Name: יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: למד כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות מערכת לנטיווירוסית. הפרוטוקול מדגים הזרקת ארבעה גורמי שעתוק לשחזור תאים מובדלים למצב פלוריפוטנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

שלב 1: להפשיר 293 תאים צלחת לייצור lentivirus. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 9 מ&quot;ל של מדיום + DMEM בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של 293 מניות קפוא מהטנק חנקן נוזלי ולשים את הבקבוקון בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס עד התאים ביותר (אך לא כולם) הם הפשירו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מבקבוקון מקום מקפיא לשפופרת 15 מ&quot;ל של שלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 180g במשך 5 דקות, ולאחר מכן למחוק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם 10 מ&quot;ל של מדיום + DMEM, ולהעביר לצלחת 100 מ&quot;מ מצופה ג&#39;לטין. דגירה התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד שהם ומחוברות 80-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבר של 293 תאים: תאים לשטוף עם PBS, לשאוב PBS, ולהוסיף 4 מ&quot;ל לכל צלחת 10 ס&quot;מ של 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA, ו דגירה דקות 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מנות ידי הקשה, resuspend עם 10 מ&quot;ל DMEM + בינוני להעביר צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 180g במשך 5 דקות, ואת לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים של DMEM + בינוני לשבור את התאים לתוך ההשעיה תא בודד על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולהתאים את הריכוז 5 תאים לכל 8x10 מ&quot;ל עם מדיום FP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים ב 6 תאים 8x10 (10 מ&quot;ל) לכל צלחת 100 מ&quot;מ תרבות, דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> שלב 2: Transfect 293 תאים עם פלסמידים lentivirus וירוס קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צלחת 10 ס&quot;מ כל אחת, להשתמש 10 מיקרוגרם של FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 או c-myc) עמוד השדרה lentivirus עם 2.5ug של PMD-G ו - 7.5 מיקרוגרם של pPax2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד aliquoting שלושה פלסמידים לתוך צינור, לספק 30μl של מגיב 6 transfection Fugene לתוך צינור שנייה המכיל 500μl של DMEM ללא נסיוב ומערבבים בעדינות אצבע על ידי הקשה ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת ה-DNA טיפה אחר טיפה לתוך הצינור Fugene 6/DMEM-containing, לערבב בעדינות על ידי הקשה אצבע דגירה של 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ה-DNA / 6 Fugene dropwise מורכב לתוך צלחת של 293 של ו דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר: לשאוב transfection מגיב המכילים בינוני, מוסיפים 5 מ&quot;ל של מדיום ES טרי התא, ולהחזיר את התאים אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 48 שעות ו 72 שעות לאחר transfection, לאסוף את המדיום של 293 זה באמצעות מזרק חד פעמי של 10 מ&quot;ל סטרילי, סינון זה באמצעות 0.45-מיקרומטר גודל מסנן נקבוביות צלולוזה אצטט, והעברת לשפופרת 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את supernatant וירוס על ידי ultracentrifugation. Resuspend גלולה וירוס בנפח הרצוי ולעשות amixture של חלקים שווים של המדיום המכיל Oct-3/4-, Sox2-, Klf4 ו-c-myc-lentiviruses. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם עושה את הנגיף, או להכין Oct4-neo/rtTA Oct4-GFP/rtTA MEFs (מעבר &lt;3) 90% confluency ב 10 ס&quot;מ מנות (2x10 6 תאים לכל מנה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום תרבות לשטוף עם 10 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS, להוסיף 1 מ&quot;ל לכל צלחת של 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של המדיום תרבות, להשעות את התאים לתא אחד, להעביר צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים, ולהתאים את הריכוז 4 תאים 8x10 לכל מ&quot;ל. העברת 10 מ&quot;ל של השעיה תא (8x10 5 תאים) על צלחת בגודל 10 ס&quot;מ מצופה ג&#39;לטין. דגירה את המנה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מתוך קערה פיברובלסטים, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום וירוס המכיל את. דגירה תאים 4 שעות עד לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 לשאוב את המדיום מתוך קערה פיברובלסטים, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום ES טרי התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני קבוע תא ES עם דוקסיציקלין בינוני המכיל ליזום את הביטוי של ארבעת הגנים, או במילים אחרות, ליזום תכנות מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות כתב Oct4, ניאו, אז ליזום סעיף התרופה בכל עת בין 6 ל 9 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את בינונית בכל יום עד המושבות להיות גדול מספיק כדי להיות נטל. מושבות צריך קודם להיות גלוי כשבוע לאחר תחילת של תכנות מחדש. הם צריכים להיות גדולים מספיק כדי להיות הרים סביב יום 20. </li></ol> שלב 3: הרמת מושבות iPS יום לפני קטיף: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed את המספר הדרוש של ג&#39;לטין מצופה 24 גם צלחות עם γ-מוקרן DR4 MEFs </li></ol> בחירת המשובטים על יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיד המושבות על הצלחות 1-2 שעות לפני קטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של PBS על הבארות של צלחת תחתית ה-V-96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחת המכילה מושבות להיות נטל פעם אחת עם PBS ולהוסיף 10ml של PBS על המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מושבות עם טיפים קטנים pipet 5μl (להגדיר את pipetman P20 על μl 4). העברת שיתוףlonies לבאר בצלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של טריפסין זה גם שימוש מרובה ערוצים (12) pipetor. Pipet למעלה ולמטה 3 פעמים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של המדיום ES למושבות trypsinized. Pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העברת 6 שיבוטים בכל פעם מצלחת 96-היטב צלחת 24 גם באמצעות טיפ במיקום כל האחרים pipetor 12 את המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים על צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד שהתאים מגיעים 80-90% confluency, האכלה יומית עם המדיום הסלולרי ES. תאים כנראה יהיה מוכן להרחיב על 3-7 ימים. </li></ol> שלב 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחבת תאים iPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS לחלוטין, להוסיף 0.1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.4 מ&quot;ל של המדיום ES ו להשעות את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה כדי השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא היטב של צלחת 6-היטב, להוסיף 1.5 ES מ&quot;ל בינוני התא דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור לתאים להגיע עד 80-90% confluency ב 6 גם הצלחות. בשלב זה, להכין מלאי קפוא של התאים, כדלקמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מלאי להקפיא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים של 2 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS לחלוטין, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של המדיום ES ו להשעות את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה כדי השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ&quot;ל, לספור את מספר התאים ספין מטה את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend את התאים בינוני ES לריכוז בבית 2x10 6 תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 תא הקפאה ES בינוני (DMSO 20% ES בינוני) ו aliquot אותו 0.5 מ&quot;ל לכל מבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 0.5 מ&quot;ל של ההשעיה תא להקפיא צלוחיות ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו את צלוחיות במיכל תא הקפאה ולשמור אותו -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה; להעביר חנקן נוזלי למחרת לאחסון ארוך טווח. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להשתמש, ועין מתנהלת מערכת lentiviral ליצור GFP חיובי, iPS תאים pluripotent מ MEFs נגזר עכברים Oct4-GFP/R26-M2rtTA ו Nanog-GFP/R26-M2rtTA. פרוצדורה זו היא שיטה יעילה להפקת תאים iPS כי זה מאפשר לשלוט על הביטוי transgene במהלך תהליך תכנות מחדש. למרות השימוש של וירוסים בדור של תאים iPS מונעת את השימוש של תאים אלה בסביבה קלינית, הליך זה מאפשר לנו לענות על כמה שאלות ביולוגיות העיקריים להדגיש את תהליך תכנות מחדש מוגדר עדיין.

<table><tbody><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת ips תאים mefs דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency יכול להיגרם על Murine מובחן על ידי התמרה ויראלית של Oct4, Sox2, Klf4, ו c-myc (טקהאשי ו יאמאנאקה, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). אנחנו פיתחו אסטרטגיה reprogramming שבו אלה גורמי תעתוק ארבעה הביעו מן דוקסיציקלין (DOX), ועין מתנהלת וקטורים lentiviral (Brambrink et al. 2008). באמצעות אלה בונה ועין מתנהלת, אנחנו יכולים להפיק המושרה גזע pluripotent (IPS) של תאים עובריים של עכבר fibroblasts (MEFs). בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך עבור הדור של lentiviruses ועין מתנהלת המבטאים את ארבעת גורמי תעתוק ולהראות כיצד להדביק MEFs עם וירוסים אלה כדי לייצר תאים iPS. באמצעות lentiviruses ועין מתנהלת, את הביטוי של ארבעת הגורמים מבוקרים על ידי תוספת של doxycyline עד בינוני התרבות. יתרונה של מערכת זו על הזיהום retroviral המסורתי הוא היכולת להפוך את הגנים לסירוגין כך קינטיקה של תכנות מחדש וביטוי דרישות הגן ניתן לנתח בפירוט.

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

ניתן להשרות פלוריפוטנציאליות בתאי עכבר מובחנים באמצעות טרנסדוקציה ויראלית של Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc‏ (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

לפני למעלה מ-50 שנה, הועלתה ההשערה כי ניתן להביא תאים בעלי התמיינות סופית, כגון פיברובלסטים של העור, לאמץ מצב פלוריפוטנטי הדומה לתאי גזע עובריים. הבסיס לקונספט זה היה התצפית שכל סוגי התאים, למעט מספר חריגים מינוריים, נושאים את אותו קוד גנטי, וההבדל היחיד בין סוגי התאים הוא האופן שבו הקוד נקרא. היכולת לשנות את הזהות התאית של תא מובחן למצב פלוריפוטנטי מכונה תכנות תאי מחדש.לאחר חמישה שנות מחקר, הוכח לאחרונה כי ביטוי מאולץ של ארבעה גורמי שחלוף (transcription factors) יכול לתכנת מחדש פיברובלסטים של העור להפוך לפלוריפוטנטיים. לממצא זה השפעה עצומה. מעבר לחשיבותו עבור הביולוגיה הבסיסית, הוא גם פותר את ההתנגדויות האתיות המרכזיות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים לצורך טיפול בהשתלה.כדי שהתכווץ מחדש יתרחש, ארבעה גנים המקודדים לגורמי השעתוק OC4, sox2, c-mic ו-K4 צריכים להיארז ולהוכנס לתשבילי תרבית רקמה של lentivirus. לאחר מכן, מוסיפים למנתח תרבית תאים המכיל צפיפות גבוהה של פיברובלסטים מדיום המכיל וירוס מופק, ובתוך מנתח זה מתרחש תהליך מדהים: חלק קטן מהפיברובלסטים נדבקים לכל ארבעת הווירוסים הנושאי גורמי שעתוק ומתחילים בתהליך של דה-דיפרנציאציה.הם עוברים שינויים דרסטיים במורפולוגיה ובשגשוג ומתחילים להתחלק לצבירים גדולים של תאי גזע פלוריפוטנטיים. לאחר שבועיים עד שלושה שבועות של תרבית בתנאים של תאי גזע עובריים, ניתן לבודד ידנית מושבות של פיברובלסטים שעברו תכנות מחדש ולהרביעם in vitro. לאחר טהרתם, ניתן להשתמש בתאים אלו ליצירת עכברים כימריים, שבהם אחוז מסוים של תאים המגזרים מאותם פיברובלסטים שעברו דה-דיפרנציאציה יכולים לתרום לרקמות שונות של העכבר.בכימרות שבהן החומר הגנטי של הפיברובלסטים המקוריים תרם לקו הנבט, הקוד הגנטי יעבור לדור הבא, ולאחר מכן לדור הבא ובא following. למרות שהשימוש במערכת הובלה ויראלית מהווה כעת מכשול ליישומים קליניים, סביר להניח שקושי זה ימומש בתוך זמן קצר. בסרטון זה, חברים במעבדת yin ידגימו כיצד מפיקים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים מפיברובלסטים עובריים של עכבר.שלום, אני גרנט וולטד מהמעבדה של רודולף ייש במכון וייטהד למחקר ביו-רפואי בקיימבריג', מסצ'וסטס. ואני טוביאס ברוברינק, גם אני ממעבדתו של ייש. היום נדגים לכם את יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים באמצעות הכנסת ארבעה cDNAs: OCT4, SOX2, c-MYC ו-KLF4, תוך שימוש בלנטי-וירוסים המבטאים ארבעת ה-cDNAs הללו מקידומת Tet-On CMV.דבר זה מאפשר בקרה מדויקת על הביטוי של ארבעת התראנסגנים הללו לאחר הדבקה של פיברובלסטים עובריים של עכבר. הפרוטוקול שאנו מציגים היום כולל טיפול בלנטי-וירוס שעלול להדביק תאי אדם. חיוני שתפעלו תמיד לפי נהלי בטיחות ותצרו קשר עם משרד הבטיחות שלכם לפני שתנסו לבצע זאת בעצמכם.כעת ניצור תאי IPS על מנת לייצר לנטיווירוס שיהפוך תאי mes לתאי IPS. יש להחדיר לתאי 2 9 3 שלושה פלסמידים: Paks two, המספק את הרכיבים הגנטיים הנדרשים לאריזה ויראלית; השלד הויראלי, שהוא לנטיווירוס FUW TE OCMV עם אחד מארבעת ה-CD aids T four: SOX two, KLA four או CMIC PMDG; וכן פלסמיד המבטא את הגליקופרוטאין של המעטפת של נגיף הסטומטיס וסיקולרי (VSV).תהליך זה יוצר את הנגיף שיניב נגיף אטרופי. לכן, יש להקפיד על נהלי BL2+ מתאימים. בסרטון זה, איננו מטפלים למעשה בנגיף זיהומי, ולכן איננו לובשים את חלוקי המעבדה הרגילים ואיננו נמצאים במתקן ה-BL2+ שלנו.לפני התעתוק, מפקיקים תאי 2, 9 3 מחנקן נוזלי ומגדלים אותם עד להגעה ל-90% Co fluency. לאחר מכן מתעתקים את התאים עם גן FU וממתינים 48 עד 72 שעות לביטוי הנגיף; בשלב זה, מסננים את המצע שבו שוהים התאים באמצעות מסנן של 0.45 micron ומרכזים אותו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. לאחר ריכוז הנגיף, ניתן להדביק את ה-MES כדי להפיק מקבצי IPS. במהלך שלבי הכנת הנגיף, מגדלים פיברובלסטים עובריים של עכבר במעבר של פחות משלוש פעמים עד להגעה ל-90%co fluency בצלחות של 10 סנטימטר, בכמות של כ-two times 10 to the six תאים לצלחת. בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו משתמשים ב-MES המבטאים את RTTA, החיוני לביטוי doxycycline, ו-GFP מהלוקוס האנדוגני OC four.תאי MES הם שליליים ל-GFP, אך תאי IPS אמיתיים הופכים לחיוביים ל-GFP. סמן זה מאפשר שיטה לזיהוי תאי mes שעברו תכנות מחדש; שאבו את מצע התרבית מהפיברובלסטים ושטפו עם 10 mils של hippies, EDTA, השליכו את ה-hippies EDTA והוסיפו חמישה mils של one times trypsin והדרימו בטמפרטורה של 37 degrees למשך 10 דקות. ה-Trypsin יעזור להרים את התאים מהתחתית של הצלחות.כעת הוסיפו תשעה ml של מצע תרבית כדי להחזיר את התאים לתליה כסספנסיית תאים בודדים והעבירו לשפופרת של 15 ml. לאחר מכן סובבו את התאים בצנטריפוגה עד להיווצרות משקע. לאחר השהייה מחדש של המשקע, ספרו את מספר התאים בסספנסיה והתאימו את הריכוז ל-8×10⁴ תאים ל-ml.כמות של 10 µL מתרחיף התאים מועברת לכלי פטרי בקוטר 10 cm המצופה בג'לטין. דגרו את הכלי למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. לאחר דגירה של לילה, שאפו את המצע מכלי הפיברובלסטים והוסיפו 10 µL של מצע המכיל את הנגיף לכלי. דגרו את התאים למשך ארבע שעות ועד לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2.ביום למחרת, שאבו את המצע מתוך צלחת עם פיברובלסטים ולאחר מכן הוסיפו 10 ml של מצע ESL טרי. בשלב זה, ניתן להקפיא את התאים, להרחיב אותם או להכינם לתחילת התכנות מחדש. כדי להתחיל בתכנות מחדש, החליפו את מצע ה-ESL הרגיל במצע המכיל doxycycline כדי להפעיל את הביטוי של ארבעת הגנים.הניחו תאים אלה באינקובטור והחליפו את המצע מדי יום עד שהמושבות יהיו גדולות מספיק כדי שניתן יהיה לבחור אותן. המושבות אמורות להפוך לנראות לראשונה כשבוע לאחר תחילת התכנות מחדש. הן אמורות להיות גדולות מספיק לבחירה בסביבות היום ה-20.לאחר שעברו 20 ימים, ניתן להמשיך בב soonה של מושבות IPS לפני בחירת המושבות. יש לזכור להכין את מספר הפלטות הנדרש של פלטות 24 בארות מצופות ג'לטין עם DR המקרין גמא שעה עד שעתיים לפני הבחירה. יש להזין את המושבות על הפלטות על ידי הוספת מצע טרי רגע לפני הבחירה; הוסף 50 µL של HEPES buffer לבארים של צלח 96 בארות בעבוד V מיד לפני הבחירה, שטוף פעם אחת ב-PBS את הצלח המכיל את המושבות לבחירה והוסף 10 mL של PBS לצלח. ניתן לבחור אשכולות תאי IPS תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי או מיקרוסקופ הפוך.בחרו את המושבות באמצעות טיפ קטן של פיפטה והעבירו אותן לבאר בצלחת בעלת 96 בארות המכילה PBS כדי להסיר את הצברים. יש לשרטט מעגל סביב הצבר בעזרת טיפ של פיפטה כדי לפרק את הגושים. כעת ניתן להוציא את התאים שעברו תכנות מחדש באמצעות פיפטה רב-ערוצית, ולהוסיף 20 microliters של tripsin לכל באר.שאיפה ופליטה (pipetting) למעלה ולמטה של התמיסה שלוש פעמים, דגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע דקות. לאחר דגירה של ארבע דקות, מוסיפים 100 µL של מצע ES למושבות. שאיפה ופליטה למעלה ולמטה 10 פעמים והעברה של שישה שיבטים בכל פעם.מעבירים מהצלחת בעלת 96 בארות לצלחת בעלת 24 בארות, תוך שימוש בטיפ בכל מיקום שני בפיפטור בעל 12 מקומות. לאחר מכן, התאים גודלים בצלחת בעלת 24 בארות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 עד שהתאים מגיעים ל-80 עד 90% התמסרות (confluency) בתוך מצע תרבית לתאי ES. התאים יהיו ככל הנראה מוכנים להתרחבות בעוד שלושה עד שבעה ימים. לאחר מספר ימים, כאשר תאי ה-iPS התמסרו, שואבים את המצע ושוטפים את התאים ב-1 mL של HBSS. מסירים את ה-HBSS לחלוטין ומוסיפים 100 µL של trypsin בריכוז 1×, ומדגירים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. לאחר הדגירה עם ה-trypsin, מוסיפים 400 µL של מצע ESL ומרחפים את התאים על ידי פיפטור למעלה ולמטה כדי להפיק סספנסיה של תאים בודדים.את ת сусפנסיית התאים הבודדים בנפח 500 µL מהבאר בלוח ה-24 מעבירים לבאר אחת בלוח בעל שש בארות ומדגירים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 עד שהתאים מגיעים ל-80% עד 90% התמלאות (confluency) בלוח בעל שש הבארות. בנקודה זו, ניתן להמשיך להעשרת תאים לצורך אנליזת Southern, הפקות (blasts), הזרקות, בדיקות טרטומה או בדיקות דיפרנציאציה in vitro. יש לזכור להקפיא מנות מאגר (stock vials) של תאים אלו כדי לא לאבד את מלאי תאי ה-IPS היקר.הראינו לכם כעת כיצד להשרות פלוריפוטנטיות בפיברובלסטים עובריים של עכבר באמצעות מערכת אנטי-ויראלית הניתנת להשראה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

עכבר Stemgent DOX ועין מתנהלת TF הגדר Lentivirus ניתן לתכנת מחדש fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הנגרמת על גזע pluripotent (שב"ס) תאים. כאן אנו מדגימים את פרוטוקול לביטוי DOX-ועין מתנהלת תכנות מחדש של העכבר גורמי תעתוק Oct4, Sox2, Klf4 ו c-myc ליצור מושבות iPS המבטאים משותף סמנים MES pluripotency.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים של עכבר לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ביעילות נמוכה על ידי ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. המתווכים הנדירים של תגובת התכנות מחדש מבודדים FACS באמצעות תיוג עם נוגדנים כנגד יצרני פני התא Thy-1.2, Ssea-1 ו-Epcam.

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

אנו מתארים כאן פרוטוקול ליצירת iCMs באמצעות מסירה בתיווך רטרו-וירוס של Gata4, Tbx5 ו-Mef2c במבנה פוליציסטרוני. פרוטוקול זה מניב אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאים מתוכנתים מחדש עם יעילות ואיכות משופרים והוא בעל ערך למחקרים עתידיים של תכנות מחדש של iCM.

דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

למד כיצד ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות מערכת לנטיווירוסית. הפרוטוקול מדגים הזרקת ארבעה גורמי שעתוק לשחזור תאים מובדלים למצב פלוריפוטנטי.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

גלה סרטונים נוספים