Name: גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: למדו לנתח קומפלקסים מיטוכונדריאליים בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות שיטת in gel activity assay. השיטה מאפשרת הפרדה ברזולוציה גבוהה וניתוח פעילות שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים כיום על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לד&quot;ר קרלה קוהלר (UCLA) ואנשי מעבדה קוהלר למתן עצות ותובנות אלה ומחקרים נוספים.

רזולוציה גבוהה נקה Native ג&#39;ל Electophoresis (hrCNE) עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי In-Gel פעילות מבחני בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נשמרו על monolayer של C-שטופלו fibroblasts ˠ מוקרן או mitomycin עכבר עובריים (MEFs), אחר כך עברו על צמיחה Matrigel במשך 5 ימים במדיום MEF ממוזג באמצעות תנאים סטנדרטיים. כדי להסיר זיהום MEFs, hESCs היו מחדש מצופה על Matrigel גדל במדיום MEF ממוזג עבור 3 ימים נוספים. מיקרוסקופיה immunofluorescence עבור סמנים pluripotency אוקטובר-4 ו SSEA-4 שימש כדי לאשר את חוסר בידול hESC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם תאים חמים 1x PBS, pH 7.4, ואחריו trypsinization (1ml של 1x טריפסין היטב לכל צלחת 6-באר) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של מעכבי טריפסין טריים (ב 1mg/ml 1x PBS, pH 7.4). קציר תאים צנטריפוגות ב 200 גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את התאים pelleted supernatant ו resuspend ב 0.8 - 1.7ml (מבוסס על גודל תא גלולה) של קרח קר חיץ בידוד המיטוכונדריה (83mM סוכרוז; 6.6mM imidazole / HCl, pH 7.0) עם המוכן טרי קוקטייל &quot;מעכבי פרוטאז 1. לדגור על הקרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce תאים עם homogenizer (~ 40-50 משיכות). הכתם aliquot של תאים dounced עם trypan כחול כדי לבדוק השלמות של homogenization באמצעות מיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גולמי המיטוכונדריה גלולה שמכיל גם גרעינים ושברי תאים גדולים יותר. למזוג וזורקים supernatant ולשקול גולמי זירז המיטוכונדריה גלולה. גלולה יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C בעקבות הקפאה מיידית של חנקן נוזלי אם זו נקודת עצירה. הערה: צנטריפוגה דיפרנציאלי או שיפוע מבוססי הליכים יכול לשמש לבידוד איסוף חלק טהור קרום המיטוכונדריה. ראו נ&quot;צ. 4 לקבלת פרטים. גישה חלופית זו תניב את פעילות המיטוכונדריה מורכבים לכל מיליגרם של חלבון המיטוכונדריה במקום פעילות מורכבת לכל מיליגרם של משקל תא או מספר תאים. ריכוז של חלבונים במיטוכונדריה יהיה צורך נקבע לאחר טיהור לעשות את ההשוואה הזאת. כמו כן, חיץ בידוד שונים עשויים להידרש לגישה זו. עבור solubilization של חלק קרום טהור המיטוכונדריה, ראה את ההערה הבאה לשלב 6 למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize הגולמי המיטוכונדריה גלולה על הקרח ידי vortexing עם חיץ קרים solubilization (NaCl 50mm, 50mm imidazole / HCl pH 7.0, 1mm EDTA, 2mm 6-aminohexanoic חומצה). חומצה 6-aminohexanoic יכול להיות מוחלף עם קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x. השתמש 35μl של חיץ solubilization לכל 20mg משקל גלולה. הוסף 20μl של 10% w / v digitonin לכל 20mg משקל גלולה ומערבבים ידי מצליף את הצינורית. דגירה של 50-10 דקות על הקרח. Dodecyl-BD-maltoside או טריטון X-100 ניתן להחליף digitonin כדי solubilize את החלבונים. הבחירה של חומר ניקוי וכמותו עלול להשפיע על היווצרות supercomplexes או צורות multimeric של קומפלקסים המיטוכונדריה. לקבלת מידע נוסף, ראה ref.1. הערה: כמות של חומר הניקוי הנדרש solubilize שבריר טהור קרום המיטוכונדריה המתאים יחס כביסה / חלבון משקל החל 2-6g / g. יחס אופטימלי solubilize ממברנות המיטוכונדריה היא 2.5G / g dodecyl-BD-maltoside, 3G / g טריטון X-100, ו - 6 גרם / g digitonin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה גלולה solubilized ב 100.000 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. אסוף את supernatant ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טעינה חיץ גליצרול הסופי w / v 5% ו 0.01% w / v Ponceau S (שימוש של 50% w / v גליצרול, 0.1% w / v החיץ טעינה S Ponceau פתרון המלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען בארות ג&#39;ל עם נפח המכיל 20-40 מג של המיטוכונדריה גולמי גלולה לכל נתיב. השתמש שיפוע acrylamide ג&#39;ל (4 -13%) עם 3.5% לערום ג&#39;ל. הערה: הכנת ג&#39;ל אלקטרופורזה ותנאים: להכנת ג&#39;ל, השתמש acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 לערבב כדלקמן: 48g של acrylamide ו 1.5g של bisacrylamide (49.5% T, 3% ג T איפה הוא ריכוז מוחלט של AA ו bisAA ו-C הוא אחוז crosslinker (bisAA) כדי מונומר סה&quot;כ). ג&#39;ל חיץ (3 &#39;): 6-1.5M aminohexanoic חומצה; imidazole 75mm, pH 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><td> צבע ג&#39;ל: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> הערמה ג&#39;ל: </td><td> 3.5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA לערבב 3 </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 6.5 מ&quot;ל </td><td></td><td> 0.6 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ג&#39;ל חיץ 3 &quot; </td><td> 8.3 מ&quot;ל </td><td> 8.3 מ&quot;ל </td><td></td><td> 2.7 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td></td><td> 5 גרם </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td></td><td> 4.7 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סך נפח </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td></td><td> 8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> 139 μl </td><td> 125 μl </td><td></td><td> 67 μl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 μl </td><td> 12.5 μl </td><td></td><td> 6.7 μl </td></tr></tbody></table> חיץ האנודה: 25mm imidazole / HCl, pH 7.0 חיץ קטודה: Tricine 50mm, 7.5mM imidazole / HCl, 0.02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0.05% w / v deoxycholate, pH 7.0 יוצקים ולהפעיל ג&#39;לים בחדר קר (4-7 מעלות צלזיוס). המתח הראשוני נעשה שימוש הוא 100V. כאשר המדגם נכנס ג&#39;ל הערמה, המתח עולה עד 500V עם מוגבלות הנוכחית 15mA (0.15 עבור &quot;14&quot; 14 ס&quot;מ ג&#39;ל). אלקטרופורזה היא נעצרה לאחר 3-4 שעות, כאשר קו חד של צבע אדום Ponceau S גישות הקדמי ג&#39;ל. לחלופין, ג&#39;ל ניתן להפעיל ולינה 70-100V עם מתח קבוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> In-ג&#39;ל פעילות מבחני. זמן הדגירה של assay כל תלוי היעילות של solubilization חלבון כמות החומר טעון בכל טוב. תסביכים אני, IV ו-V בדרך כלל תשואה אותות חזקים יותר מתחמי II ו-III. </li></ol> אני קומפלקס (CI) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CI חיץ (5mm טריס-HCl, pH 7.4, 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. CI חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4: 0.01g NADH 0.25g NBT תקן את ג&#39;ל מתנול 50% חומצה אצטית 10% דק &#39;15-45. הג&#39;ל קבוע נשמרת חומצה אצטית 10%. קומפלקס II (כת&quot;ש) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CII חיץ (נתרן 20mm succinate; methasulfate phenazine 0.2mM; 2.5mg/ml NBT, 5mm טריס-HCl pH 7.4) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. כת&quot;ש חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4: 200μl נתרן 1M succinate 80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm מומס DMSO) 0.25g NBT תקן את ג&#39;ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני קומפלקס III (CIII) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CIII חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. CIII חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2: 50 מ&quot;ג tetrahydrochloride diaminobenzidine תקן את ג&#39;ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני קומפלקס IV (CIV) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CIV חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), לב 50μM סוס ציטוכרום c) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. CIV חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2: 50 מ&quot;ג tetrahydrochloride diaminobenzidine לב 0.1g סוס ציטוכרום c תקן את ג&#39;ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני קומפלקס V (CV) דגירה הפרוסה ג&#39;ל עם קורות חיים חיץ (35mm טריס בסיס, גליצין 270mM, pH 8.3 במהירות של 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0.2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. קורות חיים למאגר: 100 מ&quot;ל לכל פתרון להוסיף: <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טריס בסיס </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> גליצין </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> אין צורך להתאים את ה-pH (צריך להיות 8.3) - לא להשתמש חומצה או בסיס. סנן ולהוסיף <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ה-ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> תקן את ג&#39;ל מתנול 50% למשך 30 דקות ומעבירים למים.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

בסרטון הזה, שתיארנו החילוץ של קומפלקסים חלבונים מן המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדה שלהם על ידי אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה ברור ג&#39;ל יליד (hrCNE), וכן על ידי ניתוח לאחר מכן ב-ג&#39;ל מבחני פעילות קטליטית. hrCNE פותר המיטוכונדריה חלבון מתחמי ממברנה ברזולוציה דומה לזה של כחול ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד עדיפה שכן ג&#39;ל מבחני פעילות. טכניקה זו יכולה להיות מועסק לא רק לכמת המיטוכונדריה מתחמי הנשימה IV אלא גם לנתח את הרכב למקטע של כל חלבון מורכב קרום המיטוכונדריה הן hESCs והן נגזרות הצאצאים ...

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>כוון pH ל-8.0 באמצעות NaOH</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M Sodium succinate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>בופר Sodium phosphate 0.1M, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 and BP329-1</td><td>ערבב 68.4 ml של 1M Na2HPO4 ו-31.6 ml של 1M NaH2PO4 להכנת בופר sodium phosphate בריכוז 0.1M עם pH 7.2 בטמפרטורה של 25 C</td></tr><tr><td>1M Tricine, pH 7.0 (כוון באמצעות NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>שמור ב-4 C</td></tr><tr><td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>שמור ב-4 C</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (משקל/נפח) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>מומס במים. שמור אליקוטים של 1 ml בטמפרטורה של &amp;#8211;20 C.</td></tr><tr><td>10% (משקל/נפח) digitonin (&amp;gt;50% טוהר, נעשה שימוש ללא גביש מחדש)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>מומס במים. שמור אליקוטים של 0.1&amp;#8211;1 ml בטמפרטורה של &amp;#8211;20 C. יש לחמם ל-95 C לפני השימוש.</td></tr><tr><td>2M 6-aminohexanoic acid</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>שמור ב-4 C</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי 10x Ponceau S/glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 and G6279-1L</td><td>0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (משקל/נפח) במים.</td></tr><tr><td>10% משקל/נפח sodium deoxycholate</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>מומס במים. יש להגן מאור. כוון pH ל-7.0 באמצעות HCl, סנן ושמור בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>250 mM phenazine methasulfate (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>מומס ב-DMSO וחולק לאליקוטים. שמור בטמפרטורה של &amp;#8211;20 C.</td></tr><tr><td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate disodium salt (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grade I, מינימום 99%</td></tr><tr><td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) בצורה רדוקטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c מלב לב סוס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>שמור בטמפרטורה של &amp;#8211; 20 C.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>צבע Trypan blue 0.4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsin (0.5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Trypsin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

המיטוכונדריה הם אברונים cytoplasmic שיש להם תפקיד מרכזי במטבוליזם הומאוסטזיס הסלולר, הרגולציה של הרשת התא איתות, ועל מוות תאים מתוכנת. המיטוכונדריה לייצר ATP, להסדיר את המדינה חמזור cytoplasmic ו Ca2 + איזון, catabolize חומצות שומן, לסנתז heme, נוקלאוטידים, הורמונים סטרואידים, חומצות אמינו, לעזור להרכיב ברזל גופרית אשכולות בחלבונים. המיטוכונדריה יש גם תפקיד חיוני בייצור חום. מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי הגורם מספר סוגים של ההפרעה האנושית. הצטברות של מוטציות mtDNA בקורלציה עם הזדקנות חשוד יש תפקיד חשוב בהתפתחות סרטן. בשל תפקיד חשוב ביותר שלהם בכל סוגי תאים, הפונקציה של המיטוכונדריה חייב גם להיות קריטי עבור בתאי גזע. ההתקדמות מפתח נעשו הבנתנו הכדאיות גזע תאים, התפשטות, ויכולת הבחנה. אבל את הפעילות התפקודית של בתאי גזע, מעמד מסוים האנרגיה שלהם, עדיין לא נחקרו בפירוט. כמעט דבר אינו ידוע על המאפיינים של המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והצאצאים שלהם מבשר מובחן. אחת הדרכים להבין ולהעריך את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד hESC ואת הפוטנציאל ההתפתחותי היא למדוד ישירות את הפעילות של מתחמי הנשימה במיטוכונדריה. כאן אנו מתארים ברזולוציה גבוהה ברור יליד ג&#39;ל אלקטרופורזה ובעקבות ב להדמיה ג&#39;ל הפעילות כשיטה לניתוח חמשת מתחמי שרשרת הנשימה של hESCs.

בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג&#39;ל.

מיטוכונדריה הן אבניים ציטופלזמיים בעלות תפקיד מרכזי במטבוליזם ובהומאוסטזיס תאיים, בבקרה על רשת השיבוץ התאי, ו...

למיטוכונדריה תפקידים רבים בפיזיולוגיה של התא, החל מחילוף חומרים וייצור אנרגיה, דרך מוות תכנוני של תאים ועד לסנתזה של הורמונים סטרואידיים. למרות חשיבותן של המיטוכונדריה הן בתפקודים תאיים בסיסיים והן במחלות, מעט מאוד ידוע על תפקוד המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים של בני אדם ובצאצאיהם המובחנים. בסרטון זה, נראה לכם כיצד ניתן לנתח את קומפלקס שרשרת הנשמה המיטוכונדריאלית של תאי גזע של בני אדם באמצעות בדיקות פעילות Ingel.שלום, אני Ivan OV מהמעבדה של Michael Tetel במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית באוניברסיטת קליפורניה לוס אנג'לס. היום נדגים לכם הליך להערכת תפקוד קומפלקסים נשימתיים מיטוכונדריאליים בתאי גזע עובריים אנושיים. הערכת פעילות זו בתוך הג'ל כוללת בידוד של פלטה מיטוכונדריאלית גולמית מתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדה של קומפלקסים מיטוכונדריאליים של מערכת הפוספורילציה החמצנית ברזולוציה גבוהה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד טבעי צלול (clear native poly acrylamide gel electrophoresis), ובדיקת פעילות עוקבת בתוך הג'ל.אם כן, נתחיל. השלב הראשון בפרוצדורה זו הוא בידוד מיטוכונדריה מתאי גזע עובריים אנושיים. לבדיקה זו, נשתמש בתאי גזע עובריים אנושיים שגודלו על פלטה מצופה ב-matrigel בתנאי feeder-free.על מנת לבודד מיטוכונדריה מתאי גזע אנושיים מסוג amry, נתחיל בשטיפת התאים ב-1X PBS pH 7.4 חמים, ולאחר מכן נבצע עיכור של התאים באמצעות טריפסין למשך חמש דקות. ניתן להשתמש ב-1 mL של טריפסין 1x לכל באר בלוח של שש בארות. לאחר חמש דקות, ניתן לעצור את התגובה על ידי הוספה של נפח שווה של מעכב טריפסין טרי בריכוז 1 mg/mL ב-1X PBS, ולאחר מכן לאסוף את התאים.לאחר מכן, סבבו את התאים שנאספו בצנטריפוגה ב-200 $\times$g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, השליכו את supernatant ותלו את התאים שנשקעו ב-0.8 עד 1.7 milliliters של באפר לבידוד מיטוכונדריה קר (קרח) עם תערובת טרייה של 1x protease inhibitor. כמות הבאפר שבה תשתמשו תלויה בגודל משקע התאים שהתקבל. לאחר השספנסיה של המשקע, הדגירו אותו על קרח למשך כ-10 דקות.לאחר הדגירה, אנו מפרקים את התאים באמצעות הומוגניзатор, פעולה שעשויה לדרוש כ-40 עד 50 תנועות (strokes). ניתן לבדוק אם ההומוגניזציה הושלמה על ידי צביעת מנה (aliquot) של תאי ה-DOD ב-trian blue ובחינתה תחת מיקרוסקופ אור. התוצאה אמורה להיראות בערך כך.זהו הצילום הראשון לאחר 50 מכות עם פסטל (downs). זהו הצילום השני לאחר 80 מכות עם פסטל. לאחר שהתאים הומגנו, סבבו אותם בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. פעולה זו תניב משקח מיטוכונדריאלי גולמי, אשר יכיל גם גרעינים וחלקי תאים גדולים יותר.לפני איסוף המשקע, עלינו לשקול את מבחנת האיסוף כדי להעריך את משקל המשקע העתידי, לשפוך ולהשליך את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן לשקול את משקע המיטוכונדריה הגולמי שהשקיע. על ידי חיסור משקל המבחנה בנקודה זו, ניתן להמשיך להמסה של המשקע, כפי שיוצג בשלב הבא. כדי להמיס את משקע המיטוכונדריה הגולמי, נתחיל בשמירת המשקע על קרח ובביצוע וורטקס (vortexing) עם 35 µL של בופר המסה קר מאוד.עבור כל 20 milligrams של משקע, מידע מפורט על מרכיבי הבאפר מצוין בפרוטוקול הכתוב המצורף. לאחר ערבול בוורטקס והוספת באפר להמסה, ולפני הוספת digitonin, נעביר את המשקע שהושעה מחדש למבחנה המתאימה לסנטריפוגה במהירות גבוהה, ולאחר מכן נוסיף 20 microliters של 10% weight per volume digitonin עבור משקל משקע של 20 milligrams ונערבב על ידי נקישה על המבחנה; לאחר ערבוב יסודי, נדגיר את משקע המיטוכונדריה למשך 5 עד 10 דקות על קרח. ניתן להשתמש ב-DDM (או Dodecyl $\beta$-D-maltoside) או ב-Triton X 100 כתחליף ל-digitonin להמסת חלבונים.בחירת הדטרגנט וכמותו עשויות להשפיע על היווצרות של קומפלקסים על-מבניים (supra complexes) או צורות מולטימריות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים לאחר הדגירה על קרח. לאחר שהמשקע יומס, נסחרר אותו ב-100,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן נאסוף את העילג השקוף. כעת אנו מוכנים להכין את העילג להרצה על ג'ל גרדיאנט עבור אלקטרופורזה של ג'ל גרדיאנט נטיבי (native gradient gel electrophoresis) של מיטוכונדריה.אנו ממליצים להשתמש בג'ל בעל מדרג אקרילאמיד של 5% עד 13% עם ג'ל ריכוז (stacking gel) של 3.5%. להכנת הג'ל, נשתמש בתערובת אקרילאמיד-ביס-אקרילאמיד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. תמיסת אקרילאמיד-ביס-אקרילאמיד מוכנה מראש ונשמרת בטמפרטורה של 4°C במקום חשוך.אקרילאמידים וביס-אקרילאמידים הם כימיקלים רעילים הן כבסיס אבקה והן בצורה נוזלית, ולכן יש להקדיש תשומת לב מיוחדת בעבודה איתם. אנו מערבבים את תמיסת ה-Acrylamide bis acrylamide עם מנה של בופר ג'ל ריכוז פי 3, המורכב מ-1.5 molar six amino hexa noic acid ו-75 millimolar ole ב-pH 7.0. כמות תמיסת ה-acrylamide bis acrylamide שנוסיף לבופר תהיה תלויה באחוז הג'ל שאנו מכינים לצורך יצירת ג'ל הגרדיאנט.נכין תערובת אחת בריכוז 4% ותערובת אחת בריכוז 13%, וג'ל הריכוז (stacking gel) יהיה תערובת של 3.5%. אין לשכוח להוסיף גליצרול לתערובת ה-13%. כאשר כל שלוש התערובות מוכנות, נוסיף לתערובת כמות מתאימה של ammonium per sulfate ו-temed ונמזג את התערובות לתא יציקה ליצירת מעבר ריכוזים (gradient former casting chamber).החלק השמאלי של התא מכיל את ה-5%mix. החלק הימני של התא מכיל את ה-13%mix עם מוט ערבוב מגנטי קטן. נתחיל ביציקת הג'ל על ידי פתיחת החלק הימני של התא.מיד לאחר מכן, אנו פותחים את החלק השמאלי של התא ומאפשרים לתמיסה בריכוז 5% להתערבב עם תמיסה בריכוז 13% כדי ליצור את המדרג (gradient). אנו מוסיפים כמות קטנה של איזופרופנול לחלק העליון של הג'ל כדי ליצור גבול ישר וחד לג'ל לאחר הפולימריזציה. כשעה לאחר מכן, כאשר הפולימריזציה של ג'ל המדרג הושלמה, אנו מסירים את האיזופרופנול, מוזגים את ג'ל הריכוז 3.5 (stacking gel) לתוך המכשיר ומכניסים מסרק לג'ל.נרכיב ונריץ את הג'לים בחדר קירור בטמפרטורה של כ-4 עד 7 °C. להרצת ג'ל זה, נשתמש בשני באפרים שונים. בתא האנודה, נשתמש בבאפר המכיל 25 millimolar ole hydrochloric acid pH 7.0.בופר הקתודה יכיל 50 millimolar Tris-HCl, 7.5 millimolar HCl, 0.02% weight per volume n-dodecyl-β-D-maltoside או DDM ו-0.05% weight to volume deoxycholate ב-pH 7.0. כדי להכין את העלייה (supernatant) להרצה בג'ל ששפכנו זה עתה, מוסיפים בופר טעינה כדי להגיע לריכוז סופי של 5% weight to volume glycerol ו-0.01% weight to volume SDS; בדרך כלל אנו מוסיפים תמיסת מלאי 10x המכילה glycerol ו-SDS ישירות לעלייה.כעת אנו מוכנים להעמיס את דגימת הג'ל על הג'ל. נמלא את בארות הג'ל בנפח המכיל 20 עד 40 מיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי גולמי לכל נתיב. מיד לאחר ההעמסה, הג'ל מורץ במתח של 100 וולט.לאחר שהדגימה חדרה לג'ל הערימה (stacking gel), ניתן להעלות את המתח ל-500 וולט, כאשר הזרם מוגבל ל-15 מיליאמפר. למרות שבדרך כלל אנו מריצים את הג'ל במהלך הלילה במתח של 70 עד 100 וולט, אנו עוצרים את האלקטרופורזה כאשר קו חד של צבע zos אדום מתקרב לחזית הג'ל. כעת, לאחר שהג'ל הורץ, ניתן לנתח את הפעילות של קומפלקסים שונים של חלבונים ישירות בתוך הג'ל.זמן האינקובציה עבור כל בדיקה תלוי ביעילות המסת החלבון ובכמות החומר שהועמסה לכל באר. קומפלקסים 1, 4 ו-5 מניבים בדרך כלל אותות חזקים יותר מקומפלקסים 2 ו-3. זו הסיבה שזמן הצביעה עבור קומפלקסים 2 ו-3 צריך להיות ארוך יותר.כדי לבחון את פעילות הקומפלקס, נצטרך להשתמש בתמיסות בופר ספציפיות לכל קומפלקס. ניתן למצוא את מרכיבי הבופרים האינדיבידואליים בפרוטוקול הכתוב. כעת נגזור נתיבים בודדים מהג'ל כדי לבצע את בדיקות הפעילות בתוך הג'ל (In-gel activity assays) באופן נפרד.עבור כל הקומפלקסים, יש להדגיר את פרוסת הג'ל בתמיסות המאtamים לה למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר, למעט עבור קומפלקס חמש. לאחר ההדגירה, יש לקבע את הג'ל ב-50% methanol ו-10% acetic acid למשך 15 עד 45 דקות. הג'ל המקובע נשמר ב-10% acetic acid.ניתן לראות כאן כיצד נראה הצביעה של קומפלקס 1. ישנו פס סגול כהה בתוך פרוסת הג'ל המתאים לקומפלקס 1. ג'לים שקופים מאפשרים לבצע דנסיטומטריה של פעילויות קומפלקסים מיטוכונדריאליים ולבצע ניתוחים השוואתיים.לאחר ציטומטריה צפופה, אנו בדרך כלל מייבשים את פרוסות הג'ל לצורך אחסון לטווח ארוך ו/או לסריקה במטרה להשיג תמונה איכותית; קומפלקס שתי צבעים בעלי אותו גוון סגול כמו קומפלקס שלוש וקומפלקס ארבע. שניהם נותנים פס צביעה כתום או צהבהב. להלן דוגמאות לפעילויות צביעה של קומפלקס שתיים, שלוש וארבע.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לנתח את הפעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים של נשיאת אלקטרונים, אשר חולצו מתאי גזע עובריים אנושיים והופרדו ברזולוציה גבוהה, כולל אלקטרופורזה בג'ל נייטיבי (native gel electrophoresis). זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Fibroblasts מחולים שנשאו מוטציות בגני פרקינסון גורמי מחלות לייצג...

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

למדו לנתח קומפלקסים מיטוכונדריאליים בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות שיטת in gel activity assay. השיטה מאפשרת הפרדה ברזולוציה גבוהה וניתוח פעילות שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

גלה סרטונים נוספים