יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

לפני למעלה מ-50 שנה, הועלתה השערה כי ניתן לאלץ תאים מובחנים סופניים כמו פיברובלסטים של העור לקבל מצב פלוריפוטנטי בדומה לתאי גזע עובריים. הבסיס לתפיסה זו היה התצפית שלכל סוגי התאים, למעט כמה חריגים קלים, יש את אותו קוד גנטי וכי ההבדל היחיד בין סוגי התאים הוא אופן קריאת הקוד. יכולת זו לשנות את הזהות התאית של תא מובחן למצב פלוריפוטנטי נקראת תכנות מחדש תאי.

לאחר חצי עשור של מחקר, הוכח לאחרונה כי ביטוי מאולץ של ארבעה גורמי שעתוק יכול לתכנת מחדש פיברובלסטים בעור כך שיהפכו לפלוריפוטנטיים. ההשפעה של ממצא זה היא עצומה. מעבר לחשיבות הביולוגיה הבסיסית, היא גם מתגברת על ההתנגדויות האתיות העיקריות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים לטיפול בהשתלות.

על מנת שיתרחש תכנות מחדש, יש לארוז ארבעה גנים המקודדים את גורמי השעתוק OC, ארבעה sox, שני cmic ו-K, ארבעה ולהכניס אותם לתרבית רקמה של lentivirus. לאחר מכן מוסיפים מדיום המכיל וירוס מטוהר לצלחת תרבית תאים המכילה צפיפות גבוהה של פיברובלסטים, ובתוך המנה הזו מתרחש משהו מדהים. חלק קטן מהפיברובלסטים נדבקים בכל ארבעת גורמי השעתוק הנושאים וירוסים ומתחילים להתמיין.

הם עוברים שינויים דרסטיים במורפולוגיה ובהתפשטות שלהם ומתחילים להתחלק לאשכולות רוחניים גדולים של תאי גזע פלוריפוטנטיים שנוצרו. לאחר שבועיים-שלושה של תרבית בתנאי תאי גזע עובריים, ניתן לבודד ולהרחיב באופן ידני מושבות של פיברובלסטים מתוכנתים מחדש במבחנה. לאחר הטיהור, ניתן להשתמש בתאים אלה ליצירת עכברים כימריים בהם אחוז מסוים של תאים נובעים מאותם פיברובלסטים מובחנים יכולים לתרום לרקמות שונות של העכבר.

בפעמונים שבהם החומר הגנטי של הפיברובלסטים המקוריים תרם לקו הנבט, הקוד הגנטי מועבר לדור הבא ואז לדור הבא ואז לדור הבא. למרות שהשימוש במערכת אספקה ויראלית מהווה כיום מכשול ליישומים קליניים, סביר להניח שיתגבר על כך תוך זמן קצר. בסרטון זה, חברי מעבדת היין ידגימו כיצד תאי גזע חזקים מושרים מופקים מפיברובלסטים עובריים של עכברים.

היי, אני גרנט וולטד מהמעבדה של רודולף ג'יש במכון ווייטהד למחקר ביו-רפואי בקיימברידג', מסצ'וסטס. ואני טוביאס ברו ברינק גם ממעבדת איש. היום נראה לכם את הדור של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי הכנסת ארבעה CDNAs OCT ארבעה SOX שני CIC KF ארבעה באמצעות lentiviruses המבטאים את ארבעת ה- CDNA הללו ממקדם Tet OCMV.

זה מאפשר שליטה מדויקת בביטוי של ארבעת הטרנסגנים הללו לאחר הדבקה של פיברובלסטים עובריים של עכברים. הפרוטוקול שאנו מראים לכם היום כולל טיפול בנגיף הלנטי שעלול להדביק תאים אנושיים. זה קריטי שתקפידו תמיד על נהלים בטוחים ותצרו קשר עם משרד הבטיחות שלכם לפני שתנסו לעשות זאת בעצמכם.

אז בואו נייצר כמה תאי IPS על מנת לייצר lentivirus שימיר mes לתאי IPS. 2 9 3 תאים חייבים להיות מועברים עם שלושה פלסמידים Paks two, המספקים את האלמנטים הגנטיים הנדרשים לאריזה ויראלית. עמוד השדרה הנגיפי, שהוא וירוס לנטי FUW TE OCMV עם אחד מארבעת ה- CD מסייע T ארבע SOX שתיים, KLA ארבע או CMIC PMDG, המבטא את גליקופרוטאין המעטפת של נגיף סטומטיטיס שלפוחית או VSV.

זה יוצר את הנגיף שייצור וירוס אטרופי אז צריך לעקוב אחר נהלי BL שני פלוס נכונים. בסרטון הספציפי הזה, אנחנו לא באמת מטפלים בנגיף מדבק, אז אנחנו לא לובשים את החלוקים הטיפוסיים שלנו ולא נמצאים במתקן BL 2 פלוס שלנו.

לפני טרנספקציה 2, 9 3 תאים מופשרים מחנקן נוזלי וגדלים ל-90% Co fluency תאים עוברים טרנספטציה עם גן FU וניתנים להם 48 עד 72 שעות לבטא את הנגיף, ואז המדיום הרוחץ את התאים מסונן באמצעות מסנן 0.45 מיקרון ומרוכז באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לאחר ריכוז הנגיף. כעת אנו מוכנים להדביק MES על מנת ליצור אשכולות IPS במהלך שלבי ההכנה הוויראלית, מעבר פיברובלסטים עובריים של עכברים פחות משלוש פעמים גדל לשטף של 90% בכלים של 10 סנטימטרים, בערך פי שניים 10 לששת התאים למנה. בפרוטוקול הניסוי הספציפי הזה, אנו משתמשים ב-MES המבטא את ה-RTTA, שהוא קריטי לביטוי דוקסיציקלין ו-GFP מלוקוס OC 4 האנדוגני.

MES הם שליליים ל- GFP, אך תאי IPS אמיתיים הופכים לחיוביים ל- GFP. סמן זה מאפשר שיטה שבאמצעותה ניתן לזהות mes מתוכנתים מחדש לשאוב את מדיום התרבית מהפיברובלסטים ולשטוף עם 10 מיל של היפים, EDTA, להשליך את ההיפים EDTA ולהוסיף חמישה מיל של טריפסין חד פעמי ולדגור ב-37 מעלות למשך 10 דקות. טריפסין יעזור להרים את התאים מתחתית הכלים.

כעת הוסף תשעה מיל של מדיום התרבית כדי להשעות מחדש את התאים בתרחיף תא בודד ולהעביר לצינור של 15 מיל. לאחר מכן תאים אלה מסובבים כלפי מטה וכדורים. לאחר החייאת הגלולה, מספר התאים בתרחיף נספר והריכוז מותאם לשמונה פעמים 10 לארבעת התאים למיל.

לאחר מכן מועברים 10 מיל מתרחיף התא לצלחת של 10 סנטימטר המצופה בג'לטין. דגרו את המנה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לאחר שמדיום הדגירה הלילה מצלחת פיברובלסטים נשאב ו-10 מיל של המדיום המכיל את הנגיף מתווספים למת'. דגרו על התאים מארבע שעות עד לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

למחרת שאפו את המדיום מצלחת פיברבלסט ולאחר מכן הוסיפו 10 מיל של מדיה ESL טרייה. בשלב זה ניתן להקפיא תאים, להרחיב אותם או להכין אותם להתחלת תכנות מחדש. כדי להתחיל תכנות מחדש, החלף מדיום ESL רגיל במדיום המכיל דוקסיציקלין כדי להתחיל את הביטוי של ארבעת הגנים.

הניחו את התאים הללו בחממה, החליפו את המדיום כל יום עד שהמושבות הופכות גדולות מספיק כדי לקטוף אותן. מושבות צריכות להיות גלויות לראשונה כשבוע לאחר תחילת התכנות מחדש. הם צריכים להיות גדולים מספיק כדי להרים אותם בסביבות היום ה-20.

כעת, לאחר שחלפו 20 יום, אנו יכולים להמשיך ולבחור מושבות IPS לפני בחירת מושבות. יש לזכור לראות את המספר הנדרש של 24 צלחות באר מצופות ג'לטין עם DR מוקרן גמא ארבע מיתוסים שעה עד שעתיים לפני הקטיף. יש להאכיל את המושבות על הצלחות על ידי הוספת מדיום טרי ממש לפני הקטיף להוסיף 50 מיקרוליטר של מאגר HEPA לבארות של צלחת 96 באר עם תחתית V מיד לפני הקטיף, לשטוף את הכלי המכיל את המושבות שייקטפו פעם אחת עם PBS ולהוסיף 10 מ"ל PBS לצלחת ניתן לאסוף אשכולות תאי IPS תחת סטריאו או מיקרוסקופ הפוך.

בוחרים את המושבות בעזרת קצה פיפטה קטן ומעבירים אותן לבאר בצלחת 96 בארות המכילה PBS על מנת להסיר את האשכולות. עיגול מצויר עם קצה פיפטה סביב האשכול כדי לפרק את המתמטיקה. כעת ניתן לחלץ את התאים המתוכנתים מחדש באמצעות הפיפטר הרב-ערוצי, 20 מיקרוליטר של טריפסין מתווספים לכל אחד.

ובכן מצננים אותו למעלה ולמטה שלוש פעמים, דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר הדגירה של ארבע דקות, 100 מיקרוליטר של מדיום ES מתווספים למושבות הנחמדות של הטריפס. צנרת אותו למעלה ולמטה 10 פעמים והעבירו שישה שיבוטים בכל פעם.

מצלחת 96 בארות לצלחת 24 בארות באמצעות קצה בכל מיקום אחר ב-12 המקומות מגדלים תאי פיפטר על צלחת 24 בארות במעלה של 37 סנט, 5% CO2 אינקובטור עד שהתאים מגיעים ל-80 עד 90% Cofluency מתאים למעדנייה עם תאי ES כנראה יהיו מוכנים להתרחב תוך שלושה עד שבעה ימים כמה ימים לאחר מכן. כעת, כשתאי ה- IPS מתלכדים, שואבים את המדיום ושוטפים את התאים עם מיל אחד של היפים לחלוטין מוציאים את ההיפים ומוסיפים 100 מיקרוליטר של טריפסין חד פעמי ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה עם טריפסין, הוסיפו 400 מיקרוליטר של מדיום ESL והשהו את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצרו תרחיף תא בודד.

תרחיף התא הבודד בנפח 500 מיקרוליטר מהבאר 24 מועבר לאחר מכן לבאר אחת של צלחת שש בארות ומודגר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 עד שהתאים מגיעים לשטף של 80 עד 90% בצלחת שש הבארות. בשלב זה, אתה יכול להמשיך להגביר תאים לניתוח דרומי, פיצוצים, זריקות, מבחני טרטומה או מבחני התמיינות במבחנה. וכדאי לזכור להקפיא שסתומי מלאי של תאים אלה כדי שלא תאבד את המלאי היקר הזה של תאי IPS.

זה עתה הראינו לכם כיצד לגרום לפלוריפוטנטיות בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות מערכת אנטי-ויראלית הניתנת להשראה. אז תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.