Name: יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: למד כיצד לבצע ניסוי ניוון נוירונים דופמינרגיים ב-C. elegans לחקר מחלת פרקינסון. השיטה מאפשרת זיהוי גורמים גנטיים נוירופרוטקטיביים ומנגנוני ניוון עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. הפרעות תנועה מחקר במעבדה כבר נתמך על ידי דיסטוניה בכמן-Strauss &amp; פרקינסון קרן, קרן הברית פרקינסון, מחלת פרקינסון האגודה האמריקאית, מחלת פרקינסון איגוד אלבמה, ג&#39;יי מייקל פוקס, קרן למחקר פרקינסון מחקר לתואר ראשון

א בנייה הביטוי פלסמיד שני פלסמידים נדרשים: אחד עבור הביטוי רקמות ספציפיות של הגן ריבית שנייה כסמן שינוי לבחירה (אם כי את הסמן פלסמיד הוא בדרך כלל זמין גם מתוך הקהילה מחקר). ניסיוני פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר האמרגן אשר באה לידי ביטוי סוג רקמה / תא של עניין, במקרה זה, טרנספורטר התובע (Pdat-1) מקדם משמש. זה ביטוי פלסמיד נוצר Gateway Invitrogen מערכת תואמת וקטור היעד (pDEST-DAT-1) כדי לאפשר את הכניסה של הגן כל הזרם עניין של האמרגן על ידי שיבוט recombinational 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CDNA של הגן של הריבית PCR מוגבר באמצעות פריימרים המכילים את עו&quot;ד Gateway רצף B recombinational. CDNA הגברה הוא recombined הראשון לתוך וקטור התורם pDONR201 כדי ליצור את וקטור הערך ולאחר מכן הפך E. coli זן DH5α. להלן מבחר של recombinants מוצלח ומיני הכנה הבידוד של ה-DNA, וקטור הכניסה recombined לתוך וקטור pDEST DAT-1-היעד כדי ליצור את הביטוי פלסמיד. פרטים על שיבוט recombinational זמינים ידנית או Gateway Invitrogen או קולדוול et al. 5. </li></ol> דה מרקר לבחירה פלסמיד סמן פלסמיד מהונדס מכיל וקטור עם מקדם נהיגה הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ברקמות ברור. בהליך זה בפרט, האמרגן UNC-54 כוננים ביטוי חלבון דובדבן בשריר הגוף קיר (Punc-54:: דובדבן). ב דור טראנסגנטי C. elegans דרך Microinjection ראה מאמר יופיטר בנושא: <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833</a> ג גנטית חוצה לניתוח ניוון מוחיים DA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים גדלים באמצעות נהלים תקן 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 10 Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: גברים GFP 1, 2 לצלחת זיווג עם 3-4 L4 הרמפרודיטים הבמה מהונדס (להביע Pdat-1: גן X ו Punc-54:: דובדבן) . זה צריך להתבצע בנפרד עבור כל אחד משלושת קווי יציב נפרד נוצר. לאחר יומיים, להסיר את הזכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את דור F1, אם יש כמה צאצאים זכרים, הזדווגות היה מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clone מתוך 5 אנדרוגינוס L4 חיות מן הצלב כל התערוכה הן Pdat-1:: ה-GFP פלורסנט סמן (בירושה מהאב זכר) לבין Punc-54: קיר דובדבן ניאון הגוף שרירים סמן (בירושה מהאב אנדרוגינוס). בעלי חיים משובטים צריכים להיות בשלב L4 על מנת להבטיח כי הם לא הזדווגו עם חיות עדיין זכר הנוכחי על הצלחת. לאפשר להם לחצות עצמית לייצר צאצאים F2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיות F2 מיוצר בשלב 3 הם משובטים החוצה. באופן ספציפי, העברת ~ חיות 5-10 כי התערוכה הן סמנים ניאון צלחות הפרט שלהם. מסך דור F3 עבור צלחות שבו 100% של חיות להביע GFP ב DA נוירונים מסוימים של בעלי חיים הם מביעים דובדבן בגוף תאים קיר השרירים. בעלי חיים אלה יהיו הומוזיגוטים Pdat-1:: α-syn; Pdat-1: גן ה-GFP ביציבות תוך העברת transgene החדש שנוצר (גן X). </li></ol> ד דופאמין Neuron ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת טרי עבור כל אחד שלוש שורות שנוצרו לעיל, כמו גם את Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: ה-GFP לבד זן. לאפשר להם לגדול לבגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מהונדס מבוגרים 30-40 מהקו בכל לצלחת חדשה. אפשר להניח אותם עוברים במשך 4 שעות ב 20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המבוגרים. אפשר העוברים להתפתח במשך ימים 3-4 ב-C º 20 עד שהם מגיעים לשלב L4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק ~ 100 מהונדס L4 חיות לצלחת המכילה 0.04 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (FUDR). התפתחות זו חוסמת נוקלאוטיד אנלוגי של הדור הבא באמצעות עיכוב של סינתזה של DNA, ובכך למנוע את הצאצאים מן מכריע את חיות הניסוי 7. הגנו על צלחות FUDR מהאור שכן הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים למבוגרים ינותחו על ימים שונים בעקבות הנחת ביצה. הימים המתאימים לניתוח נקבעים אמפירית. לדוגמה, נקבע כי יש לנו 77%, 87% ו 90% Pdat-1:: α-syn; Pdat-1: בעלי חיים GFP התערוכה הידרדר נוירונים התובע ב 6 ימים, 7 ו - 10 פיתוח פוסט, בהתאמה. לכן, אם אנו צופים כי transgene עניין עשוי לשפר ניוון מוחיים, ננתח ביום 6 ו / או 7. כמו כן, transgenes שעשוי לדכא ניוון מוחיים ינותחו על 7 ימים ו -10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 4 כריות agarose טרי (בניגוד רפידות אגר microinjection, אלה משמשים טריים אסור לייבש). הגדר את שתי שקופיות מיקרוסקופ כי יש נייר דבק על פני אותם; הקלטת משמשת spacer עבור רפידות עבות שקול. Lay 1 / 3להחליק ביניהם על הספסל (הם ממוקמים שלושה מעודכן). מניחים ירידה של agarose מותכת בשקופית מרכז במהירות שכבה אחר להחליק על גבי agarose, בניצב ועל פני כל שלוש שקופיות. הפוך את כריות נוספות, עוזב את שתי שקופיות יחד עד כרית מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח תולעת נוירונים התובע, במקום ירידה של 6 μl levamisole 3 מ&quot;מ (הרדמה) על זכוכית 22 x 30 מ&quot;מ מכסה. פיק 40 בוגרים בעלי חיים (10 תוספת מעבר 30 להיות הבקיע) לתוך הטיפה, ואז להפוך זכוכית המכסה על כרית agarose. חזור עבור כל השורות האחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון 30 חיות בכל שורה נוכחות של כל CEP ו ADE נוירון באמצעות מיקרוסקופ מתחם עם epifluorescence ו קובייה מסנן המאפשר ויזואליזציה של FITC או GFP. אנו משתמשים מעניקים GFP HYQ לסנן קוביה (טכנולוגיה Chroma). הקלטת נתונים בגיליון הניקוד המצורפת. Wild-type חיות ישמרו הקרינה GFP להשלים בכל 4 CEP ו 2 נוירונים ADE. בעלי חיים הפרט מציג הפסד של נוירונים התובע הם הבקיע כלא WT או &quot;מתנוונת&quot;. כמו כן, במידה של ניוון ניתן הבקיע על ידי ספירת נוירונים שאבדו סך כל חיה, כמו גם האוכלוסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ניתוח 2 פעמים נוספות (30 חיות יותר בכל שורה לכל משפט). המספר הכולל של תולעים מציג wild-type נוירונים התובע מתוך שלושה סיבובים של מנתח הוא בממוצע. ניתוח סטטיסטי עבור neuroprotection מבוצע לאחר מכן באמצעות התלמיד מבחן t (p &lt;0.05) להשוות תולעים שליטה (Pdat-1:: α-syn; Pdat-1:: GFP) עם זנים כי יתר להביע מועמד גנים נוירונים DA . </li></ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

ההפסד תלויי גיל של נוירונים דופאמין הוא סימן ההיכר קלינית של מחלת פרקינסון קשור הצטברות או misfolding של חלבון הקרוי אלפא synuclein. כאן אנו מדגימים כיצד התווית, דרך transgene ניאון, נוירונים של דופאמין ג elegans ו לחקות את ניוון מוחיים לראות את מחלת הפרקינסון על ידי coexpressing אדם אלפא synuclein בתאים אלה. וידאו זה מתאר את המתודולוגיה של חציית צמיחה, גנטית, הרכבה, ועל הניקוד של נמטודות מהונדס להעריך גורמים גנטיים או לשפר ניוון מוחיים או לספק ...

<table><tbody><tr><td>אגרוז</td><td>בדרגת טוהר גבוהה במיוחד</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי 20x30 מ"מ</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות מיקרוסקופ</td><td>פשוט, 3x1&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>נתיחה באמצעות פלואורסצנציה</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח (דיסקציה)</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>אפי-פלואורסצנטי</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>דגם E-800</td><td></td></tr><tr><td>קובית מסנן, GFP HYQ</td><td>פס תעגולת מעבר (Bandpass) של Endow</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של c. elegans assay ניוון neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

שיפורים באבחון וטיפול של מחלת הפרקינסון (PD) תלויים הידע על הגורמים ההופכים רגישות אוכלוסיות בסיכון. בתהליך של ניסיון לזהות גורמים גנטיים הרומן הקשורים פ&quot;ד, מדענים יצרו רשימות רבות של גנים מועמדים, פולימורפיזמים, וחלבונים המייצגים התקדמות חשובה, אך אלה נותרו מוביל מוגדר באופן מכניסטי. העבודה שלנו מכוונת כלפי משמעותית לצמצום רשימות כאלה על ידי ניצול היתרונות של מערכת חיים פשוטה מודל. בעוד בני האדם מיליארדי נוירונים, מיקרוסקופיים התולעת העגולה Caenorhabditis elegans יש בדיוק 302, מתוכן רק שמונה לייצר דופמין (DA) ב hemaphrodites. הביטוי של הגן המקודד את החלבון האנושי פ&quot;ד הקשורים, אלפא synuclein, ב C. elegans תוצאות DA נוירונים במינון וגיל תלויי ניוון מוחיים. תולעים מביע האדם אלפא synuclein בנוירונים התובע הם isogenic ולהביע הן GFP האדם אלפא synuclein תחת האמרגן טרנספורטר התובע (Pdat-1). הנוכחות של ה-GFP המשמש כסמן דמיינו בקלות עבור הבאים ניוון מוחיים התובע בבעלי חיים אלה. אנחנו בתחילה הראו כי אלפא synuclein-Induced ניוון מוחיים התובע ניתן היה להציל בעלי חיים אלה על ידי torsinA, חלבון עם פעילות המלווה מולקולרית 1. יתר על כן, מועמד פ&quot;ד גנים הקשורים לזהות במעבדה שלנו דרך בקנה מידה גדול המאמצים RNAi ההקרנה באמצעות assay אלפא synuclein misfolding היו אז ביטוי יתר של C. elegans התובע נוירונים. אנו נקבע כי חמישה מתוך שבעה גנים שנבדקו מיוצג מאפננים מועמד משמעותי פ&quot;ד כפי שהם הצילו אלפא synuclein-Induced התובע ניוון מוחיים 2. בנוסף, מעבדת לינדקוויסט (בעיה זו של יופיטר) ביצע מסכי שמרים לפיו אלפא synuclein תלויי רעילות משמש readout עבור גנים יכולה לחזק או להחליש cytotoxicity. לאחר מכן אנו נבחן המועמד גנים שמרים assay C. שלנו אלפא synuclein-Induced ניוון מוחיים elegans ומאומתים בהצלחה רבים של מטרות אלה 3, 4. המתודולוגיה שלנו כרוך דור של וקטור C. elegans נוירון ספציפי ביטוי התובע באמצעות שיבוט recombinational של cDNAs גן מועמד תחת שליטה של ​​האמרגן Pdat 1. פלסמידים אלה microinjected אז wild-type (N2) תולעים, יחד עם סמן לבחירה לשינוי מוצלח. מספר קווי ייצור מהונדס יציב את החלבון המועמד בנוירונים התובע מתקבלים וחצה אז באופן עצמאי תוך מאמץ אלפא synuclein ניווניות ולהעריך עבור ניוון מוחיים, על בעלי חיים והן ברמה נוירון יחיד, במהלך ההזדקנות.

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

שיפורים באבחון ובטיפול במחלת פרקינסון (PD) תלויים בידע על גורמי פגיעות ההופכים אוכלוסיות...

במעבדת קולדוול (Caldwell Lab), המכונה גם "בקתת התולעים" (Worm Shack), אנו חוקרים מנגנונים של מחלות נוירולוגיות ב-Caenorhabditis elegans. ולאחר יום ארוך של ניסויים פוריים, אנו מתגמלים את עצמנו בפעילות פנאי. שלום, אני אדם נייט, סטודנט לתואר ראשון ממעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אלבמה.היום, אני ואחרים נראה כיצד לבצע בדיקה של דגנרציה של נוירוני דופמין ב-C. elegans. אני אבצע הכלאה בין זן תולעים עם דגנרציה נוירונית של דופמין לבין זנים טרנסגניים המבטאים באופן יתר גנים מועמדים הקשורים למחלה ונוירוני דופמין. שלום, אני אדם הרינגטון, סטודנט לתואר שני במעבדת קולדוול.היום אראה לכם כיצד להכין תולעים טרנסגניות לניתוח נוירוני דופמין. שלום, אני Shu Amichi ואני סטודנט לתואר שני. כאן אראה לכם כיצד לבצע בדיקה לנוירוני דופמין של C elegans, הנקראים CEPs ו-ALAs.בדרך כלל, תולעים המבטאות GFP בלבד בנוירוני דופמין אינן מראות מוות של תאים. עם זאת, בנוכחות CLE, תבחינו בתהליכים אלו ובניוורו-דגנרציה התלויה בגיל. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבטא במקביל טרנסגן בנוירוני הדופמין כדי לקבוע האם הוא יכול להגביר או לדכא את הרעילות המושרה על ידי CLE. אז בואו נתחיל.לפני ביצוע ניתוח נוירוני הדופמין, עלינו תחילה להכריז את זני ה-GaN המתאימים כדי להניח שמונה תולעים המבטאות הן את alphas nucle והן GFP תחת בקרת הפרומוטור הספציפי לנוירוני דופמין dat one על פלטת הזיווג. כעת הוסיפו שתי תולעי ca טרנסגניות בשלב L4, המראות ביטוי ספציפי לנוירוני דופמין של הגן המועמד הנבחר, וכן ביטוי של הסמן הסלקטיבי הפלואורסצנטי DS red two בתאי שרירי דופן הגוף. חשוב לציין כי עבור כל מבנה טרנסגני אנו מייצרים שלושה קווי טרנסגנים יציבים.따라서 הצלבה גנטית זו צריכה להתבצע באופן נפרד עבור כל אחד משלושת השבטים היציבים שנוצרו. לאחר יומיים, יש להוציא ולהסיר את הזכרים לאחר יומיים עד שלושה ימים נוספים. יש לבחון את דור ה-F1.נוצרו מספר צאצאים זכרים וההכלאה הצליחה. בשלב הבא, העבירו באופן פרטני למצעים חדשים חמישה בעלי שלב L4 מההכלאה Aphrodite L וארבעה בעלי שלב L4 מכל הכלאה אחרת, אשר מראים הן את סמן הפלואורסצנציה GFP שהורש מההורה הזכר והן את סמן הפלואורסצנציה DS red two של שרירי דופן הגוף שהורש מההורה hamadi. על בעלי החיים המועברים להיות בשלב L4 כדי להבטיח שהם טרם הגיעו לשלב הבגרות המינית (M).כאשר הזכרים נמצאים על הצלחת, אפשרו לבעלי החיים להפרות עצמית במשך שלושה עד ארבעה ימים כדי להפיק צאצאים מדור F2. כעת נקה את צאצאי F2; כדי לעשות זאת, העבירו חמישה עד 10 בעלי חיים המציגים את שני סמני ה-cent לצלחות אישיות נפרדות.לאחר מכן, סרקו את דור ה-F3 כדי למצוא צלחות שבהן מאה אחוזים מהבעלי החיים מביעים GFP בנוירוני הדופמין, וחלק מהבעלי החיים מביעים את הסמן הפלואורסצנטי DS red two בתאי שרירי דופן הגוף. בעלי חיים אלו יהיו הומוזיגוטים עבור הגנים של alpha synuclein ו-GFP, וכן יעבירו באופן יציב את התראנסגן שנוצר זה עתה. עם השלמת הסריקה, נהיה מוכנים לביצוע ניתוח הנוירונים הדופמינרגים.כדי להתחיל בניתוח הנוירונים, הכינו מצע טרי עבור שלושת בעלי החיים שזוהו בשלב הקודם. הכינו מצע עבור כל אחד משלושת הקווים הטרנסגניים. בנוסף, הכינו מצע עבור זן ה-alpha-synuclein GFP לבדו כביקורת, ואפשרו לתולעים לגדול עד לשלב הבגרות.לאחר שהתולעים הגיעו לבגרות, העבירו 30 עד 40 בעלי חיים טרנסגניים מכל קו לצלחת חדשה. אפשרו להם להטיל ביצים במשך חמש שעות בטמפרטורה של 20 °C. לאחר חמש שעות, הסירו אותם והשליכם.מאפשרים לעוברי המבוגרים להתפתח במשך שלושה עד ארבעה ימים ב-20 °C עד שהם מגיעים לשלב L4. לאחר מכן, מעבירים כ-מאה בעלי חיים טרנסגניים בשלב L4 לצלחת המכילה 0.04 mg/mL של 5-fluoro-2'-deoxyuridine.אנלוג נוקלאוטידי זה מונע את התפתחות הדור הבא על ידי עיכוב סינתזת ה-DNA. מכיוון שפלטות FDUR רגישות לאור, הגנו אותן מהאור על ידי שמירת הפלטות תחת כיסוי ועטיפה מלאה. הכינו פד הג'ל (agar pad) לצורך ניתוח התולעים.יש להשתמש באלו כשהן טריות ולא להניח להן להתייבש. הניחו שתי זכוכיות מיקרוסקופ שעליהן מודבק פס סרט לאורכן. הסרט משמש כסבב (spacer) ליצירת רפידות בעובי שווה.הניחו זכוכית כיסוי שלישית ביניהם על משטח העבודה. הם כעת ממוקמים. שלושה זה לצד זה.הנח טיפה של שעווה מותכת במרכז השקופית והנח במהירות שקופית נוספת מעליה, בניצב לשתי השקופיות הראשונות וברוחב של שלוש השקופיות. חזור על הפעולה כדי להכין מספר פדים נוספים, לפי מספר הדגימות המיועדות לניתוח. לאחר שהפדים של השעווה מוכנים, הנח טיפה של 6 µL של חומר הרדמה בריכוז 3 mM על זכוכית כיסוי בגודל 22 על 30 מילימטר.העבירו 40 בעלי חיים בוגרים לתוך הטיפה ולאחר מכן הפכו את מכסיות הזכוכית על גבי פד האגרוס. חזרו על הפעולה עבור כל אחד מהקוים הנוספים. בדקו 30 בעלי חיים לכל קו כדי לקבוע את נוכחותם של כל CEP ושל נוירון D.באמצעות מיקרוסקופ مرکב עם פלואורסצנציית epi בקוביות פילטר המאפשרות ויזואליזציה של FITC או GFP, נשתמש בקוביות פילטר endo G-F-P-H-Y-Q להקלטת נתונים בגיליון דירוג. בעלי חיים מסוג wild type שומרים על GFP מלא בשיעורים בכל ארבעת נוירוני ה-CEP ובשני נוירוני ה-A DE. בעלי חיים בודדים המראים אובדן של נוירוני D מדורגים כ-wild type ידוע או כניווניים.נוירונים אלה נרשמים כ-LG או אובדן של GFP. באופן דומה, ניתן להעריך את היקף הניוון על ידי ספירת סך הנוירונים שאבדו בכל בעל חיים, וכן את האוכלוסייה; יש לחזור על הניתוח פעמיים נוספות, תוך שימוש ב-30 בעלי חיים נוספים לכל קו בכל ניסוי.מחושב ממוצע של מספר התולעים הכולל שהפגינו נוירוני דופמין מסוג הפרא (wild type) משלוש סבבי הניתוח. לאחר מכן, מבוצע ניתוח סטטיסטי להגנה עצבית באמצעות מבחן t של student (student's T-test), כאשר ערך P נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי. כדי להשוות בין תולעי ביקורת לבין זנים המבטאים יתר של גנים מועמדים בנוירוני דופמין, יש לבצע ניתוח זה בימים שונים לאחר השכת הביצים, כאשר ימי הניתוח המתאימים נקבעים באופן אמפירי.לדוגמה, קבענו כי 77%, 87% ו-90% מהבעלי חיים עם alpha CLE פלוס GFP מראים נוירונים דופמינרגים מנוונים ביום השישי, השביעי והעשירי לאחר הפיתוח, בהתאמה. לכן, אם נחזה כי הגן התחליפי (transgene) המדובר עשוי להגביר את הניוון העצבי, נבצע את הניתוח ביום השישי. באופן דומה, גן תחליפי שעשוי לדכא ניוון עצבי ינותח בימים השביעי והעשירי.הראינו לכם כיצד לבצע בדיקת ניוון עצבי של דופמין ב-sea elegance. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור: ראשית, להשתמש במרקר מתאים לבחירה במהלך הכלאות גנטיות. שנית, להשתמש בזכרים בריאים וב-L four HEDIS עבור ההכלאות.שלישית, ודאו שאתם מסמנים בזהירות ובעקביות את נוירוני CEP ו-DE. הליך זה יאפשר לכם לבצע סריקה מהירה של גורמים גנטיים שעשויים להגביר או לדכא את הניורודגנרציה המושרית על ידי alpha-CLE. זהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

application-c-elegans-dopamine-neuron-degeneration-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בהפרעות ומחל פרקינסון תנועה באופן כללי, מבחני התנהגות רגישים ואמינים הם חיוניים לבדיקה הרפוי פוטנציאלי חדשה. כאן, אנו מתארים לניהול סוללה של בדיקות הסנסורית לעכברים שרגישים לדרגות שונות של פגיעה במערכת nigrostriatal ושימושית למחקרים פרה.

הערכת התפקוד הסנסורית בעכברי מודל של מחלת פרקינסון

כאן אנו מתארים שני מבחני שנקבעו ללמוד ניוון מוחיים תלוי גיל של דופאמין (DA)...

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

ליפוקסיג'נאז (LOX) isozymes יכול לייצר מוצרים שעשויים להגדיל או להקטין נוירואינפלמציה ו ניוון עצבי. מחקר אינטראקציה גנטית-סביבה יכול לזהות LOX השפעות ספציפיות isozyme. באמצעות 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) מודל של נזק nigrostriatal בשני קווים מהונדסים LOX isozyme לקוי מאפשר להשוות את התרומה של איזוזימים LOX על שלמות דופאמין ודלקת.

מודלים לאינטראקציה בין סביבת גנים כדי לחשוף מנגנוני רגישות במחלת פרקינסון

במחלת פרקינסון (PD), חומר שחור (SNC) נוירונים דופאמינרגיים להתנוון, שמובילים מוטורי. כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי hydroxylase טירוזין (TH) רצף אמרגן, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome שלהם באמצעות-seq RNA.

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

כאן אנו מתארים את מערכת RatWalker, שנבנתה על ידי תכנון מחדש של מנגנון MouseWalker כדי להתאים לגודל ולמשקל המוגדלים של חולדות. מערכת זו משתמשת בהשתקפות פנימית כוללת מתוסכלת (FTIR), לכידת וידאו במהירות גבוהה ותוכנת ניתוח בגישה פתוחה כדי לעקוב אחר פרמטרים של הליכה ולכמת אותם.

יישום מערכת RatWalker לניתוח הליכה במודל חולדה גנטי של מחלת פרקינסון

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.

פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון

פרוטוקול זה מפרט בדיקת הצואה הכמותית ב-Caenorhabditis elegans צעירים מ-RAC1/CED-10, ומספק מודל פשוט לחקר שלבי מחלת פרקינסון פרודרומליים. היא מתגברת על מגבלות של מודלים בעלי חיים אחרים ומקלה על בדיקות אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בפתולוגיה פרקינסונית מוקדמת.

הערכת תנועתיות מערכת העיכול במוטנטים CAENORHABDITIS elegans RAC1/CED-10 ככלי לחקר מחלת פרקינסון מוקדמת

אולה Isacson נותן סקירה תמציתית של מחלת פרקינסון, סיבותיו, אסטרטגיות טיפוליות, ואת ההתקדמות במחקר פרקינסון.

אולה Isacson: פיתוח טיפולים חדשים עבור מחלת פרקינסון

למד כיצד לבצע ניסוי ניוון נוירונים דופמינרגיים ב-C. elegans לחקר מחלת פרקינסון. השיטה מאפשרת זיהוי גורמים גנטיים נוירופרוטקטיביים ומנגנוני ניוון עצבי.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

גלה סרטונים נוספים