שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית
2 ביולי 2008
וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.
היום אראה לכם כיצד להכין פרוסות רשתית של סלמנדרת הנמר להקלטות patch clamp. ראשית, אכין שני סוגים של תבניות מיקרוסקופ. אנו משתמשים בתבניות עם באר דביקה מחוברת, כך שנוכל להשתמש בהן כתאי נוזלים.
בסלייד הראשון, אני מניח שני פסי ואקום גריס מקבילים. לאחר מכן אני לוקח נייר סינון וגוזר אותו לחתיכות מלבניות באמצעות סרגל. כעת אני מניח את אחת החתיכות על פסי הגריס ולוחץ אותה כלפי מטה כדי שתהיה מודבקת היטב לסלייד.
אני עושה את אותו הדבר עבור החלק השני. לסוג השני של השקופיות מודבקים גומיים קטנים. כעת, אני פשוט מוסיף מעט גריז ואקום בין הגומיים, ובנוסף אני שם להב תער חד במכשיר לחיתוך הרקמה.
לבסוף, אני מכין את הכלים שיהיו דרושים לי במהלך הניתוח, שהם שני זוגות פינצטות, זוג מספריים וכלי להוצאת העין מהראש לצורך הקלטת זרמים בעקיבתו של אור. יש לבצע את הניתוח תחת תאורת IR, אך לצורכי הדגמה, אעבוד כעת באור. ראשית אני מוציא את העין ומניח אותה תחת המיקרוסקופ על פיסת נייר סופג, שהרטבתי בתמיסת ringer קרה מאוד.
לאחר מכן אני מסיר רקמת חיבור עודפת מגלגל העין כדי להבטיח שהיא לא תגרום נזק לעין. אני תמיד חותך לאורך פני השטח. זה מה שרואים דרך המיקרוסקופ.
בשלב הבא, אני משתמשת בלהב תער כדי ליצור חריץ קטן בקרנית. לשם כך, אני מחזיקה את העין כלפי מטה באמצעות הפינצטה תוך כדי לחיצה על קצה להב התער על הקרנית. לאחר מכן, אני מחזיקה את הקרנית בעזרת הפינצטה ומסירה אותה באמצעות המספריים כדי להוציא את העדשה.
אני מפעיל לחץ קל על דפנות גביע העין כדי שאוכל לגשת בקלות לעדשה באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, אני מסיר את הקשתית. אני אוחז בקשתית בעזרת הפינצטה תוך כדי חיתוך לאורך ה-aura serato עד שנותר רק גביע העין.
לאחר מכן חתכתי את ה-I cup לשתי חתיכות מלבניות. ראשית חתכתי אותו לחצי ולאחר מכן קיצצתי את הקצוות העליונים והתחתונים. כעת לקחתי אחת מהזכוכיות שהכנתי קודם לכן, הרמתי חתיכה של I cup והנחתי אותה כשהצד של הרשתיה (retina) פונה כלפי מטה על נייר הסינון.
לאחר מכן, אני מושכת את הלובן (sclera) כך שרק הרשתית תישאר על הפיתה. לאחר מכן, אני מוסיפה במהירות את התמיסה שלנו לתא. נחזור על הפרוצדורה עבור נתח הרשתית השני.
אך הפעם ניתן לצפות דרך המיקרוסקופ בזמן הנחת הרשתית על נייר הסינון. אני משתמש בפינצטה בידי השמאלית כדי ללחוץ בעדינות על הלובנה (sclera). לבסוף, אני חותך את הרשתית לפרוסות ברוחב 200 עד 300 micrometer.
בשלב הבא, אני בוחר פרוסה לשימוש בניסויים שלי. כדי לבחור פרוסה מתאימה, עליי לסובב את הפרוסות ב-90 מעלות כך שאוכל לראות את שכבות הרשתית. אני בוחר פרוסה שנראית ללא נזק ומציגה פסים אופקיים ברורים המעידים על השכבות השונות.
כדי להעביר את הפרוסות משטח אחד למשנהו, אני יוצר גשר של תמיסת Ringer ולאחר מכן מעביר בזהירות את הפרוסות דרך התמיסה. כאשר אני מניח את הפרוסה, אני דוחף אותה כנגד גושי הגומי כך שנייר הסינון מופנה בצורה אנכית לזכוכית. כעת אני מוכן להקלטת patch clamp.
אנו מאחסנים את התמיסה התוך-תאית במנות קטנות במקפיא, כך שנפשיר רק את הכמות הדרושה לנו ליום אחד. לפני מילוי האלקטרודות, אנו מסננים את התמיסה כדי להסיר חלקיקים קטנים שעלולים לסתום את קצה האלקטרודה. אלקטרודות ה-patch נמשכות מzכלי זכוכית קפילריים מסוג borosilicate לצורך הקלטה מתאי גנגליון.
אני בוחר הגדרה שתניב התנגדויות אלקטרודה שבין 2 ל-4 mega ohms. בעת מילוי האלקטרודות, אני רוצה לוודא שאין בועות אוויר בקצה האלקטרודה. נקישה קלה על הזכוכית בעזרת האצבע מסייעת בהסרת בועות.
זהו מחזיק האלקטרודות המחובר לשלב הראש (head stage). הגליל החשמלי מכיל תיל של כסוף כלוריד. זוהי אלקטרודת ההארקה עם גשר niga.
הנה פיפטת הפרפוזיה. היא מחוברת למערכת מיקרו-פרפוזיה בעלת שמונה ערוצים. הפרפוזיה הראשית מונעת על ידי כבידה, כך שמדובר בבקבוק מלא בתמיסות, והתמיס זורם דרך צינור זה אל תוך תא ההקלטה.
כדי לאפשר הקלטה בחושך, חיברתי מצלמת IR לפתח הצד של המיקרוסקופ, המחוברת למסך טלוויזיה. לפתח העליון חיברתי מקרן תמונה, המאפשר לי להקרין גירויים ויזואליים על הרשתית. ולבסוף, מגבר patch clamp.
כעת אני מניח את פרוסת הרשתית תחת המיקרוסקופ ומוסיף את אלקטרודת ההארקה לאמבט כדי להקים את מערכת הפרפוזיה הראשית. לאחר מכן, מוסיפים את הצינור ממערכת הפרפוזיה בכוח הכבידה. צינור הזכוכית בצד השני מחובר לשאיבת ואקום, השומרת על מפלס נוזלים קבוע.
אני מוודא גם שצינור שאיבה מחובר למשענת החשמלית (The electro shoulder). לאחר מכן, אני ממקם את פיפטת המיקרו-פרפוזיה. אני מוריד אותה לתוך האמבט, ולאחריה את עדשת המיקרוסקופ.
כאשר אני מתקרב לפרוסה, אני מושך את המערכת מעט אחורה כדי שהתמיסה תפגע בפרוסה. כשאני מפעיל את הפרפוזיה, אני אמור לראות את הפרוסה זזה מעט, כמו כאן. כעת נחפש תא מתאים להקלטה.
אנו מחפשים תאי גנגליון, הנמצאים בחלקו התחתון של הפרוסה. כעת אני מכין את האלקטרודה; לפני הכנסת האלקטרודה לאמבט, אני מוסיף מעט לחץ חיובי. ברגע שמצאתי את האלקטרודה תחת המיקרוסקופ, אני מוריד אותה אל מתחתיה, ממש מעל הפרוסה, כדי לבצע patch לתא.
עברתי לעדשה עם הגדלה של 40x. כעת אני מאפס את זרם הבסיס ובודק את התנגדות האלקטרודה. בדיקת האיטום (seal test) מורכבת מרצף של 10 פולסים של 10 millivolt, שעוזרים לי לראות אם נוצר איטום הדוק בין האלקטרודה לתא.
כעת אני מוריד את האלקטרודה אל תא המטרה. ברגע שאני מבחין בשקע על גוף התא, אני משחרר את הלחץ החיובי מהצינור, פעולה היוצרת אטימה הדוקה. ההתנגדות כעת גבוהה כל כך, עד שקו הזרם נראה שטוח.
הקוצים הקטנים הם ארטיפקטים של קיבוליות מהאלקטרודה. ניתן לפצות עליהם באופן זה, וכעת הם נעלמו. כעת אנסה לבצע פריצה לתא.
כדי לעשות זאת, אני מפעיל בזהירות פולסי שאיבה קטנים בצינור המחובר לכתף האלקטרודה, ואם הכל עובד כשורה, ניתן לראות את עקומת הזרם משתנה כך. הקפיצות שניתן לראות כעת נובעות מקבלי הממברנה וניתן לפצות עליהן; כעת מדובר בדגימה שהוכנה בחושך. בואו נראה אם נוכל להקליט תגובות המעוררות על ידי אור.
העקבה שניתן לראות באוסצילוסקופ היא תגובת הזרם של תא גנגליוני שמתחו נקבע (voltage clamped) על 60- מיליבולט. גירויי האור שבהם אנו משתמשים הם פסים בהירים וכהים המוצגים על רקע אחיד ויציב. התוכנה שבשימוש במעבדתנו מציגה את הרישום המלא של ניסוי אחד.
ניתן לראות כי זהו תא "כיבוי" (off cell) כתגובה לתחילת פס כהה וסיום פס בהיר. הקו הלבן בחלק העליון מציין את משך הגירוי. כעת נוכל להריץ ניסויים שבהם נבצע פרפוזיה של חומרים פרמקולוגיים שונים.
לדוגמה, ניתן לחסום עיכוב GABAergic ו-Gly synergic. לאחר המתנה של פחות מדקה אחת, בדרך כלל ניתן להתחיל לראות כאן את השפעות התרופה. התגובה הפכה לחזקה וממושכת יותר.
הכנת פרוסות רשתית שימשה באופן נרחב להקלטת זרמים סינפטיים מתאים שונים ברשתית, ואם מוסיפים צבע פלואורסצנטי לתמיסת האלקטרודה, ניתן לאשש בקלות את סוג התא. מבחינה אנטומית, במקרה זה אנו משתמשים בזחלי סלמנדרה TGA כמודל חיה. העובדה שסלמנדרות הן בעלי חיים בעלי דם קר ובעלות תאי רשתית גדולים מספקת תנאי הקלטה יתרוניים, אך ניתן להחיל את אותה טכניקה גם על דגימות של יונקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את תהליך רישומי קיבעון מתח של תא שלם (whole-cell voltage clamp) בתוך פרוסה של רשתית של סלמנדרת נמר מימית. הוא כולל את הכנת הפרוסה ואת ביצוע רישומי patch clamp במהלך גירוי חזותי של הרשתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- עיבוד חזותי
רקע
- סלמנדרת הנמר היא אורגניזם מודל לחקר פיזיולוגיה של הרשתית.
- קיבוע מתח של התא השלם (Whole-cell voltage clamp) היא טכניקה המשמשת למדידת זרמים יוניים בנוירונים.
- הבנת התגובות של הרשתית חיונית להסקת מסקנות לגבי עיבוד חזותי.
- הקלטות Patch clamp מאפשרות שליטה מדויקת בפוטנציאל הממברנה.
מטרת המחקר
- להדגמת הכנת פרוסות רשתית להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- להדגמת יישום טכניקות patch clamp בהכנה חיה של רשתית.
- לבחינת התגובה של הרשתית לגירויים חזותיים.
שיטות שהושתמשו
- הכנת פרוסות רשתית מסלמנדרת נמר.
- שימוש בשקופיות מיקרוסקופ עם בארי דבקים כתאי נוזלים.
- יישום גריז ואקום להצמדת נייר סינון לצורך הצבת הפרוסות.
- ביצוע הקלטות patch clamp במהלך גרייה חזותית.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של פרוסות רשתית המתאימות לניתוח אלקטרופיזיולוגי.
- הדגמה של טכניקות patch clamp יעילות בבקרה חיה.
- תצפית על תגובות רשתית במהלך גירוי חזותי.
- תובנות לגבי הזרמים היוניים המעורבים בעיבוד חזותי.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לחקר פיזיולוגיה של הרשתית.
- הקלטות בשיטת Patch clamp יכולות לחשוף פרטים חשובים על תפקוד הרשתית.
- ניתן ליישם טכניקה זו במגוון מחקרים במדעי המוח החזותיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטות patch clamp של תא שלם בתוך פרוסות רשתית מאפשרות מדידה מדויקת של זרמים סינפטיים המושרים על ידי אור, ומספקות תובנות מכניסטיות לגבי העברה של אותות חזותיים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) בגילוי תרופות למדעי העצבים על ידי קישור מודולציה פרמקולוגית לפלטים אלקטרופיזיולוגיים תפקודיים. הכנת פרוסות הרשתית מציעה מערכת רלוונטית למחלה עבור הפחתת סיכונים (de-risking) של מטרות המעורבות במסלולי עיבוד ברשתית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידה של זרמים סינפטיים מעוררים המופעלים על ידי אור בתאי קשרית של הרשתית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על פעילות תעלות יונים העומדת בבסיס העיבוד החזותי.
- ערך חיזוי: מסייע בהערכת השפעת תרכובות על מעגלי הרשתית, ובכך תורם לביסוס הביטחון במטרה ולסינון תיקי פיתוח עבור אינדיקציות של מדעי העצב החזותיים.
סינון ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכת תרכובות בהמשך, באמצעות הכנת פרוסות ופרפוזיה סטנדרטיות.
- פלטים כמותיים: יצירת תגובות זרם בזמן אמת הניתנות לשחזור, המאפשרות ניתוח קינטיקה ותגובה למינון של תרכובות בדיקה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מערכת הפרפוזיה בעלת 8 הערוצים מאפשרת החלפה פרמקולוגית מהירה, התומכת בסריקה רחבה של מודולטורים המכוונים למסלולים רשתיתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: משתמש בחתכי רשתית של סלמנדרת נמר כמודל להבנת מנגנוני עיבוד חזותי שמורים הניתנים להחלה על מערכות של יונקים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי אספקת מדדים אלקטרופיזיולוגיים המתואמים עם תגובות חזותיות תפקודיות.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של יעדים באמצעות אישור השפעות על המטרה (on-target) דרך שינויים באמפליטודה ובקינטיקה של זרם המושרה על ידי אור.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור ויסות של תמסורת סינפטית רשתית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי בידוד התרומה של מערכות מוליכים עצביים ספציפיות (למשל, GABAergic, glycinergic) לזרמים המעוררים על ידי אור.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות הכנת פרוסות יציבות והקלטות בסיס עקביות תחת voltage clamp.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של אמפליטודת הזרם, קינטיקה ורגישות פרמקולוגית לצורך השוואה אובייקטיבית של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי שימוש בהכנה המשקפת מאפיינים מרכזיים של מעגלי הרשתית ביונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית רב-פעמית למחקר מתמשך של מטרות במדעי העצבים של הראייה לאורך מספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי העברה של אותות ברשתית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות קיבוע מבוקר של פרוסות, פירפוז והגשת גירויים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור מעורבות המטרה לתוצאות אלקטרופיזיולוגיות פונקציונליות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם לסיכון, בהתבסס על השפעותיהן על שלמות סינפטית ברשתית ועל נאמנות האות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, דיסקציה של הרשתית וטכניקת patch clamp.
- תלוי במיכשור ייעודי הכולל מגבר patch clamp, מערכת פרפוזיה ומיקרוסקופיה מותאמת ל-IR.
- מחייב סטנדרטיזציה של עובי הפרוסות, חמצון ובקרת טמפרטורה לאורך הניסויים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר מהכנות של רשתית דו-מינית להכנות של רשתית יונקים.
- מוגבל על ידי משך חיוניות הרקמה והצורך במפעילים מיומנים לשמירה על איכות ההקלטה.
שאלות נפוצות על ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:10
Preparations for the Dissection
2:40
Dissection of the Eye
9:42
Moving Slices to the Recording Chamber
12:08
Preparation of patch Electrodes
13:21
The Recording Rig
14:09
Whole-cell Recording
17:40
Recording Light-evoked Currents
18:55
Discussion/ Conclusion
