרינזיים של מולקולות DNA באמצעות sSMLM.
- מתן אפשרות لديמות ברזולוציה גבוהה ולניתוח ספקטרלי של DNA בעל גדיל אחד או שניים, ללא שימוש בסמנים.
- אספקת זרימת עבודה להכנת דגימות, רכישת נתונים וכיול ספקטרלי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של דגימות ג'ל DNA על ידי ייבוש תמיסות פולינוקליאוטיד על שקופיות זכוכית.
- יישום של תחבירי דימיון (beta-mercaptoethanol או DABCO) לתמיכה במיתוג פוטוני סטוכסטי.
- רכישת נתוני sSMLM, כולל תמונות מסדר אפס (מרחביות) ותמונות מסדר ראשון (ספקטרליות).
- כיול ספקטרלי באמצעות מערכי חורי-ננו (nanohole arrays) ואורכי גל עירור מרובים.
- עיבוד נתונים באמצעות Fiji, ThunderSTORM, RainbowSTORM וסקריפטים מותאמים של Python לצורך לוקליזציה ומיצוי ספקטרלי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של ספקטראי פליטה פנימיים ממולקולות DNA חד-גדיליות וכפול-גדיליות כאחד.
- הדגמה של הבדלים ספקטרליים בין סוגי DNA (למשל, GC alter ו-A10C10) תחת אורכי גל עירור שונים.
- ביסוס של עקומת כיול הממפה מיקומי פיקסלים לאורכי גל פליטה.
- הפרוטוקול מאפשר לוקליזציה מדויקת וניתוח ספקטרלי ללא סימון חיצוני.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר דימוי ספקטרוסקופי ברזולוציה גבוהה (super-resolution) של DNA ללא סימון, תוך שימור התכונות המולקולריות הטבעיות.
- הוא מתגבר על מגבלותיהם של שיטות סימון מסורתיות, כגון הפרעה למבנה וצפיפות לא עקבית.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול דימוי פלואורסצנציהו内在ית (intrinsic) של RNA וחלבונים, ומחקרי כרומטין ללא סימון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
דימוי ספקטרוסקופי ברזולוציה-על (super-resolution) של DNA באמצעות פלואורסצנציה פנימית מאפשר ניתוח בעל רזולוציה גבוהה של חומר גנומי ללא סימון, ובכך מבטל ארטיפקטים וחוסר עקביות הנובעים מסימון חיצוני. יכולת זו תומכת בגילוי מוקדם ובתיקוף של מטרות (target validation) על ידי שימור התכונות המולקולריות הטבעיות ואספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי ומפחיתה סיכונים בפרשנות ביולוגית בנקודות ציון קריטיות בתהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של מבנה ורצף ה-DNA ללא הפרעה הנגרמת מסימון.
- תומך בתיקוף תפקודי של המטרה על ידי חשיפת תכונות אופטיות טבעיות של DNA חד-גדילי וכפול-גדילי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנקודת מבט מכניסטית על ידי אספקת נתונים ספקטרליים כמותיים בעלי נאמנות גבוהה.
- משפר את הביטחון החיזואי עבור מחקרים גנומיים ומחקרי כרומטין המשכיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות DNA מאומתות ללא סימון עבור תהליכי עבודה של רזולוציה-מארבית (super-resolution) בהמשך השלב.
- מספק ספקטרום פליטה כמותי הניתן לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר דימיון בצפיפות גבוהה ובקנה מידה רחב, המתאים ליישומים של סריקה.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות רצף והרכב ה-DNA על תכונות אופטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם גילוי ביומרקרים תרגומיים על ידי שימור מאפייני ה-DNA הטבעיים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור דימות של כרומטין ללא סימון.
- מפחית את הסיכון לפרשנות ביולוגית שגויה במודלים פרה-קליניים עקב ארטיפקטים של סימון.
- תומך בהרחבה עתידית למחקרי פלורסצנציה אינהרנטית של RNA וחלבונים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית דרך זיהוי מובילים (lead identification) ומחקרי טרום-קליניקה, ובכך הוא תומך במטרות מכניסטיות ותרגומניות כאחד.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים על ידי מדידה של פלואורסצנציהו intrinsic של DNA ומאפיינים ספקטרליים התלויים ברצף.
- סריקה: מספקת דגימות DNA הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה לצילום ברזולוציית-על (super-resolution) בסריקה גבוהה.
- אנליטיקה: מספקת קריאות מרחביות וספקטרליות כמותיות להשוואה חסונה של סוגי DNA ותנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקלה על צילום כרומטין ללא סמנים, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים ובהמשכיות תרגומית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת צילום ללא סמנים הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרי חומצות גרעין וכרומטין מגוונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בדימות DNA.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה ושיפור השחזוריות על ידי ביטול השונות בסימון.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים כמותיים נקיים מארטפקטים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודף מותאם סיכון וקידום של תוכניות מחקר גנומיות ומחקרי כרומטין.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית רזולוציה-על (super-resolution microscopy) ובניתוח ספקטרלי.
- מחייב גישה לציוד sSMLM, לכלי כיול ספקטרליים ולתוכנה מתקדמת לניתוח תמונות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להכנת דגימות ולעיבוד נתונים.
- התאמה למערכות אחרות של חומצות גרעיניות או חלבונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מיקוד וכיול מדויקים הם קריטיים בשל היעדרה של מאפיינים מבניים בג'לים של DNA.
