ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים
5 בנובמבר 2008
ראשי ניתק הדופמין במוח התיכון בתרביות תאים מאפשרים ללמוד את המאפיינים presynaptic של נוירונים דופמין. הם יכולים לשמש כדי לפקח בזמן אמת שחרור הדופמין קינטיקה של חלבונים / רמות ה-mRNA של הרגולטורים של exocytosis דופמין. כאן, אנו מראים לך איך לייצר מן התרבויות הללו בילודים מכרסמים.
שלום, אני לורן פרנק מהמעבדה של עמנואל פותוס במחלקה לפרמקולוגיה וטיפול ניסיוני בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טאפטס. ואני עמנואל פותוס. והיום נראה לכם הליך להפקת תרביות ראשוניות של תאי דופמין מהגבלי של רכיבים של מכרסמים רכים.
נוהל זה כולל את השלבים הבאים: הכנת כלים וריאגנטים, ניתוח של המוח האמצעי של מוחות מכרסמים בגיל P0 עד P2, פריסת מקטעי המוח וזריעה של הנוירונים המפוזרים. בואו נתחיל.
בנוהל זה, ישנם מספר שלבי הכנה שיש לבצע מראש, שבועיים עד שלושה שבועות לפני יצירת תרבית נוירוני הדופמין; יש לזרע תאי גליה כדי שיהיה להם זמן להתרבות ולכסות את תחתית הכלי. נוירוני דופמין ראשוניים יגודלו על שכבה אחת של תאי גליה יום אחד עד שבעה ימים לפני תרבית התאים הנוירונלית הראשונית. יש להסיר את המצע מתאי הגליה ולהחליפו בשני מיליליטר של מצע נוירונלי טרי ביום שלפני תרבית ה-AC; את כל הפריטים, למעט כלי הניתוח, יש לעקר באמצעות אור UV, כולל 12 צלחות ניתוח.
שני מבחנות דיסוציאציה עם מגנט Stir bar מיקרוסקופי. שני מכסי מבחנה עם שני חורים קטנים שנקדחו בחלק העליון. טבעות החלקה פרוסות.
ואת קופסת טבעות השקופיות, זכרו להשאיר פתוחה. יש לחטא את כל הכלים הללו ב-70% ethanol לפני התחלת העבודה ביום הטיפוח. ראשית, הוציאו מהמקפיא את כל המרכיבים לתמיסת ה-pepane שתשמש להפרדת תמיסת הנוירונים הראשוניים והמתינו להפשרתם.
הגדירו פלטה חשמלית לחימום כלי זכוכית עם מים ל-34 °C עבור העיכול, והכינו מים רווים בקרבוגן לחמצון של תמיסת ה-pepane. במהלך העיכול, הכינו 15 מבחנות סטריליות הממולאות ב-4 עד 6 milliliters של PBS סטרילי לשטיפת המוחות לפני הניתוח, והניחו אותן על קרח. הקצו 20 עד 30 milliliters של מצע עצבי טרי והניחו אותם באינקובטור.
לאחר מכן, מכינים את מבחנת הדיסוציאציה באמצעות יחידת סינון flip סטרילית לסינון תמיסת הפפאיין, אשר מועברת לאחר מכן למבחנת הדיסוציאציה עם מכסה strep בנפח 25 מיליליטר; סוגרים את המבחנה, מכניסים מזרק סטרילי, יוצרים חור במכסה, המחובר למסנן של 0.2 מיקרון. מחברים את הקרבוגן למסנן ומקבעים זאת בעזרת para film. מניחים את המבחנה בדיסקי הפוליסטירן.
לאחר שהנבובת לדיסוציאציה במקומה, ודאו שמוט ערבוב מגנטי זז. הגז חודר אל הנבובת, והטמפרטורה התייצבה על 34 °C. מיקרוסקופ הנתיחה הוכנס למCבג וסביבתו, ומכשירי הנתיחה פרוסים על גבי נייר אלומיניום.
לאחר מכן, פריסו ריבוע אחד גדול של נייר אלומיניום ו-12 ריבועים קטנים יותר. השאירו מספריים לצורך ביצוע דקפיטציות (ניתוק ראש) יחד עם נייר האלומיניום. הניחו קופסת פוליסטירן עם מי קרח מחוץ למנדף.
בשלב הבא, הכינו את חומר ההרדמה, שהוא תערובת של 0.075 milliliter ketamine ו-0.075 milliliter xylazine. לאחר מכן, השגיחו לפחות 12 גורי עכברים בגיל P0 עד P2 עבור פלטות של 135 millimeter עם באר זכוכית של 23 millimeter. עבור עכברים, ודאו שיש התאמה גנוטייפית עבור כל השגרייה.
אם הגנוטיפ אינו ידוע, יהיה צורך לזרוע תאים מכל בעל חיים בצלחות נפרדות ולנהל רישומים מדויקים כדי להתאים בין התאים לתוצאות הגנוטיפ העוקבות. כדי להתחיל את הניתוח, הרד את בעל החיים הראשון באמצעות הזרקה תוך-peritoneal של ketamine Xylazine. כאשר בעל החיים אינו מגיב למבחן רפלקס הזנב (tail flick test), הנח אותו במי קרח למשך 30 שניות עד להגעה למצב של היפותרמיה.
לאחר מכן, שטפו ריבוע קטן של נייר אלומיניום, את מספרי העריפה ואת ראש החיה ב-70% ethanol כדי למנוע זיהום של רקמת המוח במהלך הנתיחה. ערפו את החיה בעזרת המספריים, אפשרו לראש ליפול על ריבוע נייר האלומיניום והעבירו אותו אל מתחת למנדף. הוציאו בעדינות את המוח על ידי חיתוך העור תחילה בעזרת המספריים הקטנים כדי לחשוף את הגולגולת. חתכו מסביב לגולגולת ב-360 מעלות.
לאחר מכן, קלפו את כיסוי הגולגולת בעזרת פינצטה. הרימו את המוח מהגולגולת באמצעות שפכטל קטן והניחו אותו בתוך מבחנה של 15 milliliter המכילה PBS קר על קרח. החזירו את המבחנה לקרח לפני הוצאת המוח הבא.
חזור על פעולות הנתיחה עד לקבלת שלושה מוחות בשפופרות נפרדות על קרח. שפוך מוח אחד ו-PBS אל צלחת הנתיחה הראשונה. תחת המיקרוסקופ, הנח את המוח על פלטפורמה של דבק sill guard כבסיס ריכוך, כדי לשמור על חדות הלהב.
השתמשו בפיפטת העברה כדי להעביר את המקטעים למסורת נקייה של PBS לשטיפת המקטעים לפני העברתם לתמיסת הפפאין. הפעילו טיימר ברגע הכנסת המקטעים הראשונים, והמשיכו בניתוחים עד שכל המוחות יעברו עיכול בפפאין.
מקטעי המוח הראשונים יעברו עיכול במשך כשעה. עד להוספת המקטעים האחרונים, יש להמתין שעה נוספת להמשך תהליך העיכול. ודאו כי הטמפרטורה באמבט הפפאין מיוצבת על 34 °C.
כדי להתחיל בשלב התגיית, השתמשו בפיפטה להעברה כדי להעביר את מקטעי המוח לשפרו sterility של 15 milliliter. נסו להימנע מהעברת עודף של תמיסת pepane. עם זאת, אם הדבר קרה, הסירו את עודפי ה-pepane.
בשלב הבא, שטפו את המקטעים על ידי הוספה של 2 mL של מצע עצבי מחומם מהאינקובטור. המתינו עד שהמקטעים ישקעו, ולאחר מכן שפו בעדינות כמה שיותר מהתמיסה מבלי להסיט את המקטעים. בצעו בסך הכל שלושה שטיפות.
זכרו להחליף פיפטות בין השטיפות כדי למנוע זיהום באמצעות שימוש בטיפ טיפול חדש. התחילו את החזרות בשני milliliters של מצע עצבי. בצעו טריטורציה 25 פעמים, והימנעו מהחדרת בועות אוויר.
לאחר מכן, יש להמתין שלוש דקות עד שהמקטעים שאינם מאוחדים ישקעו. השתמש בפ pipette העברה כדי לאסוף כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למקטעים שבתחתית. שמור את הנוזל העליון במבחנה סטרילית חדשה של 15 מיליליטר.
חזור על השלב הקודם באמצעות טיפ של פפית של 1000 microliter ולאחר מכן טיפ של 200 microliter, עד שהמקטעים ייראו מנותקים לחלוטין לעין. הנוזל העליון מכל ההעברות נאסף לאותה מבחנה של 15 milliliter. כעת ניתן לבצע זריעה. לבסוף, העבר את התאים 10 פעמים באמצעות פפית העברה כדי להשיג תהיית תאים הומוגנית לצורך ספירה.
השתמשו בטיפ טיפה צהוב סטרילי כדי לכסות כל אחת מקצות הפינצטה. הניחו בזהירות טבעת שקופית באופן הממורכז ככל האפשר על הזכוכית. בתוך כל צלחת, טבעות אלו ישמשו לבידוד אזור בתוך צלחת התרבית שבו יבצעו את זריעת הנוירונים.
השתמשו בקצה הפ pipette כדי להחליק טבעות מעל הבאר המרכזית של כל צלחת. הוסיפו בעדינות את נפח התאים המתאים לצלחת. הוסיפו את התאים למרכז הטבעת שכבר הצבתם בצלחת.
זכרו להחליף טיפים עבור כל צלחית. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת GDNF מדוללת קרוב ככל האפשר לקצה החיצוני של הטבעת בכל צלחית כדי לסייע בשגשוג הנוירונים. לאחר מכן, מוסיפים את מעכב המיטוזה fluoro dioxine או FDU מחוץ לטבעת כדי למנוע צמיחת יתר של תאי גליה.
החזירו את קצות הפפיטות לאינקובטור ואפשרו לתאים לשקוע למשך הלילה. למחרת, השתמשו בקצות פפיטות סטריליים כדי לכסות את קצות הפינצטה, הסירו את הטבעות, החזירו את הצלחות לאינקובטור והימנעו מהפרעות ככל האפשר עד למועד הניסויים. בדקו את הצלחות מדי יום לאיתור זיהומים אפשריים, ובמידה ונצפו כאלה, הסירו מיד את הצלחות הבעייתיות. התרביות יהיו מוכנות לשימוש באלקטרופיזיולוגיה, בניסויי ביולוגיה מולקולרית ובאימונו-ציטוציה תוך שלושה שבועות.
כעת, לאחר שהתאים נזרעו, נבחן מספר דוגמאות מייצגות של התאים בתרבית. כאן אנו מתבוננים בתרבית ראשונית שנזרעה לפני 14 ימים. זוהי דוגמה לתרבית טובה, כיוון שניתן לראות גופי תאים מובחנים עם שלוחות היוצאות מהם.
בנוסף, שימו לב להיעדר עובש או צמיחה פטרייתית בצלחית, אשר עלולים להעיד על זיהום. כעת הצגנו בפניכם כיצד להפיק תרביות ראשוניות של תאי דופמין מפוצלים מהמוח האמצעי של חולדה רכה שנולדה לא מזמן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור: שמרו על סביבה סטרילית, השתמשו רק ב新生-נולדים בגילאי P zero עד P two, זרעו על תשתיות גליאליות בריאות עם מצע גידול מותנה גליאלית, ושמרו על צפיפות זריעה עקבית.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוצדורה להפקת תרביות ראשוניות של תאי דופמין מהמוח האמצעי של גורים של מכרסמים. תרביות אלו חיוניות לחקר המאפיינים הפרה-סינפטיים של נוירוני דופמין ולניטור קינטיקה של שחרור דופמין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי מוח
- ביולוגיה של התא
- פרמקולוגיה
רקע
- נוירוני דופמין בג้าน המוח ממלאים תפקיד מכריע בתפקודים נוירולוגיים שונים.
- הבנת מנגנוני השחרור של דופמין חיונית למחקר במדעי המוח.
- תרביות ראשוניות מספקות מודל לבדיקה מפורטת של נוירונים אלו.
- חולדות רכיבניות (neonates) משמשות בדרך כלל להפקת תרביות אלו.
מטרת המחקר
- להדגים את יצירתם של תרביות ראשוניות של תאי דופמין מהמוח האמצעי.
- להקל על חקרם של רגולטורים של אקסוציטוזה של דופמין.
- לאפשר ניטור בזמן אמת של קינטיקת שחרור הדופמין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של כלים וריאגנטים.
- דיסקציה של המוח האמצעי ממוחות מכרסמים בשלבים P0 עד P2.
- זריעה של נוירונים מופרדים.
- ניטור של רמות חלבון/mRNA הקשורות לשחרור דופמין.
תוצאות עיקריות
- הצלחה ביצירת תרביות ראשוניות של תאי דופמין מהמוח האמצעי.
- ביסוס שיטה לניטור קינטיקת שחרור הדופמין.
- תובנות לגבי הבקרה של אקסוציטוזה של דופמין.
- יישומים פוטנציאליים להבנת הפרעות הקשורות לדופמין.
מסקנות
- הפרוצדורה המתוארת יעילה להפקת תרביות של תאי דופמין.
- ניתן להשתמש בתרביות אלו למגוון מחקרים ניסוייים.
- מחקרים נוספים עשויים להעמיק את הבנתנו לגבי תפקודם של נוירוני דופמין.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרביות ראשוניות של תאי דופמין מופרדים מהמוח האמצעי של רכישים מ新生 rodent מאפשרות מחקר מבודד של מאפייני נוירוני דופמין פרה-סינפטיים, ובכך תומכות בתיקוף מטרות במסלולים דופמינרגיים. הכנה זו מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להערכת קינטיקה של שחרור דופמין וביטוי גנים/חלבונים קשורים ללא משתבשים מערכתיים. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה עבור סריקה פרה-קלינית של תרכובות המשפיעות על תפקוד דופמינרגי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות דופמינרגיות באמצעות ניתוח של נוירונים פרה-סינפטיים מבודדים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת המעורבות של המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים במערכת מבוקרת.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים כמותיים על קינטיקת שחרור דופמין ורמות ביטוי כדי לסייע בזיהוי מועמדים מובילים ובמיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות לבדיקה: מייצר מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף המתאימות לאלקטרופיזיולוגיה, אימונוציטוכימיה, qPCR ובדיקות היתוך וסיקולרי בזמן אמת.
- תוצרי כמות: מאפשר מדידה סטנדרטית של קינטיקת שחרור דופמין וביטוי סמנים ביולוגיים לצורך סריקת תרכובות.
- סקביליות ושימוש חוזר: תומך בשחזור הפלטפורמה על פני מספר צלחות ותוצאות ניסיוניות לצורך שילוב בזרימת עבודה המשכית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מודל של新生-מכרסמים התואם למחקר על פתולוגיה דופמינרגית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי שמירה על תפקוד הנוירונים הפרסינפטיים.
- החלטות מותאמות סיכון: תומך בקריטריונים להמשך פיתוח באמצעות תפליטים מדידים הקשורים לדופמין במערכת רדוקציוניסטית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה ממוקמת בשלב הגילוי המוקדם כדי לתמוך בבדיקת השערות, פיתוח בדיקות (assays) והערכה פרה-קלינית של מודולטורים דופמינרגיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מקלה על תיקוף מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות בידוד נוירונים דופמינרגים פרה-סינפטיים.
- סריקה: מספקת תרביות מוכנות לבדיקה עם מדדי ביטוי ושחרור דופמין כמותיים לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות קינטיות ומולקולריות (קצבי שחרור, רמות גן/חלבון) להשוואת תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: מאפשרת המשכיות פרה-קלינית על ידי מידול תפקודי נוירונים דופמינרגים במערכת רלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר של תרבית משותפת של גליה ונוירונים לחקירה מתמשכת של המסלול הדופמינרגית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרה באמצעות אפיון של נוירוני דופמין פרה-סינפטיים מבודדים.
- ערך תפעולי: הכנה סטנדרטית של תשתית גליאלית והרטבת נוירונים מבטיחות הדירות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בוויסות מסלולי דופמין.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות המותאם לסיכון, בהתבסס על פרופילי ביטוי ושחרור דופמין.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנתיחה של מכרסמים בניו जन्मे ובטכניקות סטריליות לתרבית תאים.
- תלוי בהכנה מוקדמת (preconditioning) של תאי גליה ובהוספת גורמים נוירוטרופיים להישרדות נוירונלית.
- מחייב צפיפות זריעה סטנדרטית ובידוד מבוסס טבעות להשגת תנאים ניסיוניים עקביים.
- כולל שמירה על סביבה סטרילית ושימוש בתמיסות מועשרות בחמצן ופחמן דו-חמצני (carbogen) במהלך הדיסוציאציה.
- מוגבל למכרסמים בימים 0-2 לאחר הלידה, מה שדורש ניהול מושבות רבייה מתוזמנות להשגת מקור רקמה עקבי.
