גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

למיטוכונדריה יש תפקידים רבים בפיזיולוגיה של התא, החל מחילוף חומרים וייצור אנרגיה ועד לתכנון מוות תאים ועד סינתזת הורמונים סטרואידים. למרות חשיבות המיטוכונדריה הן בתפקודים תאיים בסיסיים והן במחלות, מעט מאוד ידוע על תפקוד המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים וצאצאיהם המובחנים. בסרטון זה, נראה לכם כיצד ניתן לנתח את קומפלקסי שרשרת הנשימה של המיטוכונדריה של תאי גזע אמרי אנושיים באמצעות מבחני פעילות אינגל.

היי, אני איוון OV מהמעבדה של מייקל טטל במחלקה לפתולוגיה ורפואת מעבדה באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס. היום נראה לכם נוהל להערכת תפקוד קומפלקס נשימתי מיטוכונדריאלי בתאי גזע עובריים אנושיים. אלה בפעילות הג'ל מעריכים הליך זה כרוך בבידוד של חיך מיטוכונדריאלי גולמי מתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדת קומפלקסים מיטוכונדריאלים של מערכת הזרחן האקסודטיבית עם אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד מקורי ברזולוציה גבוהה יותר, ולאחר מכן בפעילות ג'ל SA.

אז בואו נתחיל. השלב הראשון בהליך זה הוא בידוד מיטוכונדריה מתאי גזע עובריים אנושיים. לצורך בדיקה זו, נשתמש בתאי גזע עובריים אנושיים שגודלו על צלחת מכוסה מטריג'ל במצב נטול מזין.

על מנת לאסוף מיטוכונדריה מתאי הגזע האנושיים שלנו, אנו מתחילים בשטיפה שלהם עם XPDS pH חם 7.4, ולאחר מכן מנסים את התאים למשך חמש דקות. אתה יכול להשתמש במיל אחד של טריפסין אחד לבאר בצלחת שש בארות. לאחר חמש דקות, אתה יכול לעצור את התגובה על ידי הוספת נפח שווה של מעכב טריפסין טרי מיליגרם אחד למיל ב-XPBS אחד ולקצור את התאים.

לאחר מכן התאים שנאספו עוברים צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט וההחייאה, השעו את התאים הגלולים ב-0.8 עד 1.7 מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה קר כקרח עם קוקטייל טרי שהוכן של מעכב פרוטאז אחד. כמה מאגר אתה משתמש תלוי בגודל כדור התא שאתה מקבל לאחר שהגלולה הושעה מחדש, דגרו אותה על קרח למשך כ-10 דקות.

לאחר הדגירה על התאים עם הומוגנייזר, זה עשוי לקחת כ-40 עד 50 פעימות. אנו יכולים לבדוק את הרשימה המלאה של הומוגניזציה על ידי צביעת תאי DOD בכחול טריאן והסתכלות דרך מיקרוסקופ אור. זה אמור להיראות בערך כך.

זו הזריקה הראשונה אחרי 50 חבטות עם דאון. זו הזריקה השנייה אחרי 80 חבטות עם דאון. לאחר שהתאים הומוגניים, צנטריפוגה אותם ב -20, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.זה ייתן לנו גלולה מיטוכונדריאלית גולמית, שתכיל גם גרעינים ושברי תאים גדולים יותר.

לפני איסוף הגלולה, עלינו לשקול את צינור האיסוף על מנת להעריך את משקל הגלולה שלאחר מכן, לשפוך ולזרוק את הסופרנטנט, ולאחר מכן לשקול את הגלולה המיטוכונדריאלית הגולמית המשקעת. על ידי הפחתת משקל הצינור בשלב זה, ניתן להמשיך להמיס את הגלולה, שתוצג בשלב הבא. על מנת להמיס את הגלולה המיטוכונדריאלית הגולמית, אנו מתחילים בשמירה על הגלולה על קרח ומערבולת עם 35 מיקרוליטר של מאגר מסיסות קר כקרח.

על כל 20 מיליגרם של גלולה שיש לנו מידע מפורט על תרכובות החיץ מוזכר בפרוטוקול הכתוב הנלווה. לאחר מערבולת והוספת מאגר מסיסות ולפני הוספת ספרת טואין, אנו מעבירים את הגלולה המרחפת לתוך צינור המתאים לצנטריפוגה במהירות גבוהה, ולאחר מכן אנו מוסיפים 20 מיקרוליטר של 10% משקל לספרת נפח עבור 20 מיליגרם של משקל גלולה ומערבבים על ידי החלקת הצינור לאחר ערבוב יסודי של הגלולה המיטוכונדריאלית למשך חמש עד 10 דקות על קרח. ניתן להחליף את Doil בטא D מולטי-סייד או DDM או Triton X 100 בטואין ספרתי לחלבונים מסיסים.

בחירת חומר הניקוי וכמותו עשויים להשפיע על היווצרותם של קומפלקסים סופרה או צורות מולטימריות של קומפלקסים מיטוכונדריאלים לאחר הדגירה על הקרח. וברגע שהכדור מסיס, נבצע צנטריפוגה במאה אלף פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז נאסוף את הסופרנטנט השקוף. כעת אנו מוכנים להכין את הסופרנטנט להפעלה על ג'ל השיפוע שלנו לאלקטרופורזה של ג'ל שיפוע טבעי של המיטוכונדריה.

אנו ממליצים להשתמש בג'ל שיפוע אקרילאמיד מחמישה עד 13% עם ג'ל ערימה של 3.5%. להכנת הג'ל נשתמש בתערובת אקרילאמיד ביס אקרילאמיד כמתואר בפרוטוקול הכתוב. תמיסת אקרילאמיד ביס אקרילאמיד מוכנה מראש ומאוחסנת בארבע מעלות צלזיוס במקום חשוך.

אקרילאמיד וביס אקרילאמיד הם כימיקלים רעילים הן כאבקה והן בצורה נוזלית, ולכן יש להקדיש תשומת לב מיוחדת כאשר עובדים איתם. אנו משלבים את תמיסת אקרילאמיד ביס אקרילאמיד עם מאגר של שלושה x ג'ל המורכב מ-1.5 חומצה מולרית של שש אמינו הקסנואית, ו-75 מילי-מולרי אול ב-pH 7.0. כמות תמיסת האקרילאמיד ביס אקרילאמיד שאנו מוסיפים למאגר תהיה תלויה באחוז הג'ל שאנו מייצרים כדי ליצור את הג'ל השיפוע.

נכין תערובת אחת של 4% ותערובת אחת של 13%, וג'ל הערימה יהיה תערובת של 3.5%. אל תשכח להוסיף גליצרול לתערובת של 13%. כאשר כל שלוש התערובות מוכנות, אנו מוסיפים לתערובות כמות מתאימה של אמוניום לכל סולפט וטמיד ויוצקים את התערובות לתא יציקה לשעבר שיפוע.

החלק השמאלי של החדר מכיל את התערובת של 5%. החלק הימני של החדר מכיל את תערובת ה-13% במוט ערבוב מגנטי קטן. אנו מתחילים לשפוך את הג'ל על ידי פתיחת החלק הימני של החדר.

ואז מיד אנו פותחים את החלק השמאלי של החדר ונותנים לתמיסה של 5% להתערבב עם תמיסה של 13% כדי ליצור את השיפוע. אנו מוסיפים כמות קטנה של איזופרופנול לחלק העליון של הג'ל ליצירת גבול ישר חד לג'ל לאחר פילמור. כשעה לאחר מכן, כאשר הפילמור של ג'ל השיפוע הושלם, אנו מסירים את האיזופרופנול ושופכים את ג'ל הערימה 3.5 למנגנון ומכניסים מסרק ג'ל.

נרכיב ונפעיל את הג'לים בחדר קר של כארבע עד שבע מעלות צלזיוס. כדי להפעיל את הג'ל הזה, נשתמש בשני מאגרים שונים. בתא האנודה, נשתמש במאגר המכיל 25 מילי-מולרית חומצה הידרוכלורית pH 7.0.

מאגר הקתודה יכיל 50 מילימטר טרי, 7.5 מילי-מולרי אול הידרוכלורית, 0.02% משקל לנפח, doil beta D multiside או DDM ו-0.05% משקל לנפח, deoxy coate pH 7.0. על מנת להכין את הסופרנטנט להפעלה בג'ל שזה עתה מזגנו, מתווסף מאגר העמסה כדי להניב ריכוז סופי של 5% גליצרול לנפח ו-0.01% משקל לנפח. Ponto S, אנו בדרך כלל מוסיפים תמיסת מלאי של 10 x המכילה גליצרול ופונצ'ו ישירות לסופרנטנטים.

עכשיו אנחנו מוכנים להעמיס את דגימת הג'ל על הג'ל. נעמיס את בארות הג'ל בנפח המכיל 20 עד 40 מיליגרם של החלבון המיטוכונדריאלי הגולמי לכל נתיב. מיד לאחר הטעינה, הג'ל מופעל על 100 וולט.

לאחר שהדגימה נכנסה לג'ל הערימה, ניתן להעלות את המתח ל-500 וולט כאשר הזרם מוגבל ל-15 מילי-אמפר. למרות שבדרך כלל אנו מריצים את הג'ל בן לילה ב-70 עד 100 וולט, אנו עוצרים את האלקטרופורזה כאשר קו חד של צבע הזוס האדום מתקרב לחזית הג'ל. כעת, לאחר שהג'ל הופעל, אנו יכולים לנתח את פעילותם של מתחמי חלבון שונים ישירות בג'ל.

זמן הדגירה עבור כל בדיקה תלוי ביעילות המסת החלבון ובכמות החומר הנטען לכל באר. קומפלקסים 1, 4 ו-5 בדרך כלל מניבים אותות חזקים יותר מאשר קומפלקסים 2 ו-3. זו הסיבה שזמן הצביעה עבור קומפלקס שניים ושלושה צריך להיות ארוך יותר.

כדי לבדוק את הפעילות המורכבת, נצטרך להשתמש במאגרים ספציפיים לכל מתחם. אתה יכול למצוא את המרכיבים של המאגרים הבודדים בפרוטוקול הכתוב. כעת נחתוך נתיבים בודדים של הג'ל כדי לבצע את מבחני הפעילות של אינגל בנפרד.

עבור כל הקומפלקסים, דגרו את פרוסת הג'ל במאגרים המתאימים שלהם למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר עבור כל המתחמים למעט קומפלקס חמישה. לאחר הדגירה, יש לתקן את הג'ל ב-50% מתנול ו-10% חומצה אצטית למשך 15 עד 45 דקות. הג'ל הקבוע נשמר בחומצה אצטית 10%.

אתה רואה כאן איך מופיע מכתים של מורכב. יש רצועה סגולה עמוקה אחת בפרוסת הג'ל המתאימה למורכבת. ג'לים שקופים מאפשרים לך לבצע צפיפות מפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות ולבצע ניתוחים השוואתיים.

לאחר ציטומטריה צפופה, אנו נוהגים לייבש את פרוסות הג'ל לאחסון לטווח ארוך ו/או לסריקה על מנת לקבל קומפלקס תמונה באיכות גבוהה, שני כתמים בצבע סגול זהה לקומפלקס אחד שלוש ומורכב ארבע. שניהם נותנים רצועת מכתים כתומה או צהבהבה. להלן דוגמאות לפעילויות צביעה מורכבות של שתיים, שלוש וארבע מצביעים.

זה עתה הראינו לכם כיצד לנתח את הפעילות של קומפלקסים של אקסודטיביות מיטוכונדריאלית, שהופקו מתאי גזע עובריים אנושיים והופרדו ברזולוציה גבוהה יותר, כולל אלקטרו ג'ל מקומי. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.