הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה
2 ביולי 2008
בתאי יונקים Cultured נמצאים בשימוש נרחב במחקרים בביולוגיה של התא. וידאו זה מתאר את הכישורים הבסיסיים הנדרשים להקפיא ולאחסן תאים כיצד לשחזר מניות קפוא.
תרביות תאים משמשות במגוון רחב של יישומים מחקריים ואבחנתיים. לעיתים קיים צורך לאחסן שורות תאים לעבודה עתידית על מנת לשמר את התאים, למנוע הזדקנות תאית (senescence), להפחית את הסיכון לזיהום ולמזער את השפעות הסחף הגנטי. ניתן להקפיא שורות תאים לצורך אחסון לטווח ארוך.
בסרטון זה, נראה לכם כיצד להקפיא תאים שגודלו הן בשכבה אחת (monolayer) והן בתליה (suspension), וכיצד להפשיר אותם לצורך גידול מחדש. שלום, אני ריקי מהמעבדה של ד"ר LAN ברשת מעבדות הפתולוגיה המולקולרית במזרח טנסי. היום אראה לכם כיצד להקפיא תאים לאחסון לטווח ארוך וכיצד להפשיר אותם מחנקן נוזלי.
כדי להקפיא תאי הידבקות אנושיים, יש להתחיל בהסרתם מהפלטה כפי שנעשה בתהליך אריזה של תאים. יש לקחת בחשבון כי לצורך שימור בקירור (cryo-preservation), מומלץ להשתמש בתאים הנמצאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי (log phase). לאחר שהתאים התנתקו והפסקתם את תגובת ה-trypsin על ידי הוספת סרום או מצע המכיל סרום, העבירו את תרחיף התאים לפרועת צנטריפוגה סטרילית והוסיפו שני מיליליטרים.
ניתן לאחד תרחיפי תאים במצע מלא עם סרום משלוש צלחונות או יותר מאותה תרבית משנית של אותו מקור לשפחור אחד. סובב את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 עד 350 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, הסר את העילאי ותלה את המשקע ב-10 mils בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.
השלימו את המצע, הוסיפו נפח שווה של מצע הקפאה בטמפרטורה של ארבע מעלות, ערבבו את התאים היטב, ולאחר מכן הניחו את המבחנה על קרח וספרו את התאים. באמצעות המוסימטר (hemocytometer), דללו את התוך באמצעות מצע הקפאה נוסף כדי להגיע לריכוז תאים סופי של 1 מיליון או 10 מיליון תאים למילליטר להקפאת תאים מבקבוק של 25 סמ"ר כמעט מלא (confluent). השעיקו מחדש בכ-3 מ"ל של מצע הקפאה והעבירו בעזרת פיפטה מנות של 1 מ"ל של תמיסות התאים למבחנות קריו (cryovials) מסומנות בנפח של 2 מ"ל.
יש לוודא שהפקקים על המבחנות מהודקים. יש להניח את המבחנות במקפיא של 80- מעלות למשך שעה אחת ועד ללילה, ולאחר מכן להעבירן למקפיא אחסון בחנקן נוזלי. הקפאת תאים מתרבית סספנסיה דומה בעיקרה להקפאת תאים משכבה אחת (monolayer).
ההבדל העיקרי הוא שאין צורך לטריפסין תרביות סספנסיה. ראשית, העבירו את סספנסיית התאים למבחנה לצנטריפוגה וסבבו במשך 10 דקות ב-300 עד 350 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את העל-משקע והשעיו את המשקע במצע הקפאה בטמפרטורה של ארבע מעלות, בריכוז של 1 מיליון עד 10 מיליון תאים ל-mL.
לאחר מכן, העבירו מנות של 1 mL מתלה התאים למבחנות קריו והקפיאו. כפי שבוצע עבור תרביות בשכבה אחת (monolayer), שהודגמו בפרק הקודם, כדי להפשיר ולהשיב מבחנות קפואות: ראשית, הוציאו את מבחנת התאים ממקפיא החנקן הנוזלי והניחו אותה מיד באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C.
יש לנער את המבחנה ללא הפסקה עד להפשרת המצע, פעולה הדורשת בדרך כלל פחות מ-60 שניות. לאחר ההפשרה, יש לנגב את חלקו העליון של המבחנה ב-70% ethanol לפני הפתיחה. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים שהופשרו למבחנה צנטריפוגית סטרילית המכילה 2 mL של מצע מלא חם ו-20% fetal bovine serum centrifuge.
בצעו זאת למשך 10 דקות ב-150 עד 200 Gs בטמפרטורת החדר. שלב זה יסיר כל שארית של DMSO לאחר הצנטריפוגה; השליכו את על־הנוזל (supernatant) והשעיקו בעדינות את משקע התאים בכמות קטנה של כ-1 mL של מצע גידול מלא ו-20% FBS. העבירו זאת לצלחת תרבית המסומנת כראוי המכילה את כמות המצע המתאימה. בדרך כלל, נדרש 1 mL של תרחיף תאים ב-5 עד 20 mL של מצע גידול.
כעת, ניתן להעביר את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C לצמיחה למשך 24 שעות. יש לוודא שהתאים נצמדו לפלטה; לאחר חמישה עד שבעה ימים, או כאשר אינדיקטור ה-pH במצע משנה את צבעו, יש להחליף את המצע. יש להחזיק את התרביות במצע המכיל 20% FBS עד להקמתה מחדש של שורת התאים.
אם שיעור ההשגשוג נמוך ביותר, ייתכן שרק תת-אוכלוסייה מהתרבית המקורית גדלה. יש להיזהר במיוחד מכך בעבודה עם שורות תאים הידועות כפסיפסיות (mosaic). במידה ויש לשלוח את התרביות, ניתן לעשות זאת בקלות הן עבור תרביות בשכבה אחת והן עבור תרביות בסספנסיה.
בבקבוקי תרבית רקמה בנפח 25 סנטימטר, התאים גדלים עד להגעה לכמעט התמזגות (confluency) בשכבה אחת, או עד לצפיפות הרצויה בתרחיף. עבור תרביות בשכבה אחת, יש להסיר תחילה את המדיום ולאחר מכן למלא את הבקבוק במדיום טרי. חובה למלא את הבקבוק במדיום באופן מלא כדי למנוע מהתאים להתייבש במידה והבקבוקים יתהפכו במהלך ההובלה.
עבור תרביות בסספנציה טריות, מוסיפים מצע עד למילוי הבקבוק. סוגר הבקבוק מהודק ומאובטח באמצעות Parafilm. הבקבוק נסגר בתוך שקית פלסטיק עמידה לדליפות או בתוך מיכל אטום אחר שנועד למנוע דליפה.
במקרה שהבקראק יינזק, המיכל הראשוני יוכנס למיכל מבודד משני כדי להגן עליו מפני טמפרטורות קיצוניות במהלך ההובלה. על החלק החיצוני של החבילה תודבק תווית סימון סכנה לקונה. בדרך כלל, תרביות מובלות באמצעות שליחים באותו לילה או למשך הלילה.
הראינו לכם כיצד להקפיא ולהפשיר תרביות תאים אנושיים, הן עבור תאים נצמדים והן עבור תאים בסמיסיה. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בכל הניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים טכניקות חיוניות להקפאה ואחסון של תאי יונקים בתרבית, וכן לשחזורם ממלאים קפואים. אחסון תאים נכון הוא קריטי לשימור של שורות תאים למחקרים עתידיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- טכניקות לתרבית תאים
- שימור תאים
רקע
- תאי יונקים בתרבית נמצאים בשימוש נרחב במחקר.
- הקפאת תאים מסייעת במניעת הזדקנות תאית (senescence) וזיהומים.
- אחסון ארוך טווח של שורות תאים חיוני עבור ניסויים עתידיים.
- טכניקות הפשרה נחוצות לצורך החייאת תאים קפואים.
מטרת המחקר
- להדגים את תהליך הקפאת תאים לאחסון לטווח ארוך.
- להסביר כיצד להפשיר תאים קפואים לצורך גידול בהמשך.
- להקנות מיומנויות מעשיות לחוקרים העובדים עם תרביות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקפאת תאים הגדלים בשכבה אחת (monolayer) ובתרחיף (suspension).
- שימוש בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
- נהלי הפשרה לשחזור תאים קפואים.
- הדגמה של טכניקות בסביבת מעבדה.
תוצאות עיקריות
- הקפאה ואחסנה מוצלחות של תאי יונקים.
- הדגמה של טכניקות הפשרה יעילות.
- שימור חיוניות התאים לאחר הפשרה.
- הנחיות למניעת טעויות נפוצות באחסון תאים.
מסקנות
- טכניקות של הקפאה והפשרה הן קריטיות לעבודת תרביות תאים.
- שימוש בשיטות נכונות יכול להגביר את אורך החיים של שורות תאים.
- מיומנויות אלו הן בסיסיות עבור חוקרים בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שימור ושחזור אמינים של תאים הם הבסיס לשמירה על מודלים פרה-קליניים עקביים ולהבטחת הדירות בתהליכי תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות. הקפאה נכונה ממזערת סחף גנטי וסיכוני זיהום, ותומכת בשמירה ארוכת טווח על שלמות קווי התאים למחקר תרגומי. טכניקות אלו מאפשרות מקור תאים סטנדרטי וניתן להרחבה לאורך שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים, ובכך מפחיתות שונות במחקרים מכניסטיים ובמאמצים לזיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר שימור של שורות תאים יציבות גנטית לצורך מעורבות עקבית של מטרה וניתוח מסלולים.
- ערך תפעולי: מפחית את הצורך בתתי-תרביות תכופים, ובכך ממזער סחף פנוטיפי ושונות ניסויית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מאגרי תאים מתחדשים במעבר נמוך (low-passage) לצורך סינון ברזולוציה גבוהה (high-throughput screening) הניתן לשחזור והסמכת בדיקות.
- ערך תפעולי: תומך בעקביות בין סדרות (batch-to-batch consistency) בבדיקות מבוססות תאים, ובכך משפר את מהימנות הנתונים לאורך קמפיינים של סינון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מבטיח המשכיות של מודלים תאיים הרלוונטיים למחלה, משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- ערך תפעולי: מקל על הפצה סטנדרטית של תאים בין צוותים ואתרים, ובכך תומך בשיתוף פעולה בין-תפקודי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הקפאת תאים (Cryopreservation) משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן מקור תאים אמין לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות ובדיקות פרה-קליניות, ובכך מבטיחה עקביות של המודל לאורך השלבים השונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אספקת תאיים יציבים ומאופיינים היטב לצורך תיקוף מטרות והבהרת מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקות באמצעות מאגרי תאים סטנדרטיים ונקיים מזיהומים, המתאימים לסריקת תרכובות בעלת הדירות.
- אנליטיקה: מייצרת קלטים תאיים עקביים וכמותיים המשפרים את רמת הוודאות בקריאות של תגובה למינון ובדיקות חיוניות.
- מחקר תרגומי: שומרת על נאמנות המודל משלב הגילוי המוקדם ועד למחקרים פרה-קליניים, ובכך מפחיתה סיכון ביולוגי בקידום מועמדים מובילים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריבה יכולת של בנק תאים מרכזי וניתן לשימוש חוזר, המגדיר סטנדרט לאספקת תאים על פני פרויקטים ואזורים גיאוגרפיים שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי מזעור הסחף הגנטי והבטחת עקביות פנוטיפית במבחני תאים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להקפאה, הפשרה ואריזה.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי הבטחת מודלים פרה-קליניים אמינים ותוצרים ביולוגיים עקביים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מותאמת סיכונים על ידי אספקת מערכות תאים מהימנות לתיקוף מטרות ואופטימיזציה של מועמדים מובילים (lead optimization).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקה אספטית וטיפול בחומרי קריו-הגנה לשמירה על חיוניות התאים.
- תלוי בגישה לציוד הקפאה בקצב מבוקר ותשתית אחסון בחנקן נוזלי.
- מחייב נהלי עבודה סטנדרטיים בין הצוותים להבטחת שיעורי התאוששות עקביים של התאים.
- דורש התאמה של מצע ההקפאה וצפיפות התאים בהתאם לסוג התא ומאפייני הגדילה שלו.
- מוגבל על ידי רגישות קו התאים לקריו-הגנים ולסטרס של הקפאה-הפשרה, העלולים להשפיע על יעילות ההתאוששות.
