In-Vitro ניתוח פונקציונלי של תאי T רגולטוריים: התמקדות בהתרבות ובהתמיינות

המעבדה שלנו חקרה התמיינות, מטבוליזם ואינטראקציה של תאי T. Treg משפיע על הדדי תאי T, שומר על הומאוסטזיס חיסוני, מה שהופך את מחקר ה-Treg לקריטי לטיפול במחלות אוטואימוניות ודלקתיות. בדיקות הדיכוי המסורתיות של Treg במבחנה התעלמו מהשפעות המתווכות על ידי Treg ומהתמיינות תאי T אפקטורית.

פרוטוקול זה מעריך הן התפשטות והן קיטוב בו-זמנית. כדי להתחיל, יש להכין תאי T נאיביים, תאי T רגולטוריים או מועשרים ב-Treg, ותאים לא חיוביים ל-CD4 העשירים באנטיגן. צנטריפוגה את המתלה הנאיבית של תאי T חיובי CD4 ב-350G למשך שבע דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט כדי לקבל את כדור התא.

דילל את צבע התרבות התאים eFluor 450 ב-PBS כדי לקבל ריכוז של 20 מיקרומולר בטמפרטורת החדר. הוסיפו 0.5 מיליליטר PBS לאחד כפול 10 לכוח של שבעה תאים לצינור. שמור על הצינור מוטה בערך ב-45 מעלות ותליית בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 50 פעמים.

לאחר מכן, הוסף במהירות נפח שווה של תמיסת צבע התרבות התאים לתוך תליית התא כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרומולר. החזק את הצינור בזווית של 45 מעלות ופיפט על התאים כדי לערבב אותם היטב עם צבע התרבות התאים. עטוף מיד את צינור הצנטריפוגה בנייר אלומיניום כדי להימנע מחשיפה לאור.

דגרו בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות תוך כדי מערבולת עדינה כל חמש דקות כדי למנוע הצטברות תאים. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים מקורר מראש לצינור הצנטריפוגה וסובבו בעדינות את התאים כדי לסיים את הצביעה. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים וזרקו את הסופרנטנט.

כדי לשטוף את התאים, הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים מקורר מראש לגלגלת התא. חזור על הצנטריפוגה ותשהה את הכדור ב-5 מיליליטר של מדיום גידול. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגות את התאים והשלים אותם בנפח מתאים של מדיום תרבית כדי להגיע לריכוז תאים של כפול 10 לכוח של שישה תאים למיליליטר.

תשאירו את הצינור על קרח. חשב את מספר הדגימות הנדרש לתרבות התאים. הכינו כמות מתאימה של מדיום תרבית תאים המכיל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר נוגדן CD3 נגד עכבר או ציטוקינים אינדוקציה מתאימים.

קח תאי T נאיביים מוכנים ותאים מועשרים ב-Treg ומערבל אותם. הוסף 100 מיקרוליטר של תאי T חיוביים CD45.2, תאי T נאיביים חיוביים ל-CD4, ו-100 מיקרוליטר של תאים שאינם חיוביים עם APC חיובי CD45.1 לפלטת 48 הבאות. העבר 100 מיקרוליטר של תאים מועשרים ב-Treg חיובי ל-CD45.1, חיובי CD25 לבארות הניסוי ו-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לבארות הביקורת.

לאחר מכן פיפטה של 100 מיקרוליטר מדיום תרבית המכיל נוגדן CD3 נגד עכבר ו-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית המכיל את הציטוקינים האינדוקציה המתאימים לכל באר. הוסף PBS לבארות הריקות שנותרו כדי לשמור על הלחות של הפלטה ולהפחית את השפעות הקצה. דגרו את לוח 48 הבארות באינקובטור פחמן דו-חמצני 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

יש פיפט עדין על התאים המתורבתים כדי להחזיר אותם ולהעביר את תליית התא לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים והסר את הסופרנטנט. הוסף 500 מיקרוליטר מדיום תרבית תאים המכיל פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט, יונומיצין ומעכב העברת חלבון GolgiPlug לכל צינורה.

מערבולת עדינה כדי להחזיר את התאים ולדגור אותם באינקובטור פחמן דו-חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 50 מיקרוליטר של PBS המכיל בדיקה אחת של צבע צהוב זומבי ו-1:100 נוגדנים אנטי-עכבריים מדוללים CD16 או 32 לכדור. מערבולת את הדגימות ודגרה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות כדי לסמן תאים מתים ולחסום קולטני FC.

צנטריפוגה את התאים לפני שזורקים את הסופרנאנט. הוסיפו 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים שטחי לדגימה, סובבו אותה, ודגרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך במשך 20 דקות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה או בופר FACS לכל צינור צנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע וחדירות לכל צינור צנטריפוגה ומערבל את הדגימות. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות. העבר במיליליטר של חדירות ובופ שטיפה לכל צינור צנטריפוגה, ולאחר מכן בצנטריפוגה והסרת סופרנטנט.

לאחר חזרה על השטיפה, הוסף 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ציטוקינים לכל דגימה והעבר את הדגימות. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 40 דקות. שטפו כל דגימה עם מיליליטר אחד של פרמיאביליזציה ושטוף בופר.

צנטריפוגה את התאים והסר את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא ל-300 מיקרוליטר של בופר FACS. מדדו את ההתרבות וההתמיינות של תאי T מגיבים באמצעות ציטומטריית זרימה.

השגת אוכלוסיית הלימפוציטים בין כל התאים כדי להוציא פסולת תאים וזיהום. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדת מבין הלימפוציטים בהתבסס על אותות פיזור. לאחר מכן זיהו את אוכלוסיית התאים החיים בין התאים הבודדים, ואחריהם אוכלוסיית תאי T חיוביים ל-CD4 בין התאים החיים.

לאחר מכן, נבחן את אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים של CD45.1 ואת אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים של CD45.2 בין תאי ה-T החיוביים ל-CD4. לאחר מכן בחרו את תאי ה-T T החיוביים CD45.2 עם אינטרפרון גמא חיובי 1, 17 תאי T חיוביים CD45.2 עם אינטרלוקין-17A חיובי ל-CD4, ותאי T חיוביים ל-CD44 שאינם מתרבים מתוך תאי ה-T החיוביים CD45.2. לבצע איסוף נתוני ציטומטריית זרימה לכל הדגימות.

לבסוף, נתח את נתוני ציטומטריית הזרימה באמצעות תוכנת FlowJo תוך שימוש באותה אסטרטגיית גייטינג כמו ברכישת נתוני ציטומטריית זרימה. השכיחות של תאי T מגיבים שאינם מתרבים עלתה משמעותית בתנאי השראה של T helper 1 ו-T helper 17 לאחר קולטורציה משותפת עם תאי T מועשרים רגולטורית. ההתמיינות של תאי CD45.2 חיוביים, CD4 חיוביים באינטרפרון גמא, ותאי T עוזר 1 חיוביים דוכאה באופן משמעותי לאחר קו-קולטורציה עם תאי T רגולטוריים.

תדירות תאי ה-T החיוביים ל-CD45.2 ו-CD4 חיוביים ל-17A עם תאי T 17 חיוביים עלתה כאשר תאי T מגיבים תורבדו בתאי T רגולטוריים. ניתוח תפקודי במבחנה של תאי Treg מאפשר חקירת השפעות ביודירקטיביות בין תאי Treg לתאי T אפקטוריים על התרבות וקיטוב. האתגר הגדול ביותר בביצוע פרוטוקול זה הוא כיצד לשמור על חיוניות התאים תוך שמירה על טוהר תאי Treg ותאי T נאיביים.

לאחר תהליך זה, ELISA ובדיקות ביו-רפואיות נוספות יכולות להעריך ייצור ציטוקינים ואפקטורים מטבוליים, בעוד שתאי FACS ממוינים מאפשרים ניתוח RNA-seq ופרוטאומיקה.