Name: מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למדו לתחזק תאי גזע עובריים אנושיים בתנאי תרבית ללא תאי מאכלי, כולל מעבר רציף ואישור פלוריפוטנטיות באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מסייעת לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית והרפואה הרגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לחברי המרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית ואת המחקר בתאי גזע ב-UCLA, במיוחד ד&quot;ר Amander קלארק, ד&quot;ר ג&#39;רום זק, וחברי רחבה UCLA מכון מתקן נייד Core גזע על תמיכתם של מחקרים שלנו.

תרבות hESC יומי תחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת hESC יש לשנות את כל 24 שעות. מתוך הבקבוק ES מניות המדיה המאוחסנים ב 4 ° C, להוציא את כמות הפתרון הדרוש (~ 20ml לכל צלחת 6-היטב), מקום בצינור בז 50 מ&quot;ל, וחמים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. ברגע התקשורת חיממה, להוסיף bFGF המאוחסן ב 4 ° C עד ריכוז סופי של 10ng/ml. שים את המניות בחזרה bFGF 4 ° C מיד לאחר השימוש! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מ 6 אבל גם צלחות כל ~ 500μl של התקשורת. הקפד מערבולת את המנה תרבות להשעות פסולת להסרה. ודא bFGF בתקשורת תרבות hESC מעורבב היטב להוסיף 3ml התקשורת טרי חזרה היטב בכל צלחת 6 באר. להחזיר את צלחת בחממה. </li></ol> HESCs פיצול מן MEFs על Matrigel בדרך כלל צלחת 6-ומחוברות היטב hESCs על MEFs ניתן לפצל 1:02-01:03 על Matrigel צלחות 6-היטב, עם בארות להפוך ומחוברות שוב 4-5 ימים לאחר פיצול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר hESCs פיצול על Matrigel, MEF ממוזג התקשורת (CM) משמש כדי לשמור על pluripotency. MEF ממוזג התקשורת נעשית מראש. ביום הראשון, 1.5 × 10 7 γ-מוקרן MEFs הם זורעים לתוך בקבוק T75. ביום השני, MEFs נשטפים פעם עם בטמפרטורת החדר 1 × PBS, pH 7.4, ולאחר מכן 15 מ&quot;ל של התקשורת ES בתוספת 5ng/ml bFGF מתווסף הבקבוק. (הערה: MEFs יכול להיות מצופה לתוך צלוחיות קטנות יותר או גדולות יותר, אך היחס בין צפיפות התאים והנפח של המדיה ES צריך להיות קבוע.) בקבוק הוא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ביום השלישי, CM נאסף מוחלף עם 15 מ&quot;ל של התקשורת ES טריים בתוספת 5ng/ml bFGF. CM שנאסף מאוחסן 4 ° C. MEF ממוזג מדיה ציפוי אחד MEFs נקצרים על שבעה ימים רצופים כדי לייצר 15 × 7 = 105ml. לאחר שבעה ימים, שברים כל CM משולבים, מסונן סטרילי, aliquoted ומאוחסנים ב -20 ° C. התקשורת CM מוכן כמתואר ניתן לאחסן ולהשתמש בהם במשך חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני פיצול hESC, לשים aliquots Matrigel צינורות Eppendorf ב 4 ° C להפשיר לילה (אחד aliquot מכיל 76.2mg של Matrigel, וזה הסכום הדרוש צלחת 6-גם אחד). ביום של פיצול, לקחת אחד בקבוקון של Matrigel מופשר לצלחת 6-טוב אחד, לשים את הבקבוקון ואת 6ml של DMEM/F12 התקשורת קר על הקרח. מעבירים את Matrigel לתוך DMEM/F12 התקשורת ומערבבים היטב. הוסף 1ml של התמיסה היטב בכל צלחת 6 באר. מערבולת הצלחת להפיץ Matrigel דגירה על פני השטח את הצלחת Matrigel מכוסה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות לפני 1 פיצול hESCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs על MEFs נשטפים פעם עם 1 × PBS, pH 7.4. בהמשך 1ml של חם collagenase IV (1mg/ml) מתווסף גם כל צלחת 6-היטב ולאחר מכן את הצלחת הוא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של התקשורת ES ללא bFGF היטב כל אחד. השתמש פיפטה 1ml לתקוע בתאי גזע מהצלחת. לאסוף את כל התקשורת המכיל גושי hESCs והמתים MEFs לתוך צינור בז 50 מ&quot;ל. בואו גושים גדולים של תאים להסתפק 50-10 דקות, כך גושים hESC צורה כדורית בתחתית של התחתית בעוד MEFs נשארים תלויים supernatant. בטל supernatant, ולשטוף ידי resuspending hESC גלולה באמצעות מדיה ES חסר bFGF, ואחריו צנטריפוגה בטמפרטורת החדר 200 גרם ב 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי בצלחת בתאי גזע על צלחות Matrigel, תחילה לשטוף את הצלחות Matrigel עם בטמפרטורת החדר DMEM/F12 (1ml לכל היטב) והוספת 2.5ml של CM בתוספת 10ng/ml bFGF לכל טוב. Resuspend גלולה בהיקף מתאים של CM בתוספת 10ng/ml bFGF, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה מספר פעמים, עד גושים הופכים אחיד קטן בגודל. Aliquot את ההשעיה על 0.5ml לכל היטב על הצלחת Matrigel. שים לב כי צפיפות המושבה על Matrigel הוא גבוה יותר מאשר צפיפות מושבות ידי פיצול כרגיל על MEFs. מניחים את צלחת 37 ° C רקמות התרבות בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על hESCs על Matrigel, התקשורת CM בתוספת 10ng/ml bFGF משתנה כל 24 שעות למשך 4-5 ימים. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

סרט הווידאו הזה מדגים כיצד hESCs קטע מתוך צלחות MEF לתא ללא צלחות מזין Matrigel. שים לב כי צפיפות המושבה על Matrigel הוא גבוה יותר מאשר צפיפות מושבות ידי פיצול כרגיל על MEFs. מכתים immunofluorescence ו cytometry מיקרוסקופית או זרימה עבור סמנים hESC pluripotency, כגון אוקטובר-4 ו SSEA-4, יש צורך לאשר אחזקת hESCs במצב מובחן במזין ללא תנאים התרבות.

<table><tbody><tr><td>תחליף סרום Knockout (KSR)</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> חומצות אמינו שאינן חיוניות</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל רב (FBS)</td><td>ריאגנט</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>הנדסת ביו-רפואית</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>ריאגנט</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>דיספז (Dispase)</td><td>ריאגנט</td><td>טכנולוגיות של תאי גזע</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטריפטומייצין </td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>ריאגנט</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Oct-4</td><td>ריאגנט</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;Mouse IgG3 מצומד ל-rythrin</td><td>ריאגנט</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG מצומד ל-FITC</td><td>ריאגנט</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

מ mefs כדי matrigel 2: hescs פיצול מן mefs על matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תאים מזין, איך hESCs קטע מתוך צלחות MEF לתא ללא מזין צלחות Matrigel.

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 2 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

סרטון זה מדגים כיצד לגדל תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על תאי הזנה של פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEF), וכיצד להעביר hESCs מ-MEF...

כדי לתחזק את תרבית תאי הגזע העובריים האנושיים, יש להחליף את מצע התרבית בכל 24 שעות. לשם כך, התחילו עם בקבוק מלאי של מצע לתאי גזע עובריים המאוחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הוציאו את כמות התמיסה הדרושה, שהיא בדרך כלל כ-20 milliliters לכל שישה.פלטת בארות והעבר כמות זו למבחנה מסוג Falcon בנפח 50 milliliter וחמם את המבחנה ותכולתה ל-37 degrees Celsius באמבט מים. לאחר חימום המצע, הוסף FGF, שאוחסן ב-four degrees Celsius, עד לריכוז סופי של 10 nanograms per mil. הקפד להחזיר את מלאי ה-BFGF ל-four degrees Celsius מיד לאחר השימוש.ודאו שה-BFGF במצע התרבית של תאי גזע amox אנושיים מעורבב היטב. לאחר מכן, הסירו את כל המצע מכל באער, והשאירו כ-500 microliters לכל באער. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע טרי בחזרה לכל באער בלוח של שישה באערים והחזירו את הלוח לאינקובטור.כעת, לאחר שהראינו לכם כיצד לתחזק תאי גזע עובריים אנושיים על ONMs, נראה לכם בשלב הבא כיצד להעביר אותם ל-matrigel. כדי לפצל תאי גזע עובריים אנושיים שגודלו על ONMs ל-matrigel, נתחיל עם פלטת שש בארות מלאה (Confluent) של תאי גזע על mes, אותם ניתן לפצל ביחס של 1:2 או 1:3 לתוך פלטות שש בארות עם matrigel.פעולה זו תאפשר לבארים להגיע שוב למצב של התלכדות (confluency) ארבעה עד חמישה ימים לאחר הפיצול. בעת פיצול של תאי גזע עובריים אנושיים

from-mefs-to-matrigel-2-splitting-hescs-from-mefs-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין.

גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין. חלק 1 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel אני: hESCs Passaging בנוכחות MEFs

וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 3 מתוך 3.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

מאמר זה יתמקד דור האנדודרם הכבד האנושי אנושי אוכלוסיות תאים גזע עובריים.

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

למדו לתחזק תאי גזע עובריים אנושיים בתנאי תרבית ללא תאי מאכלי, כולל מעבר רציף ואישור פלוריפוטנטיות באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מסייעת לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית והרפואה הרגנרטיבית.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

גלה סרטונים נוספים