הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים
22 ביולי 2008
ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.
שלום, אני סטפן בוראני מהמעבדה של ד"ר פרנק זאוואה במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת קליפורניה ריברסייד. היום נראה לכם פרוטוקול של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation). אז בואו נתחיל.
הליך זה מתחיל בקשירה צולבת (cross-linking) של תאי גזע עובריים של בן אנוש באמצעות פורמלדהיד. לפני הקשירה הצולבת, מפשירים תאי גזע עובריים של בן אנוש מתוך חנקן נוזלי למשך חמש דקות ב-37 °C, ולאחר מכן שוטפים אותם עם מצע גידול. לאחר מכן, זורעים את התאים בלוחות בעלי שישה בארות מצופים ג'לטין ומאפשרים להם להתרבות במשך יומיים עד שלושה ימים.
עבור כל תגובת שיקוע חיסוני (immunoprecipitation), נצטרך להתחיל עם 50 עד 100 מיליון תאים. תחילה התאים יעברו פריקה ואספוף בתליה. אלדהיד טרי יתווסף לכל תליה של תאים בריכוז של 1% ויודגער למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
בשלב הבא, הוסיפו נפח של 1/10 מ-גליצין בריכוז 1.25 molar כדי לנטרל את הפורמלהיד and דגרו למשך 10 דקות. שטפו את התאים פעמיים עם 10 milliliters של PBS ולאחר מכן העבירו אותם למבחנות קוניות של 50 milliliter. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לאסוף את התאים למשקע.
לאחר הסבוב, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלהו מחדש את המשקע ב-1.5 milliliters של lyce buffer. לבסוף, העבירו את התאים למס管 מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter. לאחר העברת התאים, בצעו הקפאה מהירה (flash freeze) של התאים שלוש פעמים בחנקן נוזלי, ולאחר מכן השתמשו בטחון רקמות כדי לשבור אותם.
לאחר שביצעו קישור צולב לתאים, הם מוכנים לאימונו-שיקוע (immunoprecipitation) או שניתן לאחסנם בהקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס לזמן בלתי מוגבל. לאחר ביצוע הקישור הצולב לתאים, יש להכין את החרוזיים המגנטיים לצורך הפעולה. העבירו 50 µL של חרוזי DI למבחנות מיקרו בעלות שימור נמוך (lower retention) בנפח של 1.5 mL, והכינו מבחנה אחת של חרוזים עבור כל אימונו-שיקוע.
כעת יש להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה (block solution). לאחר מכן, אספו את חרוזי ה-dyal באמצעות dyal MPC. הניחו את המבחנות במגנט.
אפשרו לחרוזים להיצמד לדופן המבחנה. הפעולה צריכה להימשך כ-15 שניות. ניתן להפוך את המעמד פעמיים כדי לסייע באיסוף החרוזים.
לאחר איסוף החרוזים, ניתן להסיר את הנוזל העליון בעזרת פ pipette. לאחר הסרת הנוזל העליון, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת חסימה (block solution) וסבבו בעדינות את החרוזים על ידי הוצאת הפס המגנטי מהמעמד והפיכת המעמד. כאשר המבחנה עדיין במקומה, ניתן לחזור על פעולה זו 10 עד 20 פעמים או עד שהחרוזים יתפזרו באופן אחיד.
אספו את החרוזים לאחר ריספנדציה (resuspension) כפי שעשיתם קודם לכן. לאחר האיסוף, ניתן להסיר את supernatant באמצעות פיפטה. חזרו על שטיפה זו באמצעות 1.5 milliliters של תמיסת חסימה (block solution).
לאחר השטיפה השנייה, ניתן לסספנדור מחדש את החרוזים ב-750 µL של תמיסת חסימה ולאחר מכן להוסיף 10 µg של נוגדן. במחקר שלנו, אנו משתמשים בנוגדן נגד החלבון MLL ומדגירים את התערובת בטמפרטורה של 4 °C למשך שש שעות לפחות או לאורך הלילה על שייקר. במהלך דגירה זו, ניתן לבצע סוניקציה לכרומטין המקושר, אותה נדגים מיד לאחר הדגירה הלילית.
הסר את תמיסת הנוגדנים ולאחר מכן שטוף את החרוזים שלוש פעמים. השתמש ב-1 mL של lyase buffer כפי שעשית קודם לכן, והשתמש במערך המגנטי לאיסוף החרוזים. לאחר השטיפות, ניתן להוסיף את הכרומטין שהורגש.
לפני תחילת הסוניקציה, יש להוציא את משקי התאים הקפואים מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס ולאפשר להם להפשיר. הכינו מבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר לסוניקציה. זאת על ידי חיתוך המבחנה לשני חלקים בסימון של 5 מיליליטר והשלכת החצי העליון.
ניתן לכסות את המבחנות עם פאראפילם או עם מכסה המבחנה. בזמן ההכנה, מקמו את המבחנה על גבי מעמד למבחנות כך שחוד ה-ator ימוקם בערך 0.5 עד סנטימטר אחד מעל תחתית המבחנה.
וודאו שהגשוש (probe) ממורכז ואינו נוגע בדפנות המבחנה כדי למנוע הקצפה של התמיסה. כעת, בצעו סוניקציה לתמיהה בשישה סבבים של 20 שניות. יש לשמור כל אחת מהדגימות באמבט מי קרח בין סבבי הסוניקציה כדי להפחית את ההקצפה.
בתחילה הגדירו את הספק המוצא לאפס ולאחר מכן הגבירו אותו ידנית לספק הסופי במהלך הפעימה הראשונה. לאחר סיום הפעולה, העבירו את החומר לפרועת של 1.5 milliliter ולאחר מכן סובבו ב-13, 000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. זאת כדי לשקיע את השאריות ולאסוף את העלואי.
העבירו את ה-SINA למבחנה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר. שמרו 50 µL של הליזט התאי מכל דגימה כ-DNA קלט (input DNA). חלק זה ישמש מאוחר יותר לבדיקת הגודל של הכרומטין המשותף.
ניתן לאחסן זאת בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. יש לשמור לפחות אליקוט אחד של DNA קלט עבור כל מנה של ליזאט שעבר סוניקציה. כעת אנו מוכנים לבצע שיקיעה חיסונית של הכרומטין.
ראשית, הוסף את כמות הכרומטין השקולה ל-50 עד 100 מיליון תאים מהמשקעים שנאספו בשלב הקודם ל-50 מיקרוליטר של תערובת הזנה מגנטית של נוגדנים שהכנו מוקדם יותר, לנפח סופי של מיליליטר אחד. במידת הצורך, ניתן להתאים נפח זה באמצעות lyce buffer; הפוך את המבחנה כדי לסבב מחדש את החרוזים. הדגר את תערובת זו למשך הלילה ברוטטור בטמפרטורה של 4 °C.
לאחר הדגרה, אספו את החרוזים באמצעות מגנט MPC והניחו את המבחנות במעמד, כך שהחרוזים יתרכזו בדופן המבחנה. פעולה זו אמורה להימשך כ-20 שניות. נערו את המעמד פעמיים כדי לסייע באיסוף כל החרוזים.
לאחר מכן, הסירו את המשקע באמצעות פיפטור, כאשר מחליפים את הטיפים בין הדגימות. בשלב הבא, יש לשטוף את החרוזיים. לשם כך, הוסיפו 1 mL של lyase buffer לכל מבחנה וערבבו בעדינות כדי להחזיר את החרוזיים לתמיכה.
ניתן לבצע זאת על ידי הסרת הפס המגנטי מהמעמד והפיכת המעמד כשהמבחנות עדיין בתוכו כ-10 עד 20 פעמים, או עד להשעיה אחידה של החרוזים. לאחר מכן, אספו את החרוזים על ידי החזרת הפס המגנטי. הסירו את הנוזל באמצעות פיפטה.
חזרו על שטיפה זו שלוש עד חמש פעמים נוספות. זכרו להחליף טיפים בין השטיפות. לאחר מכן, שטפו את החרוזיקים ארבע עד שש פעמים ב-1 mL של IP one buffer כפי שתואר הרגע.
לאחר מכן, באופן דומה, שטפו את החרוזים ארבע עד שש פעמים במילליטר אחד של IP two buffer. לבסוף, שטפו את החרוזים ארבע עד שש פעמים במילליטר אחד של TE buffer pH 8.0, כפי שנעשה בשטיפות האחרות. הסירו את ה-TE לאחר השטיפה האחרונה.
כעת סובבו ב-3000 RPM למשך שלוש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות של TE buffer. החרוזיים מוכנים כעת לשלב האלוציה להסרת הכרומטין. ראשית, הוסיפו 210 microliters של elution buffer ובצעו אלוציה של החומר מהחרוזיים על ידי דגירה של המבחנות במיקסר תרמי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס וב-800 RPM; דגרו למשך 15 דקות או עד 30 דקות כדי לשפר את השחזור של האלוואט.
סובבו את החרוזיים (beads) במהירות של 13,000 RPM למשך דקה אחת. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו 200 µL מהשקיעה (supernatant) והעבירו למבחנה חדשה, ולאחר מכן הוסיפו 200 µL של TE 0.0. כעת הדגימות מוכנות לביצוע reverse crosslink ל-DNA שהשקעה בשיטת ChIP.
דגרו את העילוי (supernatant) במקלח מים בטמפרטורה של 65 °C למשך מינימום שש שעות ועד מקסימום 15 שעות. ניתן לבצע דגירה זו במקלח מים כדי לצמצם עיבוי. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של DNA קלט.
דגימה זו נשמרה לאחר סוניקציה, ואורכי הקשרים ההפוכים של DNA קלט זה הותירו על ידי דגירה ב-65 °C, כפי שנעשה עם התמיסה המופקת (eluate). כעת אנו מוכנים לטהר את ה-DNA. ה-DNA מטוהר לאחר מכן ומשקק באמצעות מיצוי פנול-כלורופורם, ולאחריו טכניקות של שיקוע באתנול.
משקעי ה-DNA השוקעים מומסים מחדש במים ולאחר מכן ניתן לאחסנם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לשימוש עתידי, ניתן להריץ את ה-DNA המזוך על ג'ל agarose כדי לבחון את גודלו של הכרומטין הגזור. באופן אידיאלי, גודל הכרומוזום צריך להיות בין 250 ל-750 בסיסים.
כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) מתאי גזע עובריים אנושיים. בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב להשתמש בנוגדן בעל זיקה גבוהה לכרומטין בטווח גדלים המתאים, ובשלבי שטיפה בעלי רמת מחמירות גבוהה. וזהו.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה דן בדיפרנציאציה של תאי גזע עובריים (ESC) ובשינויים הנלווים במבנה ובהרכב הכרומטין. הוא מדגיש את חשיבותה של שיטת השיקוע החסוני של כרומטין (ChIP) בהבנת המנגנונים המולקולריים של דיפרנציאציה של תאי גזע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- דינמיקת כרומטין
רקע
- תאי גזע עובריים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- מבנה הכרומטין ממלא תפקיד מכריע בבקרת ביטוי גנים.
- הבנת השינויים בכרומטין יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של תאי גזע.
- ChIP היא טכניקה המשמשת לחקר אינטראקציות בין חלבון ל-DNA.
מטרת המחקר
- לחקור את השינויים בכרומטין במהלך התמיינות תאי ESC.
- להשתמש ב-ChIP כדי לנתח את המנגנונים המולקולריים של ההתמיינות.
- להרחיב את ההבנה של תכונת ה"גזעיות" (stemcellness) של תאי גזע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קישור צולב (Cross-linking) של תאי גזע עובריים אנושיים באמצעות פורמלהיד.
- הכנת חרוזי מגנט עבור אימונו-שיקבוע (Immunoprecipitation).
- סוניקציה של כרומטין מקושר צולב.
- אימונו-שיקבוע של כרומטין באמצעות נוגדנים ספציפיים.
תוצאים עיקריים
- קישור צולב (cross-linking) ושיקוע חיסוני מוצלח של כרומטין.
- זיהוי שינויים בכרומטין הקשורים לדיפרנציאציה.
- תובנות לגבי תפקידם של חלבונים ספציפיים בביולוגיה של תאי גזע.
- הדגמה של יעילות טכניקת ה-ChIP בחקר תאי ESCs.
מסקנות
- ChIP היא שיטה בעלת ערך למחקר שלו של דיפרנציאציה של תאי גזע.
- הבנת הדינמיקה של הכרומטין חיונית למחקר תאי גזע.
- מחקרים נוספים עשויים להעשיר את הידע על מנגנוני תאי גזע.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
שיקוע חיסוני של כרומטין (ChIP) מתאי גזע עובריים אנושיים מאפשר לצוותי ביו-פארמה לחקור אינטראקציות בין חלבון-DNA ובין RNA-כרומטין העומדות בבסיס החלטות לגבי גורל התא. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבי תיקוף המטרה המוקדמים ולהבנת הבקרה האפיגנטית במהלךה של התמיינות, ובכך היא משפיעה ישירות על רמת הביטחון הניבויית בתוכניות גילוי המבוססות על תאי גזע. שילוב תובנות הנגזרות מ-ChIP תומך במיון תיקי פרויקטים ומנחה אסטרטגיות תרגומיות עבור מסלולי פיתוח של רפואה רגנרטיבית וטיפולים תאיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי ישיר של תפוסת גורמי שעתוק ורגולטורים אפיגנטיים באתרים גנומיים במהלך התמיינות השושבת.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי קורלציה בין שינויים בכרומטין למצבי ביטוי גני פונקציונליים.
- מסייע בזיהוי אלמנטים רגולטוריים הקריטיים לשמירה על תכונות של תאי גזע או להנעת התמיינות.
- מספק ראיות למעורבות של המטרה (target engagement) ולוויסות מסלולים במערכות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מגדיר מצבי כרומטין מתוקפים כקריאות כמותיות עבור סריקות של הפרעות גנטיות או כימיות.
- מאפשר זיהוי הדיר בתוך אינטראקציות בין חלבון ל-DNA באמצעות נוגדנים בעלי זיקה גבוהה ובקרות סטנדרטיות.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה על ידי הגדרת פרמטרי קלט ופלט חסונים.
- משפר את המוכנות לסריקה על ידי הבטחת איכות הפרגמנטציה של הכרומטין ושל האימונופרקיפיטציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה חתימות כרומטין עם סמנים ביולוגיים תרגומיים לצורך תיקוף של מודלים פרה-קליניים.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד למחקרים פרה-קליניים על ידי מעקב אחר שינויים אפיגנטיים לאורך שלביה של הדיפרנציאציה.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים, המבוססות על ראיות מולקולריות למודולציה של המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה (predictive de-risking) עבור יישומים של תרפיה תאית ורפואה רגנרטיבית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שימוש ב-ChIP מתאי גזע עובריים אנושיים משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית, דרך זיהוי מועמדים מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מספק יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירה מונחית-היפותזה של דינמיקת כרומטין ותפקוד של חלבוני בקרה.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות וניתנות לשחזור של קישור חלבון-DNA תחת תנאים שונים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח השוואתי של מצבי כרומטין והערכה סטטיסטית של העשרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים למסלולי דDifferentiation הרלוונטיים למחלה ולפיתוח סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית הניתנת להתאמה למודלים מגוונים של תאי גזע ודיפרנציאציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה בקרב צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי ביסוס ההתקדמות בראיות מולקולריות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים ותומך בהעברת ידע בין תוכניות שונות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של כרומטין, שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ואנליזה מולקולרית כמותית.
- מחייב נוגדנים באיכות גבוהה, בקרות מאושרות וגישה לציוד סוניקציה ומכשור אנליטי.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים לגבי חומר המוצא ותנאי השטיפה.
- יש להתאים את הפרוטוקול לקווי תאי גזע שונים ולפרוטוקולי דיפרנציאציה, לפי הצורך.
- השגת תוצאות אופטימליות תלויה בספציפיות הנוגדנים וביעילות הפרגמנטציה של הכרומטין.
