יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

לפני למעלה מ-50 שנה, הועלתה ההשערה כי ניתן להביא תאים בעלי התמיינות סופית, כגון פיברובלסטים של העור, לאמץ מצב פלוריפוטנטי הדומה לתאי גזע עובריים. הבסיס לקונספט זה היה התצפית שכל סוגי התאים, למעט מספר חריגים מינוריים, נושאים את אותו קוד גנטי, וההבדל היחיד בין סוגי התאים הוא האופן שבו הקוד נקרא. היכולת לשנות את הזהות התאית של תא מובחן למצב פלוריפוטנטי מכונה תכנות תאי מחדש.

לאחר חמישה שנות מחקר, הוכח לאחרונה כי ביטוי מאולץ של ארבעה גורמי שחלוף (transcription factors) יכול לתכנת מחדש פיברובלסטים של העור להפוך לפלוריפוטנטיים. לממצא זה השפעה עצומה. מעבר לחשיבותו עבור הביולוגיה הבסיסית, הוא גם פותר את ההתנגדויות האתיות המרכזיות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים לצורך טיפול בהשתלה.

כדי שהתכווץ מחדש יתרחש, ארבעה גנים המקודדים לגורמי השעתוק OC4, sox2, c-mic ו-K4 צריכים להיארז ולהוכנס לתשבילי תרבית רקמה של lentivirus. לאחר מכן, מוסיפים למנתח תרבית תאים המכיל צפיפות גבוהה של פיברובלסטים מדיום המכיל וירוס מופק, ובתוך מנתח זה מתרחש תהליך מדהים: חלק קטן מהפיברובלסטים נדבקים לכל ארבעת הווירוסים הנושאי גורמי שעתוק ומתחילים בתהליך של דה-דיפרנציאציה.

הם עוברים שינויים דרסטיים במורפולוגיה ובשגשוג ומתחילים להתחלק לצבירים גדולים של תאי גזע פלוריפוטנטיים. לאחר שבועיים עד שלושה שבועות של תרבית בתנאים של תאי גזע עובריים, ניתן לבודד ידנית מושבות של פיברובלסטים שעברו תכנות מחדש ולהרביעם in vitro. לאחר טהרתם, ניתן להשתמש בתאים אלו ליצירת עכברים כימריים, שבהם אחוז מסוים של תאים המגזרים מאותם פיברובלסטים שעברו דה-דיפרנציאציה יכולים לתרום לרקמות שונות של העכבר.

בכימרות שבהן החומר הגנטי של הפיברובלסטים המקוריים תרם לקו הנבט, הקוד הגנטי יעבור לדור הבא, ולאחר מכן לדור הבא ובא following. למרות שהשימוש במערכת הובלה ויראלית מהווה כעת מכשול ליישומים קליניים, סביר להניח שקושי זה ימומש בתוך זמן קצר. בסרטון זה, חברים במעבדת yin ידגימו כיצד מפיקים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים מפיברובלסטים עובריים של עכבר.

שלום, אני גרנט וולטד מהמעבדה של רודולף ייש במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי בקיימבריג', מסצ'וסטס. ואני טוביאס ברוברינק, גם אני ממעבדתו של ייש. היום נדגים לכם את יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים באמצעות הכנסת ארבעה cDNAs: OCT4, SOX2, c-MYC ו-KLF4, תוך שימוש בלנטי-וירוסים המבטאים ארבעת ה-cDNAs הללו מקידומת Tet-On CMV.

דבר זה מאפשר בקרה מדויקת על הביטוי של ארבעת התראנסגנים הללו לאחר הדבקה של פיברובלסטים עובריים של עכבר. הפרוטוקול שאנו מציגים היום כולל טיפול בלנטי-וירוס שעלול להדביק תאי אדם. חיוני שתפעלו תמיד לפי נהלי בטיחות ותצרו קשר עם משרד הבטיחות שלכם לפני שתנסו לבצע זאת בעצמכם.

כעת ניצור תאי IPS על מנת לייצר לנטיווירוס שיהפוך תאי mes לתאי IPS. יש להחדיר לתאי 2 9 3 שלושה פלסמידים: Paks two, המספק את הרכיבים הגנטיים הנדרשים לאריזה ויראלית; השלד הויראלי, שהוא לנטיווירוס FUW TE OCMV עם אחד מארבעת ה-CD aids T four: SOX two, KLA four או CMIC PMDG; וכן פלסמיד המבטא את הגליקופרוטאין של המעטפת של נגיף הסטומטיס וסיקולרי (VSV).

תהליך זה יוצר את הנגיף שיניב נגיף אטרופי. לכן, יש להקפיד על נהלי BL2+ מתאימים. בסרטון זה, איננו מטפלים למעשה בנגיף זיהומי, ולכן איננו לובשים את חלוקי המעבדה הרגילים ואיננו נמצאים במתקן ה-BL2+ שלנו.

לפני התעתוק, מפקיקים תאי 2, 9 3 מחנקן נוזלי ומגדלים אותם עד להגעה ל-90% Co fluency. לאחר מכן מתעתקים את התאים עם גן FU וממתינים 48 עד 72 שעות לביטוי הנגיף; בשלב זה, מסננים את המצע שבו שוהים התאים באמצעות מסנן של 0.45 micron ומרכזים אותו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. לאחר ריכוז הנגיף, ניתן להדביק את ה-MES כדי להפיק מקבצי IPS. במהלך שלבי הכנת הנגיף, מגדלים פיברובלסטים עובריים של עכבר במעבר של פחות משלוש פעמים עד להגעה ל-90%co fluency בצלחות של 10 סנטימטר, בכמות של כ-two times 10 to the six תאים לצלחת. בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו משתמשים ב-MES המבטאים את RTTA, החיוני לביטוי doxycycline, ו-GFP מהלוקוס האנדוגני OC four.

תאי MES הם שליליים ל-GFP, אך תאי IPS אמיתיים הופכים לחיוביים ל-GFP. סמן זה מאפשר שיטה לזיהוי תאי mes שעברו תכנות מחדש; שאבו את מצע התרבית מהפיברובלסטים ושטפו עם 10 mils של hippies, EDTA, השליכו את ה-hippies EDTA והוסיפו חמישה mils של one times trypsin והדרימו בטמפרטורה של 37 degrees למשך 10 דקות. ה-Trypsin יעזור להרים את התאים מהתחתית של הצלחות.

כעת הוסיפו תשעה ml של מצע תרבית כדי להחזיר את התאים לתליה כסספנסיית תאים בודדים והעבירו לשפופרת של 15 ml. לאחר מכן סובבו את התאים בצנטריפוגה עד להיווצרות משקע. לאחר השהייה מחדש של המשקע, ספרו את מספר התאים בסספנסיה והתאימו את הריכוז ל-8×10⁴ תאים ל-ml.

כמות של 10 µL מתרחיף התאים מועברת לכלי פטרי בקוטר 10 cm המצופה בג'לטין. דגרו את הכלי למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. לאחר דגירה של לילה, שאפו את המצע מכלי הפיברובלסטים והוסיפו 10 µL של מצע המכיל את הנגיף לכלי. דגרו את התאים למשך ארבע שעות ועד לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.

ביום למחרת, שאבו את המצע מתוך צלחת עם פיברובלסטים ולאחר מכן הוסיפו 10 ml של מצע ESL טרי. בשלב זה, ניתן להקפיא את התאים, להרחיב אותם או להכינם לתחילת התכנות מחדש. כדי להתחיל בתכנות מחדש, החליפו את מצע ה-ESL הרגיל במצע המכיל doxycycline כדי להפעיל את הביטוי של ארבעת הגנים.

הניחו תאים אלה באינקובטור והחליפו את המצע מדי יום עד שהמושבות יהיו גדולות מספיק כדי שניתן יהיה לבחור אותן. המושבות אמורות להפוך לנראות לראשונה כשבוע לאחר תחילת התכנות מחדש. הן אמורות להיות גדולות מספיק לבחירה בסביבות היום ה-20.

לאחר שעברו 20 ימים, ניתן להמשיך בב soonה של מושבות IPS לפני בחירת המושבות. יש לזכור להכין את מספר הפלטות הנדרש של פלטות 24 בארות מצופות ג'לטין עם DR המקרין גמא שעה עד שעתיים לפני הבחירה. יש להזין את המושבות על הפלטות על ידי הוספת מצע טרי רגע לפני הבחירה; הוסף 50 µL של HEPES buffer לבארים של צלח 96 בארות בעבוד V מיד לפני הבחירה, שטוף פעם אחת ב-PBS את הצלח המכיל את המושבות לבחירה והוסף 10 mL של PBS לצלח. ניתן לבחור אשכולות תאי IPS תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי או מיקרוסקופ הפוך.

בחרו את המושבות באמצעות טיפ קטן של פיפטה והעבירו אותן לבאר בצלחת בעלת 96 בארות המכילה PBS כדי להסיר את הצברים. יש לשרטט מעגל סביב הצבר בעזרת טיפ של פיפטה כדי לפרק את הגושים. כעת ניתן להוציא את התאים שעברו תכנות מחדש באמצעות פיפטה רב-ערוצית, ולהוסיף 20 microliters של tripsin לכל באר.

שאיפה ופליטה (pipetting) למעלה ולמטה של התמיסה שלוש פעמים, דגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע דקות. לאחר דגירה של ארבע דקות, מוסיפים 100 µL של מצע ES למושבות. שאיפה ופליטה למעלה ולמטה 10 פעמים והעברה של שישה שיבטים בכל פעם.

מעבירים מהצלחת בעלת 96 בארות לצלחת בעלת 24 בארות, תוך שימוש בטיפ בכל מיקום שני בפיפטור בעל 12 מקומות. לאחר מכן, התאים גודלים בצלחת בעלת 24 בארות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 עד שהתאים מגיעים ל-80 עד 90% התמסרות (confluency) בתוך מצע תרבית לתאי ES. התאים יהיו ככל הנראה מוכנים להתרחבות בעוד שלושה עד שבעה ימים. לאחר מספר ימים, כאשר תאי ה-iPS התמסרו, שואבים את המצע ושוטפים את התאים ב-1 mL של HBSS. מסירים את ה-HBSS לחלוטין ומוסיפים 100 µL של trypsin בריכוז 1×, ומדגירים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. לאחר הדגירה עם ה-trypsin, מוסיפים 400 µL של מצע ESL ומרחפים את התאים על ידי פיפטור למעלה ולמטה כדי להפיק סספנסיה של תאים בודדים.

את ת сусפנסיית התאים הבודדים בנפח 500 µL מהבאר בלוח ה-24 מעבירים לבאר אחת בלוח בעל שש בארות ומדגירים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 עד שהתאים מגיעים ל-80% עד 90% התמלאות (confluency) בלוח בעל שש הבארות. בנקודה זו, ניתן להמשיך להעשרת תאים לצורך אנליזת Southern, הפקות (blasts), הזרקות, בדיקות טרטומה או בדיקות דיפרנציאציה in vitro. יש לזכור להקפיא מנות מאגר (stock vials) של תאים אלו כדי לא לאבד את מלאי תאי ה-IPS היקר.

הראינו לכם כעת כיצד להשרות פלוריפוטנטיות בפיברובלסטים עובריים של עכבר באמצעות מערכת אנטי-ויראלית הניתנת להשראה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.