Name: בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-27T19:56:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: למד לבודד תאי גזע hematopoietic מוקדמים מעוברי עכברים באמצעות מיקרו-ניתוח של ה-sac החלמון ואזור ה-AGM, ולאחר מכן מיון ציטומטרי זרימה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לקבל אוכלוסיות תאים טהורות לחקר המטופואזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dissection ובידוד מוקדם של בתאי גזע hematopoietic מ Murine שק החלמון ואת אבי העורקים באזור, בלוטת המין, כלית בינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, חשוב לקבל את כל ריאגנטים הכלים הדרושים ההליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים, בגודל 4 ו כירורגית כיתה כפוף שקצהו מלקחיים, גודל 5 / 45 (אופציונלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 מד מחטים עם מזרק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי 35mm ו 100mm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS עם 10% ו 20% בסרום שור העובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולבסוף, collagenase </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הנתיחה, אנחנו צריכים לקצור את קרני הרחם מתוך נקבה בהריון תפיסה ימים 10.5 פוסט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים מומתים על פי הנהלים שאושרו. אנו משתמשים פחמן דו חמצני מחנק, ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן של הנקבה רטוב עם אתנול את העור נפתח עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את העור עם מלקחיים, חתכים נוספים מבוצעים כדי לפתוח את הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבטן היא פתחה את צופרי הרחם ניתן דמיינו. בעזרת מלקחיים להחזיק בקרנות הרחם, לחתוך כל סוף דיסטלי למרכז כדי הבלו הן קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרניים הרחם ממוקמות אז בצלחת פטרי המכילות קר PBS עם 10% FBS להסיר רקמות הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים 4 גודל ועבודה תחת מיקרוסקופ, בעדינות להסיר את רקמת רירית הרחם מרחבי conceptus כל העובר, נזהרים שלא לנקב את השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסר לאחר, עוברים ממוקמים צלחת מתוקים עם קר PBS ו -10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את רקמת השליה לחשוף העובר עטוף שק החלמון באמצעות מלקחיים לחתוך את העובר, עטוף שק החלמון מן השליה בצומת שלהם. שק חלמון המכיל העורקים vitelline, וחלק של חבל הטבור, ניתן התגרו בעדינות מן העובר ומניחים בצד על קרח דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר הוא עבר צלחת פטרי קטנה עם רמות מינימלי של PBS עם FBS 10% - בדיוק מספיק כדי להרטיב את העובר אבל לא יותר מדי. רמות אופטימליות לשמור על העובר נייח בעוד צלחת הוא נסער לאט, תוך שמירה על העובר בבטחה במקום במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ל 30 מחטים מד, אשר משמשים כדי להסיר את החלק העליון והתחתון של העובר על ידי חיתוך forelimbs מעל ומתחת hindlimbs. היכרות עם שימוש במחטים ככלי חיתוך עשוי לקחת חלק באימון. שיטת באמצעות חתכים קטנים חוזרות ונשנות של המעבר מחטים יהיה לנתח את הרקמה, עם המחט מוחזק ביד הדומיננטית לפעול כמדריך חיתוך המחט אשר מוחזק ביד הלא דומיננטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק הגבי של העובר. זוהי רקמה המכילה את somites. בעדינות לחתוך את הרקמה הגבי ביותר תוך שמירה על מרחק מספיק מן האאורטה (קו אדום) כדי למנוע כל ניקס. חיתוך אבי העורקים היה לגרום לאובדן דם וחוסר היכולת לחזות בקלות את מיקומו. שוב, ביצוע חתכים קטנים עם המחטים היא חיונית לשמירה על מיקום חיתוך מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הרקמה הנוספת הרחק מחוץ לתצוגה ולהפוך את העובר סביב לחתוך את רקמת הגחון, שוב קיצוץ קרוב האאורטה ככל האפשר מבלי knicking זה. הקיצוץ עשוי רחוק מדי מהמיקום האופטימלי תביא רקמות הבטן להיות נוכח, אשר ניתן להסירו לאחר AGM מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר עם הצד הגבי שלה למטה או גבו נגד הצלחת. בעדינות ללכסן את העובר לפתוח על ידי לחיצה על הצדדים למטה לדמיין את מיקומו של רכסי האשכים. אלה ממוקמים מעט מחוץ למרכז כמו צינור מבנים דמויי צידיו של האאורטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את לנתיחה על ידי הסרת רקמות בצד עודף שימוש בטכניקות חיתוך כמו קודם. לאחר רקמה בצד של העובר מוסר, אז העובר מתהפך כדי להסיר את הרקמה בצד הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, AGM הוא נבדק על רקמות עודף כי ניתן להסיר בקלות עם מחטים ללא פגיעה באבי העורקים או בלוטות המין. כמו הסרת עודפי כמה תוצאות אפשריות בידוד טוב יותר של האוכלוסייה בתאי גזע מאז אנחנו סומכים רק על פני השטח כמה סמנים תא לטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש כפוף שקצהו מלקחיים, בעדינות לגרוף את כל AGM ומקום בקור PBS עם FBS 10% עד מוכן דיסוציאציה. </li></ol> דיסוציאציה ו FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את רקמות, מלכתחילה שקי חלמון ו AGMs צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בקצרה לרקמות גלולה ולסלק PBS עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות collagenase 0.25% ב-PBS עם FBS 20%, עם נפח מספיק כדי לכסות כראוי ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות ב 37 מעלות. 25-30mins עבור AGMs ו 35-40mins עבור שקי חלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה, בעדינות פיפטה הרקמות מעלה ומטה כדי ניתוק השעיות לתוך תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הרקמות עם עודף PBS wi10% ה FBS, גלולה את התאים resuspend ב PBS סטרילי טרי עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח FACS, התאים הם מוכתמים על פי המלצות היצרן. אנו משתמשים FACSAria מ BD Biosciences לבצע cytometry הזרימה. בשל גודלו ואת שבריריותם של תאים עובריים, הצמצם מיון מותאם עבור בקוטר גדול יותר של תאים hematopoietic מבוגרים, אשר אנו גם מחקר במעבדה. כמו כן, הלחץ הוא מותאם להיות פחות מאשר את התנאים הנדרשים על ידי תאים hematopoietic מבוגר. לדוגמה, מיון על FACSAria, גודל נחיר יהיה 100 מיקרון והלחץ סוג יהיה 30 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוחים בתאי גזע, תאים חיובי משולש המבטא את cKit סמנים, CD34, CD41 ו מבודדות מיון של שק החלמון ושקופיות כפול (cKit, CD34) מבודדים מן AGM באמצעות FACS. עלילה טיפוסית תיראה כך: תאים חיובי cKit מנותחים עבור CD34 ו CD41 בו זמנית או בנפרד. בדרך כלל תאים להציג הדרגתיות של חיוביות עבור הסמן כל עם האוכלוסייה בתאי גזע כפי שנמצאו משנה של האוכלוסיות חיובית. חלקות אלו מראים לנו כי השגנו תשואה טובה עם תא 100-300 תאים לכל שק החלמון ואת לכל AGM. </li></ol>

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ murine חלמון sac ו agm

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

בעובר העכבר, hematopoiesis מוקדם מתרחש בו זמנית באיברים רבים, הכוללת את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור. אזורים אלה הם מכריעים בהקמת מערכת הדם העוברים מוביל התנועה בסופו של דבר לתאי גזע לתוך הכבד העוברי ולאחר מכן פיתוח בתאי גזע בוגרים ב bonemarrow. מוקדם בתאי גזע hematopoietic יכול להיות מבודד איברים אלה באמצעות microdissection העובר ואחריו מיון תזרים cytometric להשיג האוכלוסייה טהור יותר. עדיין לא ברור כיצד אוכלוסיות אלה תא גזע לתרום הבריכה עוברית בתאי גזע בוגרים. כמו כן, חוקר במעבדה שלנו איך בתאי גזע מוקדם תפקודית שונה העובר מבוגר בתאי גזע hematopoietic. יתר על כן, מיני במעבדה שלנו אוכלוסיות שונות של בתאי גזע hematopoietic ולבדוק תפקיד פונקציונלי שלהם בהקשר של מגוון רחב של מודלים גנטיים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך מיקרו לנתיחה שאנחנו בדרך כלל להשתמש גם מראים את התוצאות של plotfter FACS טיפוסי בידוד אוכלוסיות אלה נדירים, ניתן לבצע מגוון של מבחני תפקודי כולל: מבחני המושבה השתלת מח עצם.

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

בעובר העכבר, המטופואזיס המוקדם מתרחש בו-זמנית במספר איברים, הכוללים את שק החלמון ואת אזור האורטה-גונד-מזונפרוס (aorta-gonad-mesonephros). אלו...

בעובר העכבר, המטופואזה מוקדמת מתרחשת בו-זמנית במספר איברים, הכוללים את שק החלמון, את ה-aorta goad ואת ה-meris region. חשוב מכך, ניתן לבודד תאי גזע המטופואטיים מוקדמים מאיברים אלו באמצעות מיקרו-דיסקציה של העובר, ולאחריה מיון פלואו-ציטומטרי כדי להשיג אוכלוסייה טהורה יותר.בסרטון זה, נדגים את הליך המיקרודיסקציה שבו אנו משתמשים בדרך כלל וכן נציג את התוצאות של גרף fax טיפוסי. שלום, אני קלי מורגן מהמעבדה של ד"ר Gary Gilland במכון הרפואי הווארד יוז ובמחלקת הרפואה בבית החולים Brigham and Women's, והוכשרתי רשמית על ידי Elaine Dza במרכז הרפואי האוניברסיטאי Rasmus ברוטרדם. היום אראה לכם את הליך הדיסקציה העוברית להשגת תאי גזע המטופואטיים מוקדמים משק החלמון ומאזור ה-aorta-gonad-mesonephros או AGM. ואני מייקל קיר.גם ממעבדת Go. אני אראה לכם כיצד להכין תרחיפי תאים בודדים של GM ותאי חלמון עבור HSCs באמצעות FACS. הליך זה כולל דיסקציה של האיברים ההמטופואטיים המוקדמים מעוברים ביום E 10.5, דיסוציאציה של הרקמות ומיון באמצעות FACS של תרחיפי תאים בודדים כדי לבודד תאי גזע המטופואטיים.אם כך, נתחיל. לפני התחלת הפעולה, חשוב שכל הריאגנטים והכלים הדרושים לפרוצדורה יהיו זמינים. מספריים, פינצטות, פינצטות כירורגיות בעלות קצה כפוף במידה 4, פינצטות במידה 5 (40/5), מחטים במידה 30 gauge עם מזרק, צלחות פטרי בקוטר 35 מיל

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS). CD34+ תאי גזע hematopoietic (HSC) מבודדים מתאי מעיל דם טבורי אנושי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. CD34+ HSCs מורחבים במדיום גידול מועשר בציטוקינים ונשמר בהקפאה. לבסוף, HSCs מופשרים מוזרקים לתוך גור עכבר מדוכא חיסון כדי לבסס את מודל העכבר שלו.

בידוד תאי גזע המטופויטיים מדם טבורי ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

פרוטוקול זה מתאר שימוש בתרבית העורקים-בלוטת המין-Mesonephros עבור הביטוי ניתוחים, יחידות המושבה יוצרי תרבות, הטחול ולאחר שיחזור לטווח ארוך כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים רגולטוריים, איתות המסלולים על גזע hematopoietic תא פיתוח. זה הוכח כמו מערכת יעילה ללמוד ביולוגיה של התא גזע hematopoietic ותפקוד.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

כאן אנו מציגים מתודולוגיה לניתוח המשובטים של תא גזע hematopoietic מבשרי במהלך התפתחות עובריים מאתר. אנו משלבים אינדקס מיון של תאים בודדים מאזור העורקים-בלוטת המין-mesonephros עובריים עם תרבות משותפת תא אנדותל והשתלות לאפיין את המאפיינים פנוטיפי ואת הפוטנציאל engraftment של מבשרי hematopoietic יחיד.

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד תאי גזע המטופויטיים ארוכי טווח (LT-HSCs) ותאי HSC לטווח קצר (ST-HSCs) באמצעות מערכת הדיווח Hoxb5.

שיטת בידוד לתאי גזע המטופויטיים לטווח ארוך וקצר

מחקר זה ביסס שיטה יציבה ויעילה לבידוד, תרבית וקביעה תפקודית של תאי גזע שוכני דופן כלי דם CD34+ (CD34+ VW-SCs). שיטת בידוד קלה למעקב וחסכונית בזמן זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים המעורבים במחלות לב וכלי דם.

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34+ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

למד לבודד תאי גזע hematopoietic מוקדמים מעוברי עכברים באמצעות מיקרו-ניתוח של ה-sac החלמון ואזור ה-AGM, ולאחר מכן מיון ציטומטרי זרימה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לקבל אוכלוסיות תאים טהורות לחקר המטופואזה.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

גלה סרטונים נוספים