Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

טכנולוגיית תרבית רקמות מצאה יישום נרחב בתחום הביולוגיה של התא. עם זאת, תאים מתורבתים דורשים תחזוקה שוטפת כדי להישאר בריאים. כאשר התאים מגיעים לשטף משותף, הם חייבים להיות מתורבתים או עוברים.

כישלון לעשות זאת מביא לירידה בצמיחה ובסופו של דבר למוות של תאים. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לשמור על תאי תרבית רקמה עבור קווי תאים דבקים ותרחיפים. היי, אני ריקי כאן במעבדה של ד"ר LAN ברשת המעבדות לפתולוגיה מולקולרית במזרח טנסי.

היום אני רוצה להראות לכם שתי טכניקות לאריזת השעיה והדבקת תאים. כדי להעביר לוח של תאים. נרצה להתחיל עם תרבית ראשונית שגדלה בשטף בצלחת פטרי של 60 מילימטר או בבקבוק תרבית רקמה בגודל 25 סנטימטר רבוע המכיל מדיום תרבית רקמה של חמישה מיל.

אנו מתחילים בהסרת כל המדיום מהתרבית הראשונית עם הפיפטה הסטרילית. לאחר מכן אנו שוטפים את שכבת התא הדבק פעם או פעמיים בנפח קטן של 37 מעלות צלזיוס HBSS ללא סידן ומגנזיום. להסיר שאריות של סרום בקר עוברי שעלול לעכב את פעולת האנזים טריפסין שיוסיף בשלב הבא.

לאחר מכן, הוסף מספיק תמיסת טריפסין EDTA חמה לתרבית כך שתכסה את שכבת התא הדביקה. לאחר מכן תוכלו להניח את הצלחת על מגש חימום של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתיים. לאחר הדגירה, הקש על תחתית הצלחת על משטח ישר כדי לעקור את התאים.

בדוק את התרבית במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים מעוגלים כלפי מעלה, מה שמעיד על כך שהם מנותקים מפני השטח. אם התאים אינם מנותקים מספיק, החזירו את הצלחת למגש החימום למשך דקה או שתיים נוספות. לאחר התבוננות במשקף, שטפו את הכלי במדיום שלם והכניסו את התרחיף לצינור חרוטי של 15 מיל המכיל שני מילים של מדיום שלם.

סובב את התאים כלפי מטה כדי לגלול אותם ולהשעות מחדש את הגלולה במדיום שלם. כעת, הוסף נפח שווה של תרחיף תאים לכל אחת מהצלחות הטריות שסומנו כראוי. לחלופין, ניתן לספור את התאים באמצעות ציטומטר המו ולדלל אותם לצפיפות הרצויה כך שניתן להוסיף מספר מסוים של תאים לכל צלחת.

הקפידו לתייג כל צלחת עם תאריך תת-התרבות ומספר המעבר. לאחר הוספת תרחיף התאים, הניחו מיל אחד של מדיום טרי לכל תרבית חדשה. כעת דגרו את הצלחות בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2.

לאחר שדגרת את התאים למשך הלילה, הוסף מדיום טרי לצלחות והחזיר אותם ל -37 מעלות. לאחר שהצלחת גדלה לשטף, תוכלו לעבור את הצלחת שוב על ידי חזרה על הליך זה ולהמשיך לעבור לפי הצורך. כעת נראה לך כיצד להעביר תאים בתרבית מתלה.

אריזת תאים בתרבית תרחיף פשוטה יותר מאשר לתאי הדבקה. לפני אריזת תרביות תרחיף, יש לתחזק את התאים על ידי הזנה כל יומיים-שלושה עד שהם מגיעים לשטף משותף, כלומר כאשר התאים מתקבצים יחד בתרחיף והמדיום נראה טוריד. כאשר הבקבוק מסתחרר.

לשם כך, הסר את בקבוק תאי ההשעיה מהחממה, והקפיד לא להפריע לאלה שהתיישבו בבקבוק. תחתית אספטית, מוציאים וזורקים כשליש מהמדיום מהבקבוק ומחליפים אותו בנפח שווה של מדיום טרום חם ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר שהחלפת את המדיום, סובב את הבקבוק והחזיר אותו לאינקובטור, שנמצא ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.

אם יש פחות מ-15 מיל, מדיום בבקבוק דוגר את הבקבוק במצב אופקי כדי לשפר את המגע בין התא למדיום. אחרת, ניתן לדגור את הבקבוק אנכית בימים בהם התרבויות אינן מוזנות. בדוק אותם על ידי סיבוב הדירות כדי להשעות מחדש את התאים.

הקפד להקפיד על כל שינויי צבע במדיום המעידים על צמיחה מטבולית טובה. ברגע שהתרבויות מתלכדות, שאמורות להיות כ -2.5 מיליון תאים למיל, אתה יכול לעבור אותן. שוב, זה עתה הראינו לך כיצד להעביר תאים מתורבתים הן עבור תרביות דבקות והן עבור תרביות תרחיף.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בכל הניסויים שלך.