ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

קביעת מספר התאים בתרבית חשוב סטנדרטיזציה של תנאים התרבות בביצוע ניסויים quantitation מדויק. בסרטון זה אנו מדגימים כיצד תאים נספרים באמצעות hemacytometer.

קביעת מספר התאים והתרבית חשובה בסטנדרטיזציה של תנאי התרבית ובעת ביצוע ניסויים בהם יש צורך במספרי תאים מדויקים. כאן נראה לך כיצד לספור תאים באמצעות ציטומטר המו, ולחשב את ריכוז התאים הקיימים בהשעיה. אנו גם נראה לך כיצד לקבוע את מספר התאים ברי הקיימא הקיימים בתרבית שלך באמצעות בדיקת Trian Blue Viability.

היי, אני ריקי כאן במעבדה של ד"ר LAN ברשת המעבדות לפתולוגיה מולקולרית במזרח טנסי. היום אני הולך להראות לכם איך לספור תאים ותרחיפים ואיך לקבוע את הכדאיות שלהם. על מנת להכין את הציטומטר ההמו לספירת תאים, תחילה עליך לנקות את פני השטח שלו ואת החלקת הכיסוי הנלווית עם 70% אתנול.

החלקת הכיסוי והחלקה צריכים להיות נקיים, יבשים וללא מוך, טביעות אצבעות וסימני מים. לאחר מכן, הרטיבו מעט את שולי הציטומטר ההמו במי ברז ולחצו על הכיסוי להחליק מעליו. החלקת הכיסוי צריכה לנוח באופן שווה על אזור ספירת הכסף.

עכשיו אנחנו מוכנים לתרחיף התא כדי להכין את תרחיף התא לספירה. ראשית, אם התאים גדלים בתרביות חד-שכבתיות, נתק את התאים מפני השטח של הצלחת באמצעות טריפסין כפי שניתן לראות בסרטון להדבקת תאים. לאחר שהתאים התנתקו מהצלחת, יש לדלל אותם לפי הצורך לקבלת תרחיף אחיד.

הקפד לפזר את כל הגושים בתרחיף בעת השימוש בציטומטר ההמו. מומלצת ספירת תאים מקסימלית של 20 עד 50 תאים לכל מילימטר ריבוע אחד. כאשר אתה מוכן לטעון את ה-hemo Cytometer עם דגימת התא שלך, השתמש במיקרו פיפטר כדי להעביר את תרחיף התאים לקצה תא הספירה של ההמו ציטומטר.

החזק את קצה הפיפטה מתחת להחלקת הכיסוי והוציאו טיפה אחת של מתלה. המתלה יימשך מתחת להחלקת הכיסוי על ידי פעולה נימית. לאחר שמילאתם את החדר הראשון, מלאו את חדר הספירה השני ואתם מוכנים לספור את התאים שלכם לפני שתתחילו לספור.

התאים מאפשרים לתאים להתיישב למספר דקות. זה גם עוזר למחוק את כל הנוזלים העודפים לאחר שהתאים התייצבו. ניתן לצפות בשקופית במיקרוסקופ בהגדלה של פי מאה.

אתה אמור לראות את האזור המרכזי הגדול של הרשת, הגובל בקבוצה של שלושה קווים מקבילים. חלוקות משנה בתוך האזור המרכזי הגדול גובלות גם הן בשלושה קווים מקבילים וכל תת-חלוקה מחולקת ל-16 ריבועים קטנים יותר על ידי קווים בודדים. תאים באזור זה צריכים להיות מפוזרים באופן שווה מבלי להתגבש.

אם התאים אינם מפוזרים באופן שווה, יש לשטוף ולטעון מחדש. ההמו ציטומטר משתמש במונה כף יד כדי לספור תאים בכל אחד מארבעת הריבועים הפינתיים והמרכזיים לספור תאים. נגיעה בקו האמצעי של הקו המשולש בחלק העליון והשמאלי של הריבועים לא ספרה תאים הנוגעים בקו האמצעי של הקווים המשולשים בצד התחתון או הימני של הריבוע.

חזור על הספירה עבור חדר הספירה השני. לאחר שספרת את התאים, תוכל לקבוע את מספר התאים למיליליטר. לשם כך, קח את הספירה הממוצעת של תאים לריבוע והכפל בגורם הדילול וב-10,000 כדי לקבל את מספר התאים בדגימה שלך.

הכפל את התאים למיליליטר בנפח הכולל של תרחיף התאים ממנו נלקחה הדגימה. כעת אנו מוכנים לקבוע את כדאיות המתלים שלנו. כדי לקבוע את מספר התאים ברי הקיימא בדגימה שלך, נשתמש תחילה בשילוב D trian blue של 0.5 מיליליטר של 4% טריאן כחול 0.03 מיל, HBSS ו-0.1 מיל של תרחיף התאים בצינור קטן מעורבב היטב, וניתן לצינור לעמוד חמש דקות לפני טעינת הציטומטר ההמו.

התאים הקיימים צריכים להיות לא מוכתמים, אך תאים מתים יופיעו כחולים מתחת לציטומטר ההמו. ספור את המספר הכולל של תאים ואת המספר הכולל של תאים ברי קיימא, תאים לא מוכתמים וחשב את אחוז התאים הקיימים בדגימה שלך. לאחר שתסיים, טהר את החלקה של הכיסוי בציטומטר המו על ידי שטיפה עם אתנול 70% ולאחר מכן מים נטולי יונים.

תן לו להתייבש באוויר ואחסן אותו עד לשימוש עתידי. זה עתה הראינו לכם כיצד לקבוע את מספר התאים המתורבתים שלכם ואת כדאיותם. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בכל הניסויים שלך.