תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

אלקטרפורציה של תא בודד היא טכניקה ייעודית המאפשרת החדרת DNA או מקרו-מולקולות אחרות לתאים בודדים בתוך רקמה שלמה, כולל בהכנות in vivo כאשר היא משולבת עם טכניקות מתקדמות של דימוי in vivo. אלקטרפורציה של סמנים פלואורסצנטיים לתא בודד מאפשרת ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיה תאית, צמיחת תאים ואירועים בין-תאיים בפרקי זמן הנעים בין שניות לימים. בסרטון זה, פרטנו את הפרוצדורה לאלקטרפורציה של צבע פלואורסצנטי או DNA פלסמי לתאי עצב בתוך מוח שלם של ראשן XUS, ומציגים דוגמאות של דימוי חי של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית.

שלום. שמי Eth Haa ואני עובד במעבדה של ד"ר Kurt Haass במרכז לחקר המוח באוניברסיטת בריטיש קולומביה. היום אדגים כיצד לבצע אלקטרופורציה ממוקדת של תאים בודדים בנוירונים בתוך המוח השלם של ראשן *Xenopus laevis* אלבינו.

היתרון הבולט של טכניקה זו הוא שניתן לבצע מניפולציות ניסיוניות על תאים בודדים תוך השארת הרקמה הסובבת ללא שינוי, ובכך להבדיל בין השפעות אוטונומיות של התא לאלו הנובעות מטיפולים גלובליים. השלב הראשון כולל ייצור של מיקרו-פיפטים עם קוטר קצה וזווית היטיה מתאימים, ולאחר מכן טעינת חומר ההעברה לתוך המיקרו-פיפט. לאחר מכן, יש להרדיש את מאגרי ה-TA ולהעבירם לתא הפעלה, ולאחר מכן להחדיר את המיקרו-פיפט לתוך המוח ולהפעיל רצף של פולסי מתח.

לבסוף, נוירונים מסומנים מדמיינים באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולים. טכניקה זו תוצג עבור ראשנשאיים. סימון של תא בודד יכול לשמש גם במערכות מודל אחרות וכן בהכנות ex vivo.

עם זאת בראשנו, נתחיל בתהליך. אלקטרופורציה של תא בודד מתמקדת בתא בודד באמצעות אלקטרודת מיקרו-פיפט מזכוכית משוכה, המגבילה את השדה החשמלי לתא בודד שנמצא במגע עם קצה הפיפט. הגאומטריה הפיזיקלית של קצה הפיפט היא מאפיין קריטי המשפיע ישירות על הצלחת הטכניקה.

משתמשים במכשיר מתיחה (puller) מדגם P 97 כדי ליצור מיקרו-פיפטות מזכוכית בורוסיליקטת בעלת קוטר חיצוני של 1.5 מילימטרים וקוטר פנימי של 0.75 מילימטרים, המכילה חוט פנימי להקל על מילוי הקצה ללא בועות אוויר. קצות פיפטה שנמצאו כיעילים ביותר עבור אלקטרופורציה של תא בודד הם בעלי קוטר קצה של 0.5 עד 1 מיקרון וזוויות היטיה הגדולות מ-10 מעלות. לאחר מתיחת המיקרו-פיפטה מזכוכית, ניתן להטעין חומר בתמיסה לתוך הפיפטה באמצעות מילוי אחורי או בעזרת מזרק טעינה.

בהדגמה זו, נסמן פלורוצנטית נוירונים בודדים באמצעות צבע פלורוצנטי המוצג כאן או באמצעות פלסמיד המקודד ל-GFP (חלבון פלורוצנט ירוק). יש לסובב תמיסות אלו במ centriuge קצר במהירות גבוהה כדי להפחית את כמות השאריות החלקיקיות שנכנסות לפיפט. מכיוון שדבר זה יעלה את הסיכוי לסתימה של הקצה עבור משתמשים חדשים, מומלץ להתחיל עם צבעים פלורוצנטים, שכן ניתן לראותם בקלות תחת מיקרוסקופ פלורוצנטי מהפוכ (epi fluorescence).

דבר זה מאפשר ויזואליזציה של הקצה בתוך הדגימה ומספק משוב ישיר לגבי התקנת הציוד בצורה נכונה והתאמת קצה הפ pipette. עבודה טובה. כעת, לאחר שהכנו את המיקרו-pipette, נוכל להמשיך לביצוע הפרוצדורה לאלקטרופורציה של תא בודד.

הציוד החשמלי הדרוש לטכניקה זו הם סטימולטור ואוסצילוסקופ, ותומך פיפט המצויד בחוט כסף להחדרה לתוך הפיפט. כאן אנו משתמשים ב-ax separator 800 A של חברת axon instruments, אך ניתן להשתמש גם בסטימולטורים נפוצים כגון grass SD nine. ה-ax separator מחובר ל-head stage, המשמש כממשק בין ה-ax separator לבין אלקטרודת חוט הכסף.

ההארקה החיצונית של השפשוף היא פשוט חוט כסף ששומר על מגע אלקטרוני עם השפשוף. במהלך האלקטרופורציה, שלב הראש (head stage), מוליך ההארקה וההארקה החיצונית של השפשוף מחוברים כולם לכניסת האוסצילוסקופ. לאחר שהציוד החשמלי הוגדר, ניתן להניח את הפיפטה במחזיק הפיפטות.

יש להרכיב את מחזיק הפ pipette על מיקרו-מניפולטור בעל שלושה צירים המאפשר תנועה מדויקת. אלקטרופורציה של תא בודד דורשת מיקרוסקופ בעל מרחק עבודה גדול, שכן הדבר מעניק מרחב תמרון רב יותר ומאפשר להביא את ה-pipette בזווית של כ-30 עד 45 מעלות.

לאחר שהציוד חובּר כראוי, ניתן להתחיל בהליך אלקטרופורציה של תא בודד. תחילה, השפשפונים מורדמים על ידי טבילה ב-0.02% MS 2, 2 2, והשפשפונים בדרך כלל מורדמים באופן מלא. לאחר כחמש דקות, שפשפון בודד מועבר לתא האלקטרופורציה.

באמצעות פיפט העברה מפלסטיק, ניתן להכין את התא בקלות במעבדה על ידי חריטת חלל בצורת ראשן בבלוק סיליקון קטן והחדרת חוט הארקה מכסף כך שיהיה במגע עם עור הראשן כאשר הוא נמצא בתא. לאחר מכן, שימוש במברשת צבע למיקום הראשן יבטיח שהצד הגבי שלו פונה כלפי מעלה. לאחר מכן מורידים את המיקרו-פיפט עד שהוא בא במגע עם העור הסמוך ישירות לאזור העניין.

הנמכה מתמשכת של הפיפטה תגרום תחילה לשקיעה של העור ולאחר מכן תעבור אל הרקמה שמתחתיו. כאן אני מכוון לעמוד האופטי של מוח ה-tadpole. אני שואף להגיע באופן ספציפי לאזור שכבת גופי התא.

אם אתם משתמשים ב-xi, ניתן לנטר את ההתנגדות של הפיפטה ברקמה. בדרך כלל, התנגדות של 10 עד כ-40 Mega ohms עובדת היטב.

ההתנגדות של הפיפטה היא מדד טוב לשאלה האם קוטר העטיף קטן מדי או האם העטיף סתום, ובמקרה זה ההתנגדות תהיה גבוהה. מנגד, אם קוטר העטיף גדול מדי או אם העטיף שבור, התנגדות הפיפטה תהיה נמוכה. לא ניתן למדוד את ההתנגדות המוחלטת של הפיפטה בעת שימוש בסטימולטור קונבנציונלי.

קריאת האוסצילוסקופ היא מדד עקיף להתנגדות הפיפטה עבור צבעי דקסטראן פלואורסצנטיים. הגירוי מורכב מרצף של פולסים של גל ריבועי חיובי במשך 10 millisecond המוחל בתדר של 300 hertz. פולסים בודדים הם במשך 300 microseconds ומועברים במתח של 50 volts.

בעזרת הגדרות אלו, הצבע הפלורסצנטי נישלח מהקצה, כפי שניתן לראות בעת יישום גירוי לאחר בדיקה חשמלית. לאחר מכן, השואב נסוג והתהליך חוזר על עצמו באתרים שונים בתוך הרקמה כדי לשפר את התוצאה. בזמן הגשת רכבת פולסי מתח, יש לנטר את האמפליטודה של הפולסים שהתקבלו באוסצילוסקופ ולהתאים את האמפליטודה לטווח שבין 1 ל-1.5 microamps במידת הצורך.

אם אמפליטודת הפולס נשארת נמוכה לאחר העלאה משמעותית של המתח, או יורדת במהלך הפרוצדורה, הדבר מרמז במידה רבה שהטיפ סתום או שקוטר הטיפ קטן מדי. מצב זה עלול להיות מתסכל כאשר הוא קורה. מנגד, אם האמפליטודה נשארת גבוהה לאחר הפחתה משמעותית של המתח המופעל, או עולה במהלך הפרוצדורה, הדבר מצביע בבירור על כך שהטיפ רחב מדי, שבור, או שהטיפים נשברים.

לעיתים אני הופך רגשני ועצוב מאוד. כפי שצוין קודם לכן, היתרון בשימוש בצבעים פלואורסצנטיים הוא שניתן לבדוק באופן מיידי אם תאים בודדים עברו אלקטרופורציה באמצעות פרמטרי הגירוי הנתונים. אם התאים נראים עמומים מאוד או אם לא סומנו תאים, יש להתחיל בהעלאה הדרגתית של כל פרמטר גירוי באופן עצמאי עד שהתאים המסומנים נראים כסומנים בבהירות כך; ראיית תאים מסומנים היטב משמחת אותי מאוד.

מצד שני, אם נראה כי תאים רבים סומנו, יש להפחית בהדרגה את פרמטרי הגירוי עד שייראה כי תא בודד סומן בצורה בהירה, בדומה לתא זה. ראיית תאים בעלי סימון בהיר היא מספקת מאוד. במקרה של DNA פלסמידי, רכבות הפולסים שבהן נעשה שימוש הן פולסים שליליים במשך 1 millisecond המוגשים ב-300 hertz, ומשך הרכבת הוא 500 milliseconds.

לאחר האלקטרופורציה, מוביאים את זנבי השלשולים (TA poles) לתמיסת גידול רעננה, שבה הם מתאוששים במהירות מההרדמה. בדרך כלל, לאחר ביצוע הפרוצדורה ל-50 עד 100 זנבי שלשולים, ניתן להמשיך לסריקה שלהם, אותה אראה לכם כעת. לפני תחילת ניסויי הדימוג, מומלץ לבצע סריקה מהירה של השלשולים שעברו אלקטרופורציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence) זקוף.

על מנת לקבוע אילו ראשנשנים מכילים נוירונים המתאימים לדימוג, מרדימים את הראשנשנים ולאחר מכן מניחים אותם בתא סיגר ומכסים בזכוכית כיסוי. לאחר מכן, בוחנים במהירות את מוחות הראשנשנים תחת תאורה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית כדי לקבוע אם קיימים נוירונים בודדים המסומנים פלואורסצנטית. שימו לב כי חשיפה מרובה לתאורה האפי-פלואורסצנטית תגרום לרעילות פוטו-כימית העלולה להרוג את התאים המסומנים. לפיכך, יש להשתדל להמזער את משך הזמן שבו התאים חשופים לתאורה הפלואורסצנטית.

במקרה של צבעי דקסטראן, ניתן לבצע סריקה כבר 30 דקות לאחר האלקטרופורציה. עם זאת, מצאנו שפרקי זמן ארוכים יותר קשורים לרמות פלואורסצנציה נמוכות יותר של הרקע. במקרה של פלסמיד, סריקת DNA מבוצעת בדרך כלל לפחות 12 שעות לאחר האלקטרופורציה.

אנו משתמשים באופן שגרתי באלקטרופורציה של תא בודד כדי לסמן באופן פלואורסצנטי נוירונים בתוך הטקטום האופטי של השבב. מיקרוסקופ הדו-פוטון שלנו נבנה בהתאמה אישית, והוא מורכב ממיקרוסקופ קונפוקאלי Olympus FV 300 וממקור אור לייזר Chameleon XP. בדרך כלל אנו משתמשים באורך גל של 910 nanometers כדי לדגום פלואורסצנציה ירוקה.

לאחר שמצאנו ראשן עם נוירון AL בודד המסומן ומיקמנו אותו במערכת הדימיון בדו-פוטון שלנו, אנו ממשיכים בביצוע דימיון פוטוני במרווחי זמן (time lapse) של נוירונים תחושתיים לאורך פרקי זמן שונים. הדבר מאפשר לנו לצפות בדפוסי הגדילה הדינמיים של העצים הדנדריטיים של תאי AL. כאן אנו רואים דוגמה לנוירון המבטא GFP שסומן באמצעות אלקטרופורציה של תא בודד.

תמונה זו צולמה באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo במטרה לכמת צמיחה נוירונלית. בדרך כלל נוצרות שחזורים תלת-ממדיים שלד (Skeletonized) עבור כל תמונה נוירונלית. דימות Time-lapse במרווחי זמן ממושכים מספק תובנה לגבי ההשלכות ארוכות הטווח של מניפולציה ניסויית.

כאן אנו רואים נוירון לא בוגר המבטא GFP, אשר צולם מדי יום לאורך ארבעה ימים, במהלך התפתחות העץ הדנדריטי שלו. תמונות אלו צולמו באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים ומוצגות כהשלכות Z. דימוי time-lapse מהיר מאפשר לנו לצפות באופיים של תהליכים דינמיים יותר של צמיחה נוירונלית, כולל היווצרות ונסיגה של פילופודיה דנדריטים.

סרטון זה מציג נוירון בוגר יחסית המבטא GFP, אשר צולם בתלת-ממד בכל שתי דקות במשך שעה. זוהי דוגמה לנוירון לא בוגר המבטא GFP, אשר צולם בכל חמש דקות במהלך שעה. נוירונים צעירים הם דינמיים מאוד ומראים צמיחה נרחבת של ענפים ונסיגה של ענפים.

תצפית מוקרבת של נוירון זה, המבטא GFP, מראה הוספה ונסיגה מתמדת של פילופודיה דנדריטיים, המאפיינים נוירונים בשלבי התפתחות במערכת זו. השקיפות של השבתי האלבינו והנגישות של מוחו הופכות את מערכת מודל זו למתאימה באופן אידיאלי להדמיה של צמיחה נוירונלית ושל אירועים תוך-תאיים בתוך אורגניזם חי. אלקטרופורציה של תא בודד מאפשרת לנו להדגים את צמיחתו של נוירון בודד ולבצע מניפולציות אוטונומיות לתא בתוך מוח שאינו שונה בשאר חלקיו.

הצגנו בפניכם כיצד לבצע אלקטרופורציה של תאים בודדים ב-zap lavis tat poles, אם כי התמקדנו כאן באלקטרופורציה ב-TA poles. טכניקה זו שימשה באורגניזמים אחרים, וכן בחתיכות של היפוקמפוס ובתרביות תאים מופרדים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שאתם מעדכנים ללא הרף את טיפי הפפיטה ואת פרמטרי הגירוי כדי לשמור על תפוקה גבוהה.

זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.