Name: שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: למד הכנת פרוסות רשתית מסלמנדרת נמר לרישום פאץ' קלאמפ. שיטה זו מאפשרת מדידת זרמים סינפטיים בתגובה לגירויים חזותיים וחקר פיזיולוגיה רטינלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פתרונות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון תאיים בתאי הגנגליון (מ&quot;מ): 100-K-gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 מיקרומטר Sulforhodamine B (עבור כתמים), מותאם pH = 7.4 עם KOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון תאיים עבור תאים דו קוטבית (מ&quot;מ): 90 K-gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 מיקרומטר Sulforhodamine B (עבור כתמים), מותאם pH = 7.4 עם KOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רינגר תאיים של פתרון (מ&quot;מ): 112 NaCl, גלוקוז 5, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, מותאם pH = 7.75 עם NaOH. חמצון של הפתרון אינו הכרחי. </li></ul> הכן חדרי הקלטה חדר הקלטה שלנו מורכבת של המיקרוסקופ שקופית עם דבק גם בו בלוקים סיליקון קטן לגזור דבק אחר גם ממוקמים לספק יציבות עבור פרוסות הרקמה. הכנת פרוסות רשתית כדי למנוע הלבנת של קולטני האור, החיתוך מתבצע באור אינפרא אדום או אור אדום עמום. אם מישהו מעוניין הקלטה ותגובות מסלול מוט, רק אור IR יש להשתמש (IR לנתח מיקרוסקופ ואין אור בחדר. נוספות משקפי IR יש להשתמש הליכים לא נעשה תחת המיקרוסקופ). אם מישהו מתעניין בעיקר הקלטה אור חרוט התגובות, חדר אפלולי אור אדום או אור אדום פלאש יכול לשמש. מיקרוסקופ עם זאת, עדיין צריך להיות oculars IR. אם קלט photoreceptor אינה רלוונטית לצורך הניסוי, ההליכים יכולים להתבצע באור חדר רגיל באמצעות מיקרוסקופ רגיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופ עם סיליקון דבק טוב: ליצור שתי רצועות מקבילות של גריז סיליקון (כ 0.5 ס&quot;מ זה מזה) בכל שקופית ומקום חתיכה מלבנית של נייר סינון בצד אחד של השקופית, המעבר הן להקות שומן (לדחוף את המסנן נייר חלק סכין גילוח, כך הוא מחובר היטב לשקופית) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן סלמנדרה על פי פרוטוקולים הקמה: החיה ממוקם באמבט קרח במשך 30 דקות, הכרות אז פעמיים דקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עין מהראש סלמנדרה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ לנתח על פיסת נייר טבולה פתרון קר כקרח רינגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת חיבור מהעין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח לעשות חתך קטן בקרנית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק חתך בקרנית עם מלקחיים תוך הסרת אותו במספריים לאורך מצורף שלה לעין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את העדשה עם מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את אירוס עם מלקחיים חתך לאורך serrata אורה להסיר את הקשתית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עיינית לשני חלקים מלבניים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את אחד החלקים ולמקם אותו בצד sclera על נייר המסנן (לוודא לשטח את היצירה בעודה דוחפת אותו בזהירות רבה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את sclera את הרשתית, אשר כעת אמור להיות מצורף הנייר filer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות פתרון קר כקרח רינגר אל הבאר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור זהה עבור פיסת השני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח להציב מבצעה בהתאמה אישית לקצץ 200-300μm פרוסות רחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להרים את פרוסות בצד של נייר הסינון, להפוך אותם על כך את השכבות של הרשתית להיות גלוי, ומניחים אותם על להקות גריז ואקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו פרוסה שנראית ניזוק ומראה להקות אופקי המציין את השכבות של הרשתית (השכבות הם לפעמים קשה לראות מתחת למיקרוסקופ לנתיחה כמו ההגדלה אינו גבוה מספיק, אולם אם אפשר לזהות כמה שכבות פרוסה הוא בדרך כלל מספיק טוב. ההחלטה הסופית בשאלה אם להשתמש פרוסה עם זאת, הוא עשה פעם אחת הוא מוצג תחת מיקרוסקופ זקוף). הזז אותו כדי להחליק את תא הקלטת על ידי בניית גשר Ringer בין שתי שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהנייר לסנן נדחף כנגד קוביות גומי בחדר הקלטה כך פרוסה אינו מוטה (תאים הגנגליון ו photoreceptors צריך להיות בפוקוס באותו זמן) </li></ol> הצבת את הרקמה במתקן ההקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית ההקלטה ממוקם מתחת למיקרוסקופ ואת perfused עם פתרונות של רינגר דרך syste זלוף הכבידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההכנה היא דמיינו עם מיקרוסקופ זקוף עם מטרה 10x ו 40X טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, אנו רק להשתמש באור אינפרא אדום כדי למנוע הלבנת של photoreceptors. מצלמת IR מחובר ליציאה הצדדית של המיקרוסקופ, אשר מחובר למסך טלוויזיה. </li></ol> גירוי חזותי גירויים חזותיים מתוכנתים ב-Matlab באמצעות Psychtoolbox הם מוקרנת על רשתית העין באמצעות יציאת העליון של המיקרוסקופ באמצעות תמונה מיקרוסקופית ההזרקה (Mbf במדעי החיים). Bits + + מעבד וידאו דיגיטלי (Cambridge Research Systems) משמש כדי לקבל קנה מידה בהיקות 14bit ו synchronize מצגת גירוי עם רכישת נתונים. גירויים חזותיים המשמשים זה וידאו ברים בהירות או כהות (רוחב = 460μm) של 100% לעומת זאת, שהוצגו במשך שתי שניות על רקע אחיד קבוע (בהיקות = 8 * 10 4 פוטונים / מיקרומטר / s, גודל: 1.84 x 1.38mm). Electrophysiology <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות תיקון המגיעים בורוסיליקט זכוכית (OD:.. מזהה 1.5mm, 84mm) עם חולץ micropipette. עבור תאים הגנגליון, התנגדויות הם בין 2 ל 4 MOhms. עבור תאים דו קוטבית, התנגדות גבוהה יותר בין 4 ל 8 MOhms משמשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטות קלאמפ מתח מבוצעות באמצעות 700A Multiclamp (התקנים מולקולריים), מגבר ותוכנה מעבדה פנימי מתוכנת LabVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמים הם perfused דרך מערכת ערוץ 8-זלוף. אלקטרודה microperfusion ממוקם קרוב הפרוסה (רקמת צריך לעבור לעין כאשר אתה מסובב את זלוף לסירוגין, אבל צריך להיות זהירים כי הלחץ אינו חזק מדי, כך פרוסה יכולה להיות מנותקת נייר הסינון). במהלך הניסויים microperfusion צריך להיות מופעל כל הזמן (פתרון בקרת המרוססת אם אין סמים יש צורך), כך ההקלטה אינה מקבלת מופרע על ידי החלפת זלוף לסירוגין. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

יתרונות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל סוגי תאים נגישים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי קל של סוגי תאים, בפרט אם פלורסנט לצבוע מתווסף פתרון האלקטרודה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוכני תרופתי יכול בקלות להגיע תאים היעד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטכניקה מהדק התיקון מאפשר לחקור את התפקיד של תעלות יונים שונים חישובים הרשתית. מידע אותו לא ניתן להשיג באמצע...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>מגבר Patch Clamp</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>מיקרוסקופ להבדילה</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>מצויד בעדשות 40x, 10x טבילה במים, מסננים פלואורסצנטיים ומנורת כספית</td></tr><tr><td>P-97</td><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>מזריק תמונות מיקרוסקופיות</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת פופוזין בעלת 8 ערוצים</td><td>מיקרו-פופוזין</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>מעבד וידאו דיגיטלי</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עיניות אינפרא-אדום</td><td>אחר</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בארות סיליקון דביקות</td><td>אחר</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>קוטר 20mm, עומק 1.0mm</td></tr><tr><td>מסנני ממברנה</td><td>מסנן</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית בורוסיליקט</td><td>זכוכית לאלקטרודות</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק</td><td>מסנן</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>מסננים 4mm, ממברנת נילון .2um, בית פוליפרופילן</td></tr><tr><td>מצלמת IR</td><td>מצלמה מורכבת על מיקרוסקופ</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, מצלמת וידאו B7W</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole-4-acetic acid sodium salt</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>זחלי סלמנדרת נמר</td><td>בעל חיים</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים synaptic מעוררים פורסים את רשתית

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

אנו משתמשים כל תא מהדק טכניקה טלאי ללמוד את המעגלים הסינפטי שבבסיס עיבוד המידע החזותי ברשתית. בסרטון הזה, אנו נדריך אותך בתהליך של ביצוע כל תא הקלטות של זרמים מעוררים אור של תאים בודדים בהכנת פרוסה הרשתית. אנו משתמשים נמר מימיים כמו סלמנדרה במודל חיה. נתחיל בתיאור דיסקציה של העין ולהראות כמה פרוסות מורכבים עבור הקלטות אלקטרו. לאחר פרוסה ממוקמת בחדר ההקלטה, אנו מדגימים כיצד לבצע כל תא מהדק הקלטות מתח. לאחר מכן, אנו הפרויקט גירויים חזותיים על photoreceptors של הפרוסה לעורר אור עורר תגובות הנוכחי. במהלך ההקלטה אנו perfuse את הפרוסה עם סוכני תרופתי, לפיה מערכת ערוץ 8-זלוף מאפשר לנו לעבור במהירות בין סוכנים שונים. הכנה פרוסה רשתית נעשה שימוש נרחב הרשתית עבור הקלטות מהדק תיקון, בפרט ללמוד amacrine או תאים דו קוטבית, אשר אינם נגישים בהכנת כל הר.

וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

אנו משתמשים בטכניקת ה-patch clamp של התא השלם (whole-cell patch clamp) כדי לחקור את המעגלים הסינפטיים העומדים בבסיס עיבוד המידע החזותי ברשתית. בסרטון זה, אנו...

היום אראה לכם כיצד להכין פרוסות רשתית של סלמנדרת הנמר להקלטות patch clamp. ראשית, אכין שני סוגים של תבניות מיקרוסקופ. אנו משתמשים בתבניות עם באר דביקה מחוברת, כך שנוכל להשתמש בהן כתאי נוזלים.בסלייד הראשון, אני מניח שני פסי ואקום גריס מקבילים. לאחר מכן אני לוקח נייר סינון וגוזר אותו לחתיכות מלבניות באמצעות סרגל. כעת אני מניח את אחת החתיכות על פסי הגריס ולוחץ אותה כלפי מטה כדי שתהיה מודבקת היטב לסלייד.אני עושה את אותו הדבר עבור החלק השני. לסוג השני של השקופיות מודבקים גומיים קטנים. כעת, אני פשוט מוסיף מעט גריז ואקום בין הגומיים, ובנוסף אני שם להב תער חד במכשיר לחיתוך הרקמה.לבסוף, אני מכין את הכלים שיהיו דרושים לי במהלך הניתוח, שהם שני זוגות פינצטות, זוג מספריים וכלי להוצאת העין מהראש לצורך הקלטת זרמים בעקיבתו של אור. יש לבצע את הניתוח תחת תאורת IR, אך לצורכי הדגמה, אעבוד כעת באור. ראשית אני מוציא את העין ומניח אותה תחת המיקרוסקופ על פיסת נייר סופג, שהרטבתי בתמיסת ringer קרה מאוד.לאחר מכן אני מסיר רקמת חיבור עודפת מגלגל העין כדי להבטיח שהיא לא תגרום נזק לעין. אני תמיד חותך לאורך פני השטח. זה מה שרואים דרך המיקרוסקופ.בשלב הבא, אני משתמשת בלהב תער כדי ליצור חריץ קטן בקרנית. לשם כך, אני מחזיקה את העין כלפי מטה באמצעות הפינצטה תוך כדי לחיצה על קצה להב התער על הקרנית. לאחר מכן, אני מחזיקה את הקרנית בעזרת הפינצטה ומסירה אותה באמצעות המספריים כדי להוציא את העדשה.אני מפעיל לחץ קל על דפנות גביע העין כדי שאוכל לגשת בקלות לעדשה באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, אני מסיר את הקשתית. אני אוחז בקשתית בעזרת הפינצטה תוך כדי חיתוך לאורך ה-aura serato עד שנותר רק גביע העין.לאחר מכן חתכתי את ה-I cup לשתי חתיכות מלבניות. ראשית חתכתי אותו לחצי ולאחר מכן קיצצתי את הקצוות העליונים והתחתונים. כעת לקחתי אחת מהזכוכיות שהכנתי קודם לכן, הרמתי חתיכה של I cup והנחתי אותה כשהצד של הרשתיה (retina) פונה כלפי מטה על נייר הסינון.לאחר מכן, אני מושכת את הלובן (sclera) כך שרק הרשתית תישאר על הפיתה. לאחר מכן, אני מוסיפה במהירות את התמיסה שלנו לתא. נחזור על הפרוצדורה עבור נתח הרשתית השני.אך הפעם ניתן לצפות דרך המיקרוסקופ בזמן הנחת הרשתית על נייר הסינון. אני משתמש בפינצטה בידי השמאלית כדי ללחוץ בעדינות על הלובנה (sclera). לבסוף, אני חותך את הרשתית לפרוסות ברוחב 200 עד 300 micrometer.בשלב הבא, אני בוחר פרוסה לשימוש בניסויים שלי. כדי לבחור פרוסה מתאימה, עליי לסובב את הפרוסות ב-90 מעלות כך שאוכל לראות את שכבות הרשתית. אני בוחר פרוסה שנראית ללא נזק ומציגה פסים אופקיים ברורים המעידים על השכבות השונות.כדי להעביר את הפרוסות משטח אחד למשנהו, אני יוצר גשר של תמיסת Ringer ולאחר מכן מעביר בזהירות את הפרוסות דרך התמיסה. כאשר אני מניח את הפרוסה, אני דוחף אותה כנגד גושי הגומי כך שנייר הסינון מופנה בצורה אנכית לזכוכית. כעת אני מוכן להקלטת patch clamp.אנו מאחסנים את התמיסה התוך-תאית במנות קטנות במקפיא, כך שנפשיר רק את הכמות הדרושה לנו ליום אחד. לפני מילוי האלקטרודות, אנו מסננים את התמיסה כדי להסיר חלקיקים קטנים שעלולים לסתום את קצה האלקטרודה. אלקטרודות ה-patch נמשכות מzכלי זכוכית קפילריים מסוג borosilicate לצורך הקלטה מתאי גנגליון.אני בוחר הגדרה שתניב התנגדויות אלקטרודה שבין 2 ל-4 mega ohms. בעת מילוי האלקטרודות, אני רוצה לוודא שאין בועות אוויר בקצה האלקטרודה. נקישה קלה על הזכוכית בעזרת האצבע מסייעת בהסרת בועות.זהו מחזיק האלקטרודות המחובר לשלב הראש (head stage). הגליל החשמלי מכיל תיל של כסוף כלוריד. זוהי אלקטרודת ההארקה עם גשר niga.הנה פיפטת הפרפוזיה. היא מחוברת למערכת מיקרו-פרפוזיה בעלת שמונה ערוצים. הפרפוזיה הראשית מונעת על ידי כבידה, כך שמדובר בבקבוק מלא בתמיסות, והתמיס זורם דרך צינור זה אל תוך תא ההקלטה.כדי לאפשר הקלטה בחושך, חיברתי מצלמת IR לפתח הצד של המיקרוסקופ, המחוברת למסך טלוויזיה. לפתח העליון חיברתי מקרן תמונה, המאפשר לי להקרין גירויים ויזואליים על הרשתית. ולבסוף, מגבר patch clamp.כעת אני מניח את פרוסת הרשתית תחת המיקרוסקופ ומוסיף את אלקטרודת ההארקה לאמבט כדי להקים את מערכת הפרפוזיה הראשית. לאחר מכן, מוסיפים את הצינור ממערכת הפרפוזיה בכוח הכבידה. צינור הזכוכית בצד השני מחובר לשאיבת ואקום, השומרת על מפלס נוזלים קבוע.אני מוודא גם שצינור שאיבה מחובר למשענת החשמלית (The electro shoulder). לאחר מכן, אני ממקם את פיפטת המיקרו-פרפוזיה. אני מוריד אותה לתוך האמבט, ולאחריה את עדשת המיקרוסקופ.כאשר אני מתקרב לפרוסה, אני מושך את המערכת מעט אחורה כדי שהתמיסה תפגע בפרוסה. כשאני מפעיל את הפרפוזיה, אני אמור לראות את הפרוסה זזה מעט, כמו כאן. כעת נחפש תא מתאים להקלטה.אנו מחפשים תאי גנגליון, הנמצאים בחלקו התחתון של הפרוסה. כעת אני מכין את האלקטרודה; לפני הכנסת האלקטרודה לאמבט, אני מוסיף מעט לחץ חיובי. ברגע שמצאתי את האלקטרודה תחת המיקרוסקופ, אני מוריד אותה אל מתחתיה, ממש מעל הפרוסה, כדי לבצע patch לתא.עברתי לעדשה עם הגדלה של 40x. כעת אני מאפס את זרם הבסיס ובודק את התנגדות האלקטרודה. בדיקת האיטום (seal test) מורכבת מרצף של 10 פולסים של 10 millivolt, שעוזרים לי לראות אם נוצר איטום הדוק בין האלקטרודה לתא.כעת אני מוריד את האלקטרודה אל תא המטרה. ברגע שאני מבחין בשקע על גוף התא, אני משחרר את הלחץ החיובי מהצינור, פעולה היוצרת אטימה הדוקה. ההתנגדות כעת גבוהה כל כך, עד שקו הזרם נראה שטוח.הקוצים הקטנים הם ארטיפקטים של קיבוליות מהאלקטרודה. ניתן לפצות עליהם באופן זה, וכעת הם נעלמו. כעת אנסה לבצע פריצה לתא.כדי לעשות זאת, אני מפעיל בזהירות פולסי שאיבה קטנים בצינור המחובר לכתף האלקטרודה, ואם הכל עובד כשורה, ניתן לראות את עקומת הזרם משתנה כך. הקפיצות שניתן לראות כעת נובעות מקבלי הממברנה וניתן לפצות עליהן; כעת מדובר בדגימה שהוכנה בחושך. בואו נראה אם נוכל להקליט תגובות המעוררות על ידי אור.העקבה שניתן לראות באוסצילוסקופ היא תגובת הזרם של תא גנגליוני שמתחו נקבע (voltage clamped) על 60- מיליבולט. גירויי האור שבהם אנו משתמשים הם פסים בהירים וכהים המוצגים על רקע אחיד ויציב. התוכנה שבשימוש במעבדתנו מציגה את הרישום המלא של ניסוי אחד.ניתן לראות כי זהו תא "כיבוי" (off cell) כתגובה לתחילת פס כהה וסיום פס בהיר. הקו הלבן בחלק העליון מציין את משך הגירוי. כעת נוכל להריץ ניסויים שבהם נבצע פרפוזיה של חומרים פרמקולוגיים שונים.לדוגמה, ניתן לחסום עיכוב GABAergic ו-Gly synergic. לאחר המתנה של פחות מדקה אחת, בדרך כלל ניתן להתחיל לראות כאן את השפעות התרופה. התגובה הפכה לחזקה וממושכת יותר.הכנת פרוסות רשתית שימשה באופן נרחב להקלטת זרמים סינפטיים מתאים שונים ברשתית, ואם מוסיפים צבע פלואורסצנטי לתמיסת האלקטרודה, ניתן לאשש בקלות את סוג התא. מבחינה אנטומית, במקרה זה אנו משתמשים בזחלי סלמנדרה TGA כמודל חיה. העובדה שסלמנדרות הן בעלי חיים בעלי דם קר ובעלות תאי רשתית גדולים מספקת תנאי הקלטה יתרוניים, אך ניתן להחיל את אותה טכניקה גם על דגימות של יונקים.

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

הסרטון מתאר את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית של סינפסות רטינוגניקולאט וקורטיקוגניקולאט בפרוסות מוח של עכבר. הפרוסות המכילות את גרעין הגניקולאט הגבי הצידי (dLGN) ממוקמות בתא הקלטה. פיפטה מגרה ממוקמת על מערכת הראייה כדי לעורר תאי גנגליון ברשתית (RGCs) ולחקור סינפסות רטינוגניקולאט, או את גרעין הרשתית תלאמי כדי לעורר נוירונים בקליפת המוח ולחקור סינפסות קורטיקוגניקולטיות. עם הגירוי, ה-RGCs והנוירונים בקליפת המוח משחררים מוליכים עצביים מעוררים, אשר מייצרים זרמים סינפטיים בנוירוני ממסר LGN. זרמים אלה...

מחקר אלקטרופיזיולוגי של סינפסות רטינוגניקולאט וקורטיקוגניקולאט בפרוסות מוח עכבר

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

למד הכנת פרוסות רשתית מסלמנדרת נמר לרישום פאץ' קלאמפ. שיטה זו מאפשרת מדידת זרמים סינפטיים בתגובה לגירויים חזותיים וחקר פיזיולוגיה רטינלית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

גלה סרטונים נוספים