ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

היי, אני לורן פרנק מהמעבדה של עמנואל פוטוס במחלקה לפרמקולוגיה וטיפולים ניסיוניים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טאפטס. ואני עמנואל פוטוס. והיום נראה לכם הליך ליצירת תרביות תאי דופמין ראשוניות במוח התיכון מיילודים של מכרסמים.

הליך זה כולל את השלבים הבאים, הכנת כלים וריאגנטים. ניתוח המוח האמצעי של P אפס עד P שני מוחות מכרסמים המודדים את מקטעי המוח וציפוי הנוירונים המנותקים. אז בואו נתחיל.

הליך זה, ישנם מספר שלבי הכנה שיש לבצע מראש שבועיים-שלושה לפני יצירת תרבית נוירוני הדופמין, יש לצפות תאי גליה כך שיהיה להם זמן להתרבות ולכסות את תחתית הכלים. תאי העצב העיקריים של הדופמין יתורבו על שכבה אחת של תאי גליה יום עד שבעה ימים לפני תרבית תאי העצב הראשוניים. הסר את המדיה מתאי הגליה והחלף בשני מיליליטר של מדיום עצבי טרי יום לפני תרבית AC יש לעקר את כל הפריטים למעט מכשירי החיתוך באמצעות אור UV כולל 12 לוחות דיסקציה.

שני בקבוקוני דיסוציאציה עם מוט ערבוב מיקרו מגנטי. שני מכסי בקבוקון עם שני חורים קטנים שננעצו בחלק העליון. טבעות החלקה פרושות.

וקופסת טבעת השקופיות, זכור להשאיר אותה פתוחה. כל הכלים הללו מצופים באתנול 70% לפני תחילת יום הגידול. ראשית, קחו את כל המרכיבים של תמיסת הפפאן שישמשו לניתוק תמיסת הנוירונים הראשונית מהמקפיא ואפשרו להם להפשיר.

הקימו פלטה חמה לחימום מים ל-34 מעלות צלזיוס לעיכול והכינו מים רוויים בקרבוגן לחמצון תמיסת הפפאן. במהלך העיכול, מכינים 15 צינורות סטריליים מלאים בארבעה עד שישה מיליליטר של PBS סטרילי לשטיפת המוח לפני הדיסקציה ומניחים אותם על קרח. 20 עד 30 מיליליטר של מדיום עצבי טרי מוקצים ומונחים בחממה.

לאחר מכן, בקבוקון הדיסוציאציה מוגדר על ידי שימוש ביחידת סינון היפוך סטרילית לסינון תמיסת הפפאן, אשר מועברת לאחר מכן לבקבוקון הדיסוציאציה עם מכסה סטרפטוקוקוס של 25 מיליליטר את הבקבוקון, הכנס מזרק סטרילי, זרוק חור במכסה, המחובר למסנן 0.2 מיקרון. חבר את הקרבוגן למסנן וסרט את זה במקום. מניחים את הבקבוקון בדיסק הקלקר.

לאחר שבקבוקון הדיסוציאציה נמצא במקומו, ודא שמוט הערבוב המגנטי זז. הגז נכנס לבקבוקון, והטמפרטורה מתייצבת על 34 מעלות צלזיוס. היקף החיתוך מובא למכסה המנוע ומכשירי החיתוך מונחים על נייר אלומיניום.

ואז הניחו ריבוע אחד גדול של נייר אלומיניום ו -12 ריבועים קטנים יותר. השאירו זוג מספריים לעריפת ראשים עם נייר האלומיניום. הניחו קופסת קלקר עם מי קרח מחוץ למכסה המנוע.

לאחר מכן, הכינו את חומר ההרדמה, שהוא תערובת של 0.075 מיליליטר קטמין ו-0.075 מיליליטר קסילזין. לאחר מכן השג לפחות 12 P אפס עד P שני גורים לצלחות של 135 מילימטר עם של 23 מילימטר. ובכן, עבור עכברים, ודא שיש התאמה גנוטיפית לכל המלטה.

אם הגנוטיפ אינו ידוע, יהיה צורך לצפות תאים מכל בעל חיים על צלחות נפרדות ויהיה צורך לשמור רשומות מדויקות כדי להתאים את התאים לתוצאות הגנוטיפ הבאות. כדי להתחיל בדיסקציה, יש להרדים את החיה הראשונה בהזרקה תוך-צפקית של קטמין קסילזין. כאשר בעל חיים אינו מגיב לבדיקת תנועת זנב, הכניסו אותו למי קרח למשך 30 שניות עד להיפותרמיה.

לאחר מכן שטפו נייר אלומיניום אחד קטן, ריבועו את מספרי עריפת הראש וראש החיה באתנול 70% כדי למנוע זיהום של רקמת המוח במהלך הדיסקציה, ערפו את הראש עם המספריים, אפשרו לראש ליפול על ריבוע נייר האלומיניום והעבירו אותו מתחת למכסה המנוע. הסר בעדינות את המוח על ידי חיתוך העור תחילה עם המספריים הקטנים כדי לחשוף את הגולגולת. חותכים סביב הגולגולת 360 מעלות.

לאחר מכן מקלפים את כובע הגולגולת בעזרת מלקחיים. הרם את המוח מהגולגולת באמצעות מרית קטנה והנח אותו בצינור קרח של 15 מיליליטר. PBS קר החזיר את הצינור לקרח לפני הסרת מוח ה-S הבא.

חזור על הנתיחות עד שיהיו שלושה מוחות בצינורות נפרדים על הקרח. יוצקים מוח אחד ו-PBS על צלחת הדיסקציה הראשונה. מתחת למיקרוסקופ, הנח את המוח על פלטפורמה של דבק מגן אדן ככרית כך שהלהב יישאר חד.

השתמש בפיפטת העברה כדי להכניס את הקטעים לצינור טרי של PBS כדי לשטוף את הקטעים לפני ההעברה לתמיסת הפפאן. התחילו טיימר כאשר הקטעים הראשונים נכנסים, המשיכו את הנתיחות עד שכל המוחות מתעכלים. עם כאבי פאפ.

מקטעי המוח הראשונים יתעכלו במשך כשעה. עד להוספת הקטעים האחרונים, אפשר לעיכול להמשיך שעה נוספת במהלך העיכול. ודא שהטמפרטורה באמבט הפפאנה מתייצבת על 34 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל את שלב הטציה, השתמש בפיפטה העברה כדי למקם את מקטעי המוח בצינור סטרילי של 15 מיליליטר. נסה להימנע מהבאת עודף תמיסת פפאן. עם זאת, אם זה קורה, הסר עודפי פפאן.

לאחר מכן, שטפו את הקטעים על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום עצבי מחומם מהחממה. אפשר למקטעים להתיישב ולאחר מכן השליך בזהירות כמה שיותר תמיסה מבלי להפריע למקטעים. בצע בסך הכל שלוש כביסות.

זכור להחליף פיפטות בין שטיפות כדי למנוע זיהום באמצעות העברה טרייה של פיפטה. התחל איטרציות בשני מיליליטר של מדיה עצבית. משולש 25 פעמים, הימנע מכניסת בועות אוויר.

לאחר מכן הניחו למקטעים הלא משויכים להסתפק בשלוש דקות. השתמש בפיפטת העברה כדי לאסוף כמה שיותר סופר נאטין מבלי להפריע למקטעים בתחתית. שמור את הסופר נאטין בשפופרת סטרילית חדשה של 15 מיליליטר.

חזור על השלב הקודם באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר ואז קצה של 200 מיקרוליטר, שלאחריו הקטעים צריכים להופיע מנותקים לחלוטין לעין. הסופרנטנט מכל השינויים נאסף באותו צינור של 15 מיליליטר. אנו מוכנים לצלחת התאים חוזרים לבסוף 10 פעמים עם פיפטת העברה כדי להשיג תרחיף תאים הומוגני לספירה.

שימוש בקצה פיפטה צהוב סטרילי המכסה כל קצה של המלקחיים. זרוק בזהירות טבעת החלקה מרוכזת לזכוכית בצורה הטובה ביותר האפשרית. בתוך כל צלחת, הטבעות האלה ישמשו לבידוד אזור בתוך צלחת התרבית שבו הנוירונים יהיו מצופים.

השתמש בקצה הפיפטה כדי להחליק טבעות מעל הבאר המרכזית של כל מנה. ולהוסיף בעדינות את נפח התאים המתאים למנה. הוסף את התאים למרכז הטבעת שכבר הנחת בכלי.

זכרו להחליף טיפים לכל מנה. לאחר מכן, הוסף מאה מיקרוליטר של תמיסת GDNF מדוללת קרוב ככל האפשר לחלק החיצוני של הטבעת מכל מנה כדי לסייע בהתפשטות הנוירונים. לאחר מכן, מעכב המיטוזה פלואורו דיוקסין או FDU מתווסף מחוץ לטבעת כדי למנוע מתאי גליה לצמוח יתר על המידה.

קצות הפיפטות חוזרות לרוב לחממה ומאפשרות לתאים להתיישב למשך הלילה למחרת באמצעות קצות פיפטות סטריליות כדי לכסות את קצות המלקחיים, להסיר את הטבעות, להחזיר את הכלים לחממה ולהפריע להם כמה שפחות עד שיגיע הזמן לניסויים. בדוק את הכלים מדי יום לאיתור זיהום אפשרי, ואם הוא נצפה, הסר מיד את הכלים הבעייתיים. התרביות מוכנות לשימוש באלקטרופיזיולוגיה, ניסויים בביולוגיה מולקולרית ו-Immuno Cyto תוך שלושה שבועות.

כעת, לאחר שהתאים צופו, בואו נסתכל על כמה דוגמאות מייצגות של תאים בתרבית. כאן אנו מסתכלים על תרבית ראשונית שצופה לפני 14 יום. זו דוגמה לתרבית טובה מכיוון שאתה יכול לראות גופי תאים מובחנים עם תהליכים שמובילים מהם.

בנוסף, שימו לב להיעדר עובש או גידול פטרייתי במנה שיעיד על זיהום. זה עתה הראינו לכם כיצד לייצר תרביות תאי דופמין ראשוניות מנותקות במוח התיכון מיילודים של מכרסמים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור, לשמור על סביבה סטרילית, להשתמש רק ביילודים P אפס עד P שתי צלחת על מצעי גליה בריאים עם מדיה מותנית גליה, לשמור על צפיפות ציפוי עקבית.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.