Name: הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למד טכניקות הקפאה והפשרה של תאי יונקים בתרבית לשימור לטווח ארוך. השיטה מדגימה שימוש בחנקן נוזלי לאחסון תאים ושחזורם לצמיחה נוספת במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול טקסט מלא לגישה זו ניסיוני זמין <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">הפרוטוקולים נוכחי בביולוגיה של התא.</a>

למחברים אין הצהרות על ניגוד עניינים.

הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

בתאי יונקים Cultured נמצאים בשימוש נרחב במחקרים בביולוגיה של התא. זה דורש מספר מיומנויות מיוחדות כדי להיות מסוגלים לשמור על מבנה, תפקוד, התנהגות, ביולוגיה של תאים בתרבית. וידאו זה מתאר את הכישורים הבסיסיים הנדרשים להקפיא ולאחסן תאים כיצד לשחזר מניות קפוא.

בתאי יונקים Cultured נמצאים בשימוש נרחב במחקרים בביולוגיה של התא. וידאו זה מתאר את הכישורים הבסיסיים הנדרשים להקפיא ולאחסן תאים כיצד לשחזר מניות קפוא.

תאי יונקים בתרבית משמשים באופן נרחב במחקרי ביולוגיה של התא. הדבר דורש מספר מיומנויות מיוחדות על מנת שניתן יהיה לשמר את ה...

תרביות תאים משמשות במגוון רחב של יישומים מחקריים ואבחנתיים. לעיתים קיים צורך לאחסן שורות תאים לעבודה עתידית על מנת לשמר את התאים, למנוע הזדקנות תאית (senescence), להפחית את הסיכון לזיהום ולמזער את השפעות הסחף הגנטי. ניתן להקפיא שורות תאים לצורך אחסון לטווח ארוך.בסרטון זה, נראה לכם כיצד להקפיא תאים שגודלו הן בשכבה אחת (monolayer) והן בתליה (suspension), וכיצד להפשיר אותם לצורך גידול מחדש. שלום, אני ריקי מהמעבדה של ד"ר LAN ברשת מעבדות הפתולוגיה המולקולרית במזרח טנסי. היום אראה לכם כיצד להקפיא תאים לאחסון לטווח ארוך וכיצד להפשיר אותם מחנקן נוזלי.כדי להקפיא תאי הידבקות אנושיים, יש להתחיל בהסרתם מהפלטה כפי שנעשה בתהליך אריזה של תאים. יש לקחת בחשבון כי לצורך שימור בקירור (cryo-preservation), מומלץ להשתמש בתאים הנמצאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי (log phase). לאחר שהתאים התנתקו והפסקתם את תגובת ה-trypsin על ידי הוספת סרום או מצע המכיל סרום, העבירו את תרחיף התאים לפרועת צנטריפוגה סטרילית והוסיפו שני מיליליטרים.ניתן לאחד תרחיפי תאים במצע מלא עם סרום משלוש צלחונות או יותר מאותה תרבית משנית של אותו מקור לשפחור אחד. סובב את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 עד 350 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר הסבב, הסר את העילאי ותלה את המשקע ב-10 mils בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס.השלימו את המצע, הוסיפו נפח שווה של מצע הקפאה בטמפרטורה של ארבע מעלות, ערבבו את התאים היטב, ולאחר מכן הניחו את המבחנה על קרח וספרו את התאים. באמצעות המוסימטר (hemocytometer), דללו את התוך באמצעות מצע הקפאה נוסף כדי להגיע לריכוז תאים סופי של 1 מיליון או 10 מיליון תאים למילליטר להקפאת תאים מבקבוק של 25 סמ"ר כמעט מלא (confluent). השעיקו מחדש בכ-3 מ"ל של מצע הקפאה והעבירו בעזרת פיפטה מנות של 1 מ"ל של תמיסות התאים למבחנות קריו (cryovials) מסומנות בנפח של 2 מ"ל.יש לוודא שהפקקים על המבחנות מהודקים. יש להניח את המבחנות במקפיא של 80- מעלות למשך שעה אחת ועד ללילה, ולאחר מכן להעבירן למקפיא אחסון בחנקן נוזלי. הקפאת תאים מתרבית סספנסיה דומה בעיקרה להקפאת תאים משכבה אחת (monolayer).ההבדל העיקרי הוא שאין צורך לטריפסין תרביות סספנסיה. ראשית, העבירו את סספנסיית התאים למבחנה לצנטריפוגה וסבבו במשך 10 דקות ב-300 עד 350 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את העל-משקע והשעיו את המשקע במצע הקפאה בטמפרטורה של ארבע מעלות, בריכוז של 1 מיליון עד 10 מיליון תאים ל-mL.לאחר מכן, העבירו מנות של 1 mL מתלה התאים למבחנות קריו והקפיאו. כפי שבוצע עבור תרביות בשכבה אחת (monolayer), שהודגמו בפרק הקודם, כדי להפשיר ולהשיב מבחנות קפואות: ראשית, הוציאו את מבחנת התאים ממקפיא החנקן הנוזלי והניחו אותה מיד באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C.יש לנער את המבחנה ללא הפסקה עד להפשרת המצע, פעולה הדורשת בדרך כלל פחות מ-60 שניות. לאחר ההפשרה, יש לנגב את חלקו העליון של המבחנה ב-70% ethanol לפני הפתיחה. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים שהופשרו למבחנה צנטריפוגית סטרילית המכילה 2 mL של מצע מלא חם ו-20% fetal bovine serum centrifuge.בצעו זאת למשך 10 דקות ב-150 עד 200 Gs בטמפרטורת החדר. שלב זה יסיר כל שארית של DMSO לאחר הצנטריפוגה; השליכו את על־הנוזל (supernatant) והשעיקו בעדינות את משקע התאים בכמות קטנה של כ-1 mL של מצע גידול מלא ו-20% FBS. העבירו זאת לצלחת תרבית המסומנת כראוי המכילה את כמות המצע המתאימה. בדרך כלל, נדרש 1 mL של תרחיף תאים ב-5 עד 20 mL של מצע גידול.כעת, ניתן להעביר את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C לצמיחה למשך 24 שעות. יש לוודא שהתאים נצמדו לפלטה; לאחר חמישה עד שבעה ימים, או כאשר אינדיקטור ה-pH במצע משנה את צבעו, יש להחליף את המצע. יש להחזיק את התרביות במצע המכיל 20% FBS עד להקמתה מחדש של שורת התאים.אם שיעור ההשגשוג נמוך ביותר, ייתכן שרק תת-אוכלוסייה מהתרבית המקורית גדלה. יש להיזהר במיוחד מכך בעבודה עם שורות תאים הידועות כפסיפסיות (mosaic). במידה ויש לשלוח את התרביות, ניתן לעשות זאת בקלות הן עבור תרביות בשכבה אחת והן עבור תרביות בסספנסיה.בבקבוקי תרבית רקמה בנפח 25 סנטימטר, התאים גדלים עד להגעה לכמעט התמזגות (confluency) בשכבה אחת, או עד לצפיפות הרצויה בתרחיף. עבור תרביות בשכבה אחת, יש להסיר תחילה את המדיום ולאחר מכן למלא את הבקבוק במדיום טרי. חובה למלא את הבקבוק במדיום באופן מלא כדי למנוע מהתאים להתייבש במידה והבקבוקים יתהפכו במהלך ההובלה.עבור תרביות בסספנציה טריות, מוסיפים מצע עד למילוי הבקבוק. סוגר הבקבוק מהודק ומאובטח באמצעות Parafilm. הבקבוק נסגר בתוך שקית פלסטיק עמידה לדליפות או בתוך מיכל אטום אחר שנועד למנוע דליפה.במקרה שהבקראק יינזק, המיכל הראשוני יוכנס למיכל מבודד משני כדי להגן עליו מפני טמפרטורות קיצוניות במהלך ההובלה. על החלק החיצוני של החבילה תודבק תווית סימון סכנה לקונה. בדרך כלל, תרביות מובלות באמצעות שליחים באותו לילה או למשך הלילה.הראינו לכם כיצד להקפיא ולהפשיר תרביות תאים אנושיים, הן עבור תאים נצמדים והן עבור תאים בסמיסיה. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בכל הניסויים שלכם.

freezing-thawing-and-packaging-cells-for-transport

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו קופא גוונים האדם עובריים קווי גזע.

הקפאת ES תאים אנושיים

מאז ג'יימס תומסון ואח' פיתח טכניקה בשנת 1998 לבודד ולגדל הס בתרבות, הקפאת תאים לשימוש מאוחר יותר, מפשיר והרחבת תאים ממלאי קפוא הפכו נהלים חשוב לבצע בתרבות הס שגרה התא. מכיוון שתאי הס רגישים מאוד הלחצים של מקפיא הפשרה, טיפול מיוחד חייב לנקוט. כאן אנו וידגים עבור מפשיר במהירות תאים הס ממניות חנקן נוזלי, ציפוי אותם על תאים עובריים של עכבר מזין, ולאט לאט הקפאת אותם לצורך אחסון לטווח ארוך.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

הקפאת ייבוש הוא לעתים קרובות דרך קלה ונוחה לקבלת מוצרים יבשים של תאים חיידקיים קיימא. נושא של התהליך הוא הישרדות תא. אנחנו נפרט כאן הליך לחקור כיצד הישרדות תא בתקופת הקפאת ייבוש מושפעת מהמאפיינים של הניסוח בשימוש.

ניסוחים להקפאת ייבוש של חיידקים והשפעתם על הישרדות תא

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

שורות תאים דרוזופילה הם ריאגנטים חשוב למחקר בסיסי והן ביו. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפשיר, subculturing של הקפאה קריוגנית של שורות תאים דרוזופילה נפוץ כדי לסייע לחוקרים שילוב השימוש האלה ריאגנטים במחקר שלהם.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.

תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

למד טכניקות הקפאה והפשרה של תאי יונקים בתרבית לשימור לטווח ארוך. השיטה מדגימה שימוש בחנקן נוזלי לאחסון תאים ושחזורם לצמיחה נוספת במעבדה.

הקפאה, הפשרה, ותאי אריזות התחבורה

גלה סרטונים נוספים