Name: בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: למדו לבודד ולנתח תאי גזע hematopoietic מהשליה העכברית. שיטות אלו מאפשרות לחקור את התפתחות תאי הדם והנישות המיקרו-סביבתיות הייחודיות בתקופת העוברות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. העובר הסרת לנתיחה השליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, עוברים תחילה יש לבודד סכרים בהריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים מומתים על פי הנהלים שאושרו - במקרה שלנו אנחנו הולכים להשתמש מנה קטלנית של חומר הרדמה isoflurane </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לרסס את הבטן עם אתנול לעשות חתך קטן עם זוג מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע את העור בשתי הידיים כדי לחשוף את הבטן וחותכים לפתוח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים את קרני הרחם ולאסוף אותם באמצעות מספריים בכל קצה דיסטלי. מניחים את הקרניים הרחם בצלחת פטרי מלאות PBS ומניחים על קרח. כמו כן, זכרו לשטוף מספר פעמים עם PBS לפני לבודד את השליה. כעת אנו יכולים לבודד את השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שני מלקחיים, להתחיל בזהירות קילוף רקמת רירית הרחם סביב conceptuses העובר. אדם צריך להיזהר לא לנקב או בכל דרך אחרת לגרום נזק מבני העוברים, כמו זה יסבך צעדים לנתיחה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את conceptuses מבודד בצלחת פטרי חדש עם PBS על הקרח וממשיכים עד שכל conceptuses שוחררו מן רירית הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד conceptus כדי בצלחת פטרי חדש עם PBS תחת מיקרוסקופ עם שני מלקחיים הקליפה decidua מן השליה. הסר כמה שיותר decidua ככל האפשר לתאים decidua יפריע ההשעיה תא בודד ו cytometry הזרימה. תנועה חלקה פילינג מתמשך מומלץ כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את שק החלמון מן השליה בצומת בין שני איברים ומשוך בעדינות את שק החלמון וכלי vitelline מן השליה. יש להקפיד לא לשבש את הצלחת כוריוני של השליה, במיוחד עם עוברי מוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות מחזיק את צלחת כוריוני של השליה עם זוג אחד מלקחיים וחבל הטבור עם אחר, למשוך את חבל הטבור עובר המצורפת מן השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תא עודף רקמה ענק בשולי השליה כדי למזער תא clumping במהלך הכנת ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השליה במיכל מתאים, כגון צינור פלקון 15 מ&quot;ל, עם PBS 5% FCS ועל קרח. האם זה עבור כל השליות גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, אתה יכול להמשיך עם הכנת מתלה יחיד תא עבור cytometry זרימה, מבחני פונקציונליים, כגון במבחנה תרבות או השתלה, או להכין השליה שלמה קיבעון רקמות לחסום קפוא קבוע הטבעה עבור אימונוהיסטוכימיה בסופו של דבר. </li></ol> 2. הכנת ההשעיה תא בודד של רקמות השליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו כעת להראות לך איך ליצור השעיה תא יחיד מן השליה לניתוח FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין ההשעיה תא יחיד מן השליה, מכני דיסוציאציה האנזימטית נדרשת. ראשית להכין פתרון collagenase 0.1% ב-PBS עם FCS 10% ו 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים של תמיסת collagenase את השליות, תלוי כמה יש לך. נפח זה פעמיים את נפח השליה בין 5 מ&quot;ל-2 מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 16-G מצויד על מזרק 5 מ&quot;ל ל מכנית לשבש את רקמת ידי passaging הפתרון collagenase ואת השליה באמצעות מחט 3 פעמים. חזור עם מחט 18-G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדוגמה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 45 דקה, collagenase פתרון מעבר התא באמצעות מחט 20-G, ואת דגירה של 45 דקות נוספות, ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה hr 1.5 הכולל, collagenase פתרון מעבר לתא באמצעות 22-G ו-G 25 מחטים 3 פעמים עם מחט אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינון דרך פילטר מדגם 50-מיקרומטר מחוברת צינורית חדש פלקון 15 מ&quot;ל, לשטוף עם PBS FCS 5% ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 300 × ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, יש לנו ההשעיה תא בודד מתאים לניתוח FACS או מבחני תפקודית. </li></ol> 3. רקמות קיבוע עבור סעיפים קפוא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר לבודד את השליה מעובר אחד, הם ממוקמים קר 1X PBS. בדרך כלל צלחת 96, עובד הכי טוב עבור השליות צעירים (E8.5-11.5), אך עם השליות מבוגרים, E12.5 ומעלה, צלחת 24 גם עשוי להיות יותר נוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליה כל מועבר לתוך חדש מלא היטב עם paraformaldahyde 4% טרי או מופשר PFA. עבור E12.5 שליה, הרקמה מועברת היטב חדשה ביד, אבל עבור E10.5 תוכל להסיר את PBS בזהירות עם טפטפת ולהוסיף את PFA. חשוב השליה הוא שקוע לגמרי בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות, בהתאם לגיל וגודל הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה לתוך סוכרוז 30%, או אם הרקמות קטנים מאוד שביר, לשאוב PFA ולהוסיף את סוכרוז ישירות. בשלב זה, השליות יהיה צף פתרון. בואו הרקמות ללון בבית 4 ° C.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב לילה סוכרוז 30%, רקמות צריך בסופו של דבר לשקוע לתחתית הבאר, מעיד על cryopreservation הנכון. הסר מחצית הפתרון סוכרוז להחליף את נפח עם אוקטובר והמקום רקמות בחזרה 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. זה מאפשר חדירה אוקטובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות 100% עבור אוקטובר 1 שעה, לאחר מכן זה יכול להיות מוטבע. </li></ol> 4. הטבעת רקמות קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבניות פלסטיק עם תווית זיהוי רקמות המתאים (למשל עובש להראות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את רקמת מתוך הפתרון אוקטובר וחתך את השליה במחצית המכוונת על ידי השליה בצורת דיסק עם הצד חבל הטבור כלפי מטה בזהירות לחתוך עם סכין גילוח נקי ולוודא כדי להזיז את הלהב קדימה ואחורה לפני שחרור הלחץ על מנת להבטיח לחתוך אפילו. השליה היא בחצי כדי להשיג את הטוב ביותר prientation מאוחר יותר לדמיין את HSCs השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד השליה וחצי בתחתית התבנית עם סף לחתוך במגע עם המשטח התחתון של התבנית. חזור עם עובש חדש החצי השני. עבור E10.5 השליות, חצאים שניהם יוטלו לתוך תבנית זהה שימוש באותה טכניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוזג אוקטובר לתוך התבנית, זה יכול להיות קשה כדי לשמור על השליות בכיוון הנכון. אבטח את השליה במקום על ידי החזקת מחצית רקמת עם מלקחיים. לאט לאט שופכים פתרון אוקטובר לתבנית ולהימנע ייצור כל הבועות. עבור E10.5 השליות, להחזיק חצי רקמה על ידי מלקחיים והשאר חצי רקמות אחרות נגד הצד החיצוני של מלקחיים. לאט לאט שופכים פתרון אוקטובר כפי שתואר עבור E12.5 השליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עובש מלא אוקטובר, במהירות למקום עובש על קרח יבש, אוקטובר יהפוך פלאש לבן הקפאת רקמת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית לתוך שקית פלסטיק קטן המכיל Drierite ומיד חנות ב -80 ° C במקפיא. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

הפרוצדורות המתוארות פרוטוקול זה יאפשר בידוד הדמיה של רקמות השליה גזע hematopoietic ו ובתאים. לסיכום מקיף על תשואה מספר הסלולר צפוי של HSCs בשליה ושאר איברים hematopoietic העובר לאורך התפתחות העובר אנו מתייחסים Gekas, et al. 2005. עבור לוקליזציה של HSCs בפיתוח תאים hematopoietic אחרים השליה אנו מתייחסים רודוס, et al. 2008.

רשימת חומרים: 100mm גלוקוז 10mm NaN3 15 מ&quot;ל חרוטי צינורות (BD) 16-G, 18-G, 20-G, G ו-22-25-G מחטים (BD) סוכרוז 30% הפתרון צלחות פטרי 35mm (BD) 4% Paraformaldehyde 50 - מ &#39;מסננים תא (Celltrics) 5 מ&quot;ל מזרקים (BD) אלקליין תשתית phosphatase קיט אני (וקטור האדום, וקטור) אלקליין תשתית phosphatase Kit III (וקטור כחול, וקטור) פתרון לאנטיביוטיקה (פניצילין / סטרפטומיצין, P / S) Collagenase סוג אני (Sigma) Cryomold פנויה הדגימה ויניל תבניות (10mm x 10mm x 5 מ&quot;מ, רקמות-Tek) Cytokeratin נוגדן ראשוני (DakoCytomation) מלקחיים Dissection, פלדה אל חלד או טיטניום, מספר 5 או 55 Drierite עוברית שור סרום (FBS) מיקרוסקופ Fisherbrand פלסטיק שקופיות מיילר (פישר) גלוקוז אוקסידאז 1000u/ml Levamisole (וקטור) הרכבה התקשורת, מימיות מבוססי הרכבה בינונית (VectamountTM א.ק.) סרום סוס רגיל (וקטור) חיתוך טמפרטורה אופטימלית (אוקטובר, רקמות-Tek) התשתית peroxidase ערכת DAB (וקטור) בופר פוספט (PBS) עם סידן / מגנזיום (w Ca2 + / Mg2 +) בופר פוספט (PBS) ללא סידן / מגנזיום (w / o Ca2 + / Mg2 +) Slide קופסת פלסטיק (מחזיקה 100 שקופיות) צינורות פלסטיק (PVC Nalgene 180 אינו רעיל Autoclavable) פוליפרופילן Round-Bottom מבחנה, 5 מ&quot;ל (12x75 מ&quot;מ, BD פלקון) Proteinase K 20mg/ml פתרון (Amresco) מחקר בינלאומי מוצרים קורפ סופר פאפ פן HT * סמנים שקופיות (2,5 מ&quot;מ, פישר) רקמות תרבות שטופלו בצורת U (מסביב למטה) צלחות 96-24-טוב או טוב (BD פלקון) Tween20, SigmaUltra (Sigma) קיט הגברה Tyramide (Invitrogen) Vectastain ABC phosphatase אלקליין רגילה Kit (וקטור) Vectastain ABC רגיל עלית Kit (וקטור)

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יש את היכולת העצמית לחדש וליצור כל סוגי תאים של שושלות דם במהלך חייו של הפרט. HSCs כל לצוץ במהלך ההתפתחות העוברית, שלאחריו גודל הבריכה שלהם מתוחזק על ידי עצמית חידוש חלוקות תא. זיהוי המקור האנטומי של HSCs והאירועים התפתחותי קריטי בוויסות תהליך של התפתחות HSC כבר מסובך כמו באתרים אנטומיים רבים להשתתף במהלך hematopoiesis העובר. לאחרונה זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים שבהם HSCs נוצרות והורחב נישות microenvironmental ייחודי (Gekas, et al 2005, רודוס, et al 2008). כתוצאה מכך, השליה מהווה מקור חשוב של HSCs במהלך הופעתה שלהם והרחבת הראשונית. במאמר זה, אנו מראים טכניקות לנתיחה עבור בידוד של השליה Murine מ E10.5 ו E12.5 עוברים, התואמת את שלבי ההתפתחות של תחילת HSCs ואת שיא בגודל של הבריכה HSC את השליה, בהתאמה. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ניתוק האנזימטית מכנית של רקמת השליה לתוך ההשעיה תא יחיד לשימוש cytometry זרימה או מבחני תפקודית. מצאנו כי השימוש collagenase להשעיה תא בודד של השליה נותן תשואות מספיק HSCs. גורם חשוב המשפיע תשואה HSC מן השליה היא מידת הניתוק מכני לפני, ומשך טיפול אנזימטי. אנו מספקים גם פרוטוקול להכנת קבוע קפוא סעיפים רקמת השליה להדמיה של פיתוח HSCs ידי אימונוהיסטוכימיה בתוך נישות הסלולר המדויק שלהם. כמו אנטיגנים ספציפיים hematopoietic אינם נשמרים במהלך הכנת סעיפים פרפין מוטבע, אנו משתמשים באופן שגרתי חלקים קפואים קבוע localizing HSCs השליה אבות.

זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.

לתאי גזע המטופואטיים (HSCs) יש את היכולת להתחדש באופן עצמי ולהוליד את כל סוגי התאים של שושלות הדם לאורך כל חיי הפרט. ...

שלום, אני מיקולה וברוכים הבאים למעבדה שלי. המיקוד העיקרי של המעבדה שלנו הוא חקירת התפתחות תאי גזע המטופואטיים. במהלך העוברגנזה, זיהינו את השליה כאיבר המטופואטי מרכזי ומצאנו כי תאי גזע המטופואטיים נוצרים ומתרבים בשליה בתוך נישות של מיקרוסביבה ייחודית.כך, לשליה ערך עצום כמקור לתאי גזע המטופואטיים במהלך הופעתם והתרחבותם הראשונית. כיום, חברי המעבדה שלי יציגו את הטכניקות הניסיוניות הדרושות לבידוד תאי גזע המטופואטיים מהשליה ולהדמיות של HCS בנישות המיקרו-סביבתיות הייחודיות שלהם. שלום, אני כריס גקה מהמעבדה של ד"ר חנה מולה במחלקה לביולוגיה של תאים מולקולרית והתפתחותית ב-UCLA.היום אראה לכם כיצד לבצע דיסקציה של שליית עכבר וכיצד להכין תרחיף של תאים בודדים מרקמת השליה לצורך אנליזה ב-fax עבור תאי גזע המטופואטיים עובריים. אני קטרינה רודס, ואני אראה לכם כיצד להכין רקמת שליה עבור אימונוהיסטוכימיה. אז בואו נתחיל.ראשית, יש לבודד את העוברים מהאמהות ההריות. בעלי החיים מושמדים בהתאם לנהלים המאושרים. במקרה שלנו, נשתמש במינון קטלני של חומר ההרדמה isof fluorine.ראשית, רססו את הבטן באתנול ובצעו חתך קטן בעזרת מספריים. קרעו את העור בעזרת שתי הידיים כדי לחשוף את חלל הבטן ופתחו את הפריטוניאום בעזרת פינצטה. הרימו את קרני הרחם ואספו אותן באמצעות מספריים בכל קצה דיסטלי.הניחו את קרני הרחם בצלחת פטרי מלאה ב-PBS והניחו על קרח. כמו כן, זכרו לשטוף מספר פעמים ב-PBS לפני בידוד השליה באמצעות שתי פינצטות. התחילו לקלף בזהירות את רקמת האנדומטריום המקיפה את מושגי העובר.עובריים אלו הם מהיום העוברי 12.5, גיל התפתחותי שבו תאי גזע המטופואטיים, או HSCs, נמצאים בשיאם בשליה. יש להיזהר לא לדקור או לגרום לנזק מבני אחר לעוברים, שכן הדבר יסבך את שלבי הנתיחה העוקבים. הניחו את המושגים המבודדים בצלחית פטרי חדשה עם PBS על קרח, והמשיכו עד שכל המושגים שוחררו מהאנדומטריום.העבירו conceptus אחד לפטרי dish חדשה עם PBS שהוצבה תחת המיקרוסקופ. ובאמצעות שתי פינצטות, קלפו את ה-deidra מה-G placenta. הסירו כמה שיותר מה-deidra, שכן תאי ה-deidra יפריעו לתהליך.באמצעות תרחיף תאים בודדים וציטומטריית זרימה. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, מומלץ לבצע תנועת קילוף רציפה וחלקה. יש לשים לב, בעת עבודה עם עוברים צעירים יותר, כגון עוברים ביום העשברי 10.5 או E 10.5, ה-deidra תקיף את כל העובר והשליה (conceptus).בניגוד לעוברים ביום E 12.5, ביום E 10.5 תאי HSC רק מתחילים להופיע בתוך השליה. שימו לב להבדל הגדל המשמעותי בין עוברים ביום E 10.5 לבין עוברים ביום E 12.5. גזרו את שקיק החלמון מהשליה בנקודת החיבור בין שני האיברים, ומשכו בעדינות את שקיק החלמון ואת כלי הדם של הבליין (beline vessels) מהשליה.יש להקפיד לא להפריע ללוחית הבחירה של השליה, במיוחד עםו Embryos מוקדמים. החזיקו בזהירות את לוחית ה-CHO של השליה עם זוג פנפלות אחד ואת חבל הטבור עם זוג אחר. הסיטו את חבל הטבור ואת העובר המחובר ממנו הרחקה מהשליה.הסיר רקמת תאים ענקיים עודפת מקצות השילייה. על מנת למזער התגבשות של תאים במהלך הכנת תגשול של תאים בודדים, אסוף את השילייה למכל מתאים, כגון מבחורת פלקון (Falcon tube) בנפח 15 ML עם PBS ו-5% FCS, והנח אותה על קרח. בצע זאת עבור כל השיליות שהוחדרו. בשלב זה, ניתן להמשיך להכנת תגשול של תאים בודדים עבור בדיקות תפקודיות של ציטומטריית זרימה, כגון תרבית in vitro או השתלה, או להכין את השילייה כולה לצורך קיבוע רקמות וטמיעה של בלוק קפוא מקובע עבור אימונוהיסטוכימיה עתידית.כעת נראה לכם כיצד להכין תרחיף תאים בודדים משליה לצורך אנליזת fax. ראשית, הכינו תמיסת collagenase בריכוז 0.1% ב-PBS עם 10% FCS ותמיסת penicillin streptomycin בריכוז 1%.השתמש במחט בכיול 16 gauge המחוברת למזרק של 5 ml כדי לפרק מכנית את הרקמה על ידי העברת תמיסת הקולגנאז והשלייה דרך המחט שלוש פעמים. חזור על הפעולה עם מחט בכיול 8 gauge. לאחר דגירה של 45 דקות, הנח את הדגימה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז 5%CO2 למשך 45 דקות.במהלך המעבר עם קולגנאז, העבירו את תמיסת התאים דרך מחט בכי মাপ 20 והדגירו למשך 45 דקות נוספות ב-37 °C לאחר סך הכל שעה וחצי של הדגרה בקולגנאז. העבירו את תמיסת התאים דרך מחטים בכי মাপ 22 ו-25 שלוש פעמים עם כל מחט. כעת סננו את הדגימה דרך מסנן של 50 µm המחובר לפקק של מבחנת Falcon חדשה בנפח 15 ML, שטפו עם PBS פלוס 5% FCS וסבבבבו בצנטריפוגה ב-4 °C למשך חמש דקות ב-300 ×g. בנקודה זו, התקבלה סספנסיה של תאים בודדים המתאימה לניתוח FACS.אני אראה לכם כיצד להכין רקמה של שליה עבור אימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה של רקמת שליה כדי למקם תאי גזע המטופואטיים בתוך המיקרו-סביבה השלייתית. מיד לאחר בידוד השליה מכל עובר, מעמידים אותן ב-1X PBS קר; בדרך כלל פלטה של 96 בארות היא המתאימה ביותר עבור שליות צעירות מהימים העובריים 8.5 עד 11.5, אך עבור שליות מבוגרות יותר, E 12.5 ומעלה, פלטה של 24 בארות עשויה להיות נוחה יותר.כל שליה מועברת לבאר חדשה המלאה ב-4%PARALDEHYDE שהופשר acabado או PFA עבור שליה מיום E 12.5. הרקמה מועברת לבאר חדשה באופן ידני. עבור שליה מיום E 10.5, ניתן להסיר את ה-PBS בזהירות בעזרת פיפט ולהוסיף את ה-PFA.חשוב שהשליה תהיה טבולה לחלוטין למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 4°C, בהתאם לגיל ולגודל הרקמה. לאחר מכן, העבירו את הרקמה ל-30% sucrose. אם הרקמות קטנות ושבירות מאוד, שאבו את ה-PFA והוסיפו את ה-sucrose ישירות.בשלב זה, השיליה תצוף בתמיסה. יש להשאיר את הרקמה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר השלב הלילי ב-30% sucrose, הרקמות אמורות לשקוע לבסוף לתחתית הבאר, דבר המעיד על שימור קריוגני תקין. לאחר מכן, יש להוציא מחצית מתמיסת ה-sucrose ולהחליף את הנפח ב-OCT.החזירו את הרקמה בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה עד שעתיים. פעולה זו מקלה על חדירת ה-OCT. לבסוף, העבירו את הרקמה ל-100% OCT למשך שעה אחת, לאחר מכן ניתן לבצע שיקוע (embedding).סמנו את התבניות הפלסטיקיות במי التعريف המתאימים של הרקמה. הוציאו את הרקמה מתמיס ה-OCT וחלקו את השילשייה לשניים על ידי הנחת השילשייה בצורת הדיסק כך שצד השכר השפוע פונה כלפי מטה, וחתכו בזהירות עם להב תער נקי, תוך הקפדה להזיז את הלהב קדימה ואחורה לפני שחרור הלחץ כדי להבטיח חיתוך אחיד.את השליה חותכים לחצי כדי להשיג את ההתמצאות המיטבית לצורך ויזואליזציה מאוחרת של תאי הגזע ההמטופואטיים של השליה. לאחר מכן, מניחים חצי של שליה בתחתית התבנית, כך שהקצה החתוך יהיה במגע עם המשטח התחתון של התבנית. חוזרים על הפעולה עם תבנית חדשה עבור החצי השני.עבור שליות בשלב E 10.5, ניתן להניח את שני החצאים באותה תבנית באמצעות אותה טכניקה. בעת מזיגת ה-OCT לתוך התבנית, עלול להיות קושי לשמור על השליה באוריינטציה הנכונה. אבטחו את השליה במקומה על ידי החזקת חצי הרקמה עם פינצטה עבור שליה בשלב E 10.5.החזיקו חצי מהרקמה באמצעות פינצטה והניחו את החצי השני של הרקמה כנגד הצד החיצוני של הפינצטה. לאחר מכן, שפכו לאט תמיסת OCT כפי שמתואר עבור E 12.5. ברגע שהתבנית מלאה ב-OCT, הניחו אותה במהירות על קרח יבש.ה-OCT יהפוך ללבן בעת הקפאה מהירה של הרקמה; הניחו את התבנית בתוך שקית פלסטיק קטנה ואחסנו מיד במקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C. כאן מוצג חתך מייצג של שליה בשלב E 10.5. חשוב שהחתכים שלכם יכללו את ה-chorionic plate המוצג בתחתית התמונה ואת ה-placental labyrinth, אזור השליה המקל על חילוף חומרים בין העובר לאם, המוצג במרכז.סדרה זו נצבעה עם נוגדן CD 31, שסימן את האנדותל באדום. הטרופובלסטים המוצגים בחום מסומנים על ידי cytokeratin. הלבירינת מכיל הן כלי דם עובריים המסומנים באדום, והן חללי דם אימהיים המרופדים על ידי הטרופובלסטים החומים.התאים הכחולים הם תאי גזע ופרוגניטורים המטופיים ראשוניים חיוביים ל-CD 41; שימו לב שהם ממוקמים בכלי הדם העובריים. הרגע הצגנו כיצד לבצע דיסקציה ולהכין תרחיף של תאים בודדים משליית, וכן כיצד לזהות תאי גזע המטופיים של השלייה באמצעות ציטומטריית זרימה. כמו כן, הצגנו כיצד להכין חתכי רקמה של שלייה לצורך ויזואליזציה של תאי גזע המטופיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה.חשוב לשים לב למספר פרמטרים קריטיים בעת ביצוע הלימודים הללו. במהלך הניתוח של השליה, חשוב לעבוד במהירות ולשמור על העוברים והתמיסות קרים ככל האפשר, כדי לשמר חיוניות תאית גבוהה להכנת תרחיף של תאים בודדים. מידת הדיסוציאציה המכנית לפני הטיפול האנזימטי וזמן האינקובציה במהלכו הם הגורמים הקריטיים ביותר המשפיעים על החיוניות ועל בריאות התאים.ולסיום, בעת ביצוע אימונוהיסטוכימיה, קיבוע יתר עלול להוות בעיה עבור אנטיגנים מסוימים, ומצד שני, קיבוע חסר עלול להוביל להרס של הרקמה. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

isolation-and-analysis-of-hematopoietic-stem-cells-from-the-placenta

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

מתואר כאן פרוטוקול לבידוד ומחקר נוסף של הלויקוציטים החודרים של ה-decidua basalis ו-decidua parietalis - הממשק האם-עובר האנושי. פרוטוקול זה שומר על שלמות סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כפי שהוכח על ידי ניתוח זרימה ציטומטרית.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

המתואר כאן הוא פרוטוקול לבידוד וניתוח הלויקוציטים החודרים של רקמות בממשק האם-עובר (רחם, דצידואה ושליה) של עכברים. פרוטוקול זה שומר על שלמותם של רוב סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כולל ניתוח זרימה ציטומטרית.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תאי גזע המטופויטיים ארוכי טווח (LT-HSCs) ותאי HSC לטווח קצר (ST-HSCs) באמצעות מערכת הדיווח Hoxb5.

שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר

למדו לבודד ולנתח תאי גזע hematopoietic מהשליה העכברית. שיטות אלו מאפשרות לחקור את התפתחות תאי הדם והנישות המיקרו-סביבתיות הייחודיות בתקופת העוברות.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

גלה סרטונים נוספים