Name: תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית על ידי יישום של זהב Fluoro על פני השטח של Colliculus מעולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: למד תיוג מדרדר של תאי הגנגליון ברשתית באמצעות Fluoro-Gold על ה-Colliculus Superior. טכניקה זו מאפשרת הערכת שרידות תאים ומחקר מסלולים עצביים בדגם עכברוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות על התמיכה מהתוכנית גלאוקומה הלאומי של הקרן האמריקאית לבריאות עוזר.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכברוש בזריקה תוך הצפק של קטמין (80mg/kg) ו xylazine (8mg/kg) (יחס נפח ב 02:01). החל משחה סטרילית סיכה העין כדי למנוע התייבשות של הקרניות במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש פרווה (מן העין לרמה האוזן) ותקן ראש בראש על הבמה על ידי ראש מהדק ולהגדיר החותכות שלו בסרגל החותכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האזור ולחטא את הפעולה עם פתרון של 10% povidone יוד ואחריו אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור ואת שרירי לחשוף את התפרים הגולגולת (sagittal, התפרים העטרה ואת רוחבי) (איור 1). החל משכך כאבים, bupivicaine ככתם לאזור החתך (שלא יעלה על 2 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור בגולגולת (O 2x2 מ&quot;מ, 0.5 מ&quot;מ משני התפרים sagittal ו רוחבי) בכל צד של תפר sagittal. הימנע קרע של קרומי המוח ואת סינוס שוכב מתחת התפרים. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="סימני ההיכר בגולגולת חולדה חיה." width="469" height="317" /> באיור 1. סימני ההיכר בגולגולת חולדה חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח את קרומי המוח על ידי מספריים האביב, למנוע קריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התוכן מוחין שנמצאת מעל פני השטח הגבי של colliculus מעולה בקפידה על ידי משאבת ואקום ושלושה לבדוק נקודות ניתן לצפות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את הצבע של רקמת המוח שינויים מאפור לאפור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק aspirating כאשר נוזל חסר צבע השדרה לצאת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להגדיל את הרמה הנמוכה ביותר שאיבה אופקית לחשוף את colliculus מעולה צהבהב מכוסה על ידי דורה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התוכן המוח על SC עד ארבע הקצוות של SC ניתן לצפות ישירות תחת מיקרוסקופ. החלק של קליפת המוח הסיר צריך להישמר עד למינימום כדי למנוע תופעות לוואי לא רצויות (למשל, חוסר תפקוד המנוע). היזהר שלא לגעת בסינוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג את הנוזל בתוך החור עם פס דק כותנה סטרילי כדי להפוך את פני השטח של SC כמו יבש ככל האפשר. ואז, במקום שכבה דקה של ספוג הג&#39;לטין מראש ספוגה זהב Fluoro 6% על פני השטח של SC (FG הוא נלקח על ידי מסופי האקסון של תאים הגנגליון ברשתית והעבירו בילטרלי retrogradely כדי somas שלה ברשתית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החור עם gelfoam ולסגור את הפצע העור עם קליפים תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיות הורשו להתאושש תחת מנורת ליבון כדי להתחמם. משככי כאבים, עצירות (100mcg/kg), מוחל דרך הפה במשך 5 ימים לאחר תיוג SC במי השתייה. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למה להשתמש בשיטה כירורגית עבור לספור הגנגליון ברשתית התא? ב עכברוש על 98% מכלל התאים הגנגליון ברשתית (RGC) ידועים הפרויקט colliculus מעולה הנגדי (SC). יישום fluoro זהב על פני השטח של SC יכול תווית כמעט כל RGCs, כך אנחנו יכולים להתמקד נוירון זה ברשתית הפגיעים ביותר גלאוקומה. השווה עם תיוג מדרדר של RGC ידי הצבת FG בגדם של עצב הראייה transected עבור 2 ימים, התערבות של הישרדות RGC ממוזער. השווה עם כתמים סגולים cresyl כי כתמי התא amacrine, RGC ותא e...

תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית על ידי יישום של זהב fluoro על פני השטח של colliculus מעולה

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

גנגליון רשתית תא (RGC) ספירת חיונית כדי להעריך את ניוון הרשתית במיוחד גלאוקומה. אמין תיוג RGC חיונית להערכת ההשפעות של טיפול כלשהו. בשנת החולדה, על 98% RGCs ידוע הפרויקט colliculus מעולה הנגדי (SC) (פורסטר פיטרס, 1967). יישום fluoro זהב (FG) על פני השטח של SC יכול תווית כמעט כל RGCs, כך שנוכל להתמקד נוירון זה ברשתית הפגיעים ביותר גלאוקומה. FG הוא נלקח על ידי מסופי האקסון של תאים הגנגליון ברשתית והעבירו בילטרלי retrogradely כדי somas שלה ברשתית. השווה עם תיוג מדרדר של RGC ידי הצבת FG בגדם של עצב הראייה transected עבור 2 ימים, התערבות של הישרדות RGC ממוזער. השווה עם כתמים סגולים cresyl כי כתמי RGCs, תאים amacrine ו האנדותל של כלי הדם שכבת הגנגליון ברשתית התא, בשיטה זו תיוג הוא ספציפי יותר RGC. וידאו זה מתאר את שיטת תיוג מדרדר של RGC ידי יישום FG על פני השטח של SC. ניתוחים כוללים קידוח בגולגולת; aspirating קליפת לחשוף את SC ויישום ספוג ג&#39;לטין על פני כל הגב של SC מוצגים. עצות שימושיות למניעת דימום תוך גולגולתי השאיפה מסיבי של SC קיבלו.

וידאו זה מתאר את שיטת תיוג מדרדר של RGC ידי יישום fluoro זהב (FG) על פני השטח של מעולה colliculus (SC). טכניקה מערבת קידוח בגולגולת, aspirating קליפת המוח, וליישם ספוג ג&#39;לטין על פני כל הגב של SC.

תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית על ידי יישום של זהב Fluoro על פני השטח של Colliculus מעולה

ספירת תאי גנגליון של הרשתית (RGC) חיונית להערכת ניוון רשתית, במיוחד בגלאוקומה. סימון מהימן של תאי RGC הוא בסיסי עבור...

שלום, אני Tu ממעבדת GOSO באוניברסיטת הונג קונג. היום אדגים כיצד לבצע סימון רטרוגרדי של תאי גנגליון ברשתית של חולדה.תאי גנגליון ברשתית יסומנו בשיטת סימון רטרוגרדי על ידי יישום צבע פלואורסצנטי על פני השטח של הגוף הריסני העליון (superior colliculus), כך שמאוחר יותר נוכל לספור את תאי הגנגליון ברשתית המוכנה בצורה שטוחה כדי להעריך את מוות התאים או את השפעת התרופה שיושמה. זוהי תמונה הממחישה את המסלול מהרשתית אל הגוף הריסני העליון. צבע פלואורסצנטי יכול להיות מובל רטרוגרדית מהגוף הריסני העליון דרך המסלול האופטי.העבירו את ה-optic chama דרך העצב האופטי אל הרשתית בעין. אנו משתמשים במיקרוסקופ כירורגי לביצוע הניתוח. השתמשו במשאבה לשאיבת קליפת המוח מהמשטח הדורסלי של ראש ה-CLE כדי להחזיק את הכובע האדום במקומו.השתמשו במקדח חולדה עבור פתיחת הגולגולת ובספוג סופג ליישום הצבע הפלואורסצנטי FG על פני השטח של המוח. המכשירים עברו עיקור באוטוקלאב לפני הפעולה, כולל פינצטה עדינה, מספרי קפיץ, מחט ואקום, ראש מקדח ותפסים לתפרים. סכין ניתוח לחיתוך העור, סרגל למדידה וצמר נמצאים אף הם במצב סטרילי.ביצענו ניתוח בחולדה באמצעות הזרקה טונית של ketamine ו-sine gel. לאחר גילוח האזור מהגובה של העין ועד לגובה האוזניים, חיטאנו את אזור הניתוח באמצעות propane odine, ולאחר מכן באלכוהול 70%. לאחר מכן, הצבנו את ראש החולדה במיקומו על גבי מעמד הראש.בצעו חיתוך בעור בקו האמצע של הראש, החל מגובה העין ועד גובה האוזניים. כעת ישנה חשיפה טובה של ה-chrono suture, ה-sagittal suture וה-transport suture, וכאן נמצאים ה-BMA וה-Lambda. סמנו את הבורג במרחק של 0.5 עד 1 מילימטר מקצה ה-AL של ה-transfer suture, ולאחר מכן סמנו אותם שוב בצורה סימטרית בשני הצדדים כדי לוודא שהסימון נמצא במרחק של לפחות 0.5 מילימטר מהתפרים.לאחר מכן נוכל להתחיל לקדוח חור לאורך צד הסימון, תוך שליטה על מהירות וכיוון המקדח כדי ליצור פריצה רחבה של הקרומים ושל ריפוי הסינוס מתחת לתפר. יש להפסיק את הקידוח כאשר הקוטר מגיע לכ-שני מילימטרים. לאחר מכן, נבדוק שוב את הצד השני באמצעות מראה כדי לוודא שהחור בגודל הנכון ובמיקום הנכון.גזרו את הקרומי המוח באמצעות מספרי קפיץ, והשתמשו בפינצטה עדינה כדי לנקות את שאריות העצם מהחור. כעת ניתן להתחיל בשאיבה באמצעות משאבת ואקום. השכבה הראשונה של ה-BR היא החומר הירוק, אותה גזרו שוב יחד עם הקרומי המוח.לאחר מכן ניתן לראות שצבע תאי ה-T משתנה ללבן. אלו הם החומר הלבן של ה-sero. בצעו את השאיבה בזהירות ובאיטיות.כעת ניתן לראות שוב את החומר האפור. הצבע משתנה והופך לפחות לבן. ניתן לראות שהוא אפור בחלק התחתון.אני מבין. כך ניתן לראות את ה-CSF הצלול יוצא. המשמעות היא שהגענו לפני השטח הגבאיים של ה-superior corus.שוב, חור מורחב ברמה זו. ואז בתחתית ניתן לראות את הקשירה (dura) בגוון צהבהב המכסה את ה-superior clus. בצעו שאיבה אופקית ברמה זו כדי למנוע הרס של תכולת ה-superior clus.כעת נוכל להתחיל ככלל. ניתן לראות את החומר הירוק. זהו למעשה צבע ירוק.כעת נגיע לחומר הלבן. צבע הרקמה הוא לבן. כעת ניתן לראות את ה-CSF זורם מתחת לצבע האפור בצורה ברורה מאוד.הסיר את השכבה האחרונה של החומר האפור, ואז תחשף הקשורה (dura) הצהובה. יש להסיר בזהירות את הקשורה מעל ה-clickers הנפרדים ואז להגדיל את החור. השתדל לוודא שניתן להבחין בשוליים המלאים של ה-clickers תחת המיקרוסקופ.יש להטות את תפס הראש של שלב הראש בזוויות שונות ולבצע שאיבה סופית עד שניתן יהיה להבחין בארבעת קצוות ה-CLE ישירות תחת המיקרוסקופ. ספגו את הנוזל בחור באמצעות רצועת כותנה דקה כדי להפוך את שטח הפנים של ה-CLE לחזק ככל האפשר. קחו חתיכת ג'לטין, שהורויה מראש ב-6% fuel gold, וחלקו אותה לחתיכות קטנות.צרו שכבה דקה שגודלה מעט גדול יותר מכל השטח הגבי של החלק העליון. הניחו אותה בזהירות על פני השטח של ה-supreme clickers, ולאחר מכן בצד הנגדי. הכניסו אותה לתוך החור כך שתכסה את כל שטח ה-clus דרך החורים עם יותר jetting waning.לבסוף, סגרו את פצע העור באמצעות סיכות תפירה ונקו את הפצע לאחר הניתוח, החזירו את ה-red לכלוב נקי ואפשרו לו להתאושש בתנאי חימום. ה-red מתנהג כרגיל לאחר הניתוח בזמן ערות.שבעה ימים לאחר סימון SC, אנו מנתחים את הרשתית ומבצעים הרכבה שטוחה (flat mount), ולאחר מכן סופרים את תאי העצב ברשתית באמצעות מיקרוסקופ אפי-פלאוריסצנטי עם מסנן UV. מכיוון ש-98% מתאי העצב ברשתית מקרינים אל ה-superior colliculi, סימון ST מהימן הוא חיוני להערכת התקדמות המחלה והשפעת התרופה. זוהי דוגמה לתאי עצב ברשתית שסומנו רטרוגרדית על רשתית בהרכבה שטוחה.

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-application-fluoro-gold-on

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל בשימוש נרחב של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מבוגר. תשעים אחוז של תאים הגנגליון ברשתית (RGCs) הם אשר אקסונים transected לחלוטין (axotomy) למות בתוך 14 ימים לאחר axotomy. מודל זה מקובל בקלות מניפולציות ניסיוני לשעתקו מאוד.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל בשימוש נרחב של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מבוגר. מודל זה הוא אידיאלי עבור ביצוע מספר מניפולציות ניסיוני כי היעד של הרשתית גלובלי או ישירות ליעד אוכלוסייה של תאים עצביים נפצעו הגנגליון ברשתית.

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה...

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

מקור: Inal, M. A. et. al., מעקב לאחור אחר Drosophila נוירונים מוטוריים עובריים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים ליפופיליים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את שיטת התיוג לאחור של נוירונים מוטוריים Drosophila באמצעות צבעים ליפופיליים. הצבע נכנס לאקסון, נע לאחור ומסמן את הנוירונים בירוק, מה שמאפשר הדמיה מפורטת של המורפולוגיה וההקרנות שלהם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

תיוג רטרוגרדי של נוירונים מוטוריים של דרוזופילה באמצעות צבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

אנו מציגים שיטה יעילה לתאי גנגליון רשתית (RGCs) בדג זברה בוגר.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

שיטת אימונוגולד לאחר ההטמעה היא אחת הדרכים היעילות ביותר לספק ניתוחים ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה תת-תאית של מולקולות ספציפיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח כמותי של קולטני גלוטמט בסינפסות סרט הרשתית.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

משני ניוון של תאי גנגליון (RGCs) מתרחשת בדרך כלל גלאוקומה. מחקר זה מתאר גישה חדשנית פעיל עבור חיתוך חלקי עצב הראייה. השימוש של החוסך הגישה מרחיב טווח היישום של המודל, מאפשר חקר מנגנוני פגיעה משנית ב RGCs בצורה חדשה.

חיתוך חלקי עצב הראייה אצל חולדות: מודל הקים עם גישה חדשה פעיל כדי להעריך משני ניוון של תאי גנגליון

למד תיוג מדרדר של תאי הגנגליון ברשתית באמצעות Fluoro-Gold על ה-Colliculus Superior. טכניקה זו מאפשרת הערכת שרידות תאים ומחקר מסלולים עצביים בדגם עכברוש.

תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית על ידי יישום של זהב Fluoro על פני השטח של Colliculus מעולה

גלה סרטונים נוספים