Name: התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: למדו את שיטת ההתרבות וההבדלה של תאים דנדריטים מיאלואידית מתאי מבשר ממח עצם עכברים. השיטה כוללת בידוד תאים מעצם השוקה והירך, ניתוח זרימה ומורפולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JB נתמך על ידי studentships מן למדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC). תמיכה עבור פרויקט זה סופק על ידי מכוני הבריאות הקנדית Research, גרנט MOP-67066.

פרוטוקול זה הותאם מ לוץ ואח&#39; 1. קציר ועיבוד של מח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של עצם השוק לבין עצם הירך: להרדים את העכבר תורם ולרסס את הרגליים עם אתנול 70%. תפוס את הקרסול first היטב עם מלקחיים בוטה מתחילים לחתוך את העור ואת שרירי הבסיסי לחשוף את עצם השוק. כדי למנוע פגיעה בעצמות, לחתוך לאט במקביל השוקה, והשאיר על כנו מפרק הברך. כדי לנקות את עצם הירך, מפרק הברך לשתק את ידי אחיזה עם מלקחיים בוטה. לנקות את השרירים עם זוג מספריים חדות מלקחיים מעוקל. המשך כלפי מעלה עד מפרק הירך חשוף ומספריים יכול להיות ממוקם בין ראש עצם הירך ואת מפרק הירך. מוציאים את העצמות על ידי חיתוך משותף בין עצם הירך לבין המותן ומקום לתוך בופר פוספט (PBS) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת מח עצם: השרירים הנותרות נקי של עצמות בעזרת מספריים מלקחיים מעוקל. לחתוך את העצם אפיפיזות כל ולאתר את חלל במרכז. בעזרת מזרק 10 מ&quot;ל עמוסה PBS ו 25G0.5 &quot;מחט, שטוף מוח העצם לתוך צלחת פטרי ללא רקמה מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד של מוח העצם: השתמש סוף הגומי של הבוכנה של מזרק 1mL לנתק את מח העצם לתוך ההשעיה תא בודד (להשתמש מעלה ומטה, לא מגרד תנועה). איסוף מח העצם בצינור בז חרוטי, ולשטוף את מוח העצם שיורית עם PBS. </li></ol> התרבות של תאים דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בוושינגטון התקשורת לספור מבשרי DC על hemocytometer (איור 1). אתה תראה תאים בגדלים שונים; מבשרי DC הם הגדולים והמבריקים. דיפרנציאלי לספור רק את התאים האלה. משתי עצמות הירך ושני tibias של C57Bl wild-type / 6 העכבר (6-8 שבועות), אתה יכול לצפות בין 25-40 x 10 6 מבשרי DC הכולל. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> איור 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים בצפיפות של 2 x 10 5 מבשרי DC / mL בוושינגטון התקשורת בתוספת 40 ng / mL רקומביננטי Murine GM-CSF. פלייט תאים שאינם רקמת מצופה צלחות פטרי קלקר. </li></ol> הוסף מדיה (יום 3) כדי לרענן את התקשורת, להוסיף חצי מהנפח הכולל של התקשורת טריים בתוספת 40 ng / mL GM-CSF. החלף שליש התקשורת (יום 6) ו ההבשלה כדי לרענן את התקשורת, להסיר בזהירות שליש מהנפח הכולל של התקשורת להחליף את נפח התקשורת עם טרי DC בתוספת 40 ng / mL GM-CSF ביום 6 של התרבות. אם תרצה, תאים דנדריטים יכול להיות מגורה על התבגרות באמצעות ציטוקינים או חיוג כמו ligands הקולטן. בסרטון, DCs היו התבגר ידי גירוי לילה עם 5 ng / mL CPG. קציר של תאים דנדריטים תרבות הבירה הושלמה (איור 2). תאים יהיה גם השעיה דבק רופף הצלחת. תאים דבק ניתן להסיר על ידי גירוד מגרד את המנה עם תרבית רקמה ושטיפה עם PBS. המספר הכולל של תאים יגדל פי 5-8 במהלך התרבות שבוע ארוך תקופת הבחנה, אם כן, מצפים לקצור 1-1.6 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="איור 2" width="407" height="358" /> איור 2 ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DC התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI-1640 מדיה, בתוספת: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% בסרום שור עוברית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 IU / mL פניצילין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% L-גלוטמין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1% 2-mercaptoethanol </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X שאינם חיוניים חומצות אמינו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X נתרן pyruvate </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקומביננטי Murine GM-CSF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> rmGM-CSF (Peprotech inc, ניו ג&#39;רזי, לא קטלוג. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

DCs שימושיים מחקרים של אינטראקציות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות, והוא יכול להיות מועסקים וקטור חיסון. בסרטון הזה, אנחנו הוכיחו את הצעדים כדי לבודד מח עצם להבדיל תאים דנדריטים מיאלואידית במבחנה. בעקבות התקופה תרבות, תאים אלו יכולים להיות דמיינו מיקרוסקופית שני תאים כמו חסיד, אשר לעתים קרובות בעלי דנדריטים, ולא חסיד תאים עגולים. DCs ניתן להשפיע עוד יותר על ידי פועם עם אנטיגן להצגת אנטיגן או גירוי של ייצור ציטוקינים לבין מולקולה upregulation costimulatory בעזרת ציטוקינים ו / או חיוג כמו ligands קולטן...

<table><tbody><tr><td>GM-CSF רקומביננטי מעכבר</td><td>ריאגנט</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

תאים דנדריטים מיאלואידית (DCS) משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מנגנוני החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות לבין תגובה מוקדמת לזיהום. כי אלה האנטיגן החזק ביותר בהצגת תאים, DCs נמצאים בשימוש יותר ויותר וקטור חיסון ללמוד את האינדוקציה של אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הליך קצירת tibias ואת עצמות הירך של העכבר תורם, עיבוד מח עצם הבחנה DCs במבחנה. המאפיינים של שינוי בעקבות גירוי DCs: תאים דנדריטים בשלים הם phagocytes חזק, ואילו DCs בוגרים המסוגלים מצגת אנטיגן ואינטראקציה עם CD4 + ו - CD8 + T תאים. שינוי זה בפעילות תפקודית מתכתב עם upregulation של סמנים משטח התא ייצור ציטוקינים. סוכנים רבים שניתן להשתמש בהם כדי DCs בוגרים, כולל ציטוקינים חיוג כמו ligands הקולטן. בסרטון הזה אנחנו מדגימים השוואות תזרים cytometric הביטוי של שני שיתוף גירוי מולקולות, CD86 ו - CD40, ואת ציטוקינים, IL-12, בעקבות גירוי לילה עם טיפול CPG או מדומה. לאחר התמיינות, DCs ניתן להשפיע יותר כמו וקטור חיסון לשימוש או לייצר אנטיגן ספציפי על ידי המערכת החיסונית במבחנה פועם באמצעות פפטידים או חלבונים, או transduced באמצעות וקטורים ויראליים רקומביננטי.

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

תאי דנדריטיים מיאלואידיים (DCs) משמשים לעיתים קרובות למחקרי האינטראקציות בין מנגנוני מערכת החיסון המולדת והנרכשת והתגובה המוקדמת ל...

שמי ג'נאט בודרו (Jeanette Boudreaux), והיום ארצה להדריך אתכם בשלבים לתרבית של תאי דנדריטיים מיאלואידיים המשקפים תאי דנדריטיים מתוך תאי קדם של מוח עצם. השושראת התאים הדנדריטיים המיאלואידיים זוכה להערכה גוברת במחקרים של השפע ההדדי בין מערכת החיסון המולדת למערכת החיסון הנרכשת, וכן נעשה בה שימוש גובר כפלטפורמה לפיתוח חיסונים. היום נדריך אתכם בשלבים לבידוד תאי הקדם, הכנסתם לתרבית והבחנתם לתאים דנדריטיים.לאחר מכן, אראה לכם ניתוח של התאים באמצעות ציטומטריה זרימה לפני ואחרי הבשלה. עם הליגנד של קולטן דמוי-טול (toll-like receptor ligand), התאים מתרבים in vitro במהלך תקופת התרבית, לכן צפו לראות עלייה של פי חמישה עד שמונה במספר התאים הכולל בהשוואה לתאי הקדמיים שהעברתם ביום אפס. הפרוצדורות שאראה לכם היום יודגמו על שולחן מעבדה פתוח, אך כדי לשמור על סטריליות, אני ממליץ לבצע את התרביות שלכם בתוך מCבטות בטיחות ביולוגית או במCבט זרימה למינרית.כתחילה, תזדקקו למזרק של 10 mil עם מחט בכילוי 25 מלא ב-PBS, זוג פינצטות קמורות, זוג פינצטות ישרות, מספריים חדות וזוג מספריים קהות שניתן להשתמש בהן לחיתוך עצם. לאחר הפוטןזיה של עכבר התורם, הכינו את הרגליים לחתך על ידי ריסוס שלהן ב-70% ethanol; אחזו בחוזקה בקרסול העכבר באמצעות פינצטות קהות והשתמשו במספריים חדות כדי להסיר בזהירות את העור ורקמת השריר מהרגליים. התחיל

culture-of-myeloid-dendritic-cells-from-bone-marrow-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

סרטון זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאים דנדריטיים - תאים מציגי אנטיגן מרכזיים המפעילים תאי T - ממח העצם של עכבר בוגר.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם: שיטה ליצירת תאים דנדריטיים ממח עצם עכבר

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

ניתן להתמיין באופן סלקטיבי לתאים דנדריטיים טולרוגניים או בוגרים כדי לווסת את האיזון בין חסינות לסבילות. עבודה זו מציגה אמצעי ליצירת תאים דנדריטיים לא בשלים שמקורם במונוציטים (moDCs), moDCs טולרוגניים ובוגרים במבחנה הנבדלים זה מזה בפנוטיפים מטבוליים.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

כאן, אנו מדגימים כיצד מונוציטים מבודדים על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי לאחר צנטריפוגה בשיפוע צפיפות של דם אנושי נוגד קרישה. לאחר הדגירה במשך 5 ימים, מונוציטים אנושיים מתמיינים לתאים דנדריטיים לא בשלים ומוכנים להליכים ניסיוניים בסביבה לא קלינית.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

למדו את שיטת ההתרבות וההבדלה של תאים דנדריטים מיאלואידית מתאי מבשר ממח עצם עכברים. השיטה כוללת בידוד תאים מעצם השוקה והירך, ניתוח זרימה ומורפולוגיה.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

גלה סרטונים נוספים