יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

במעבדת קולדוול, המכונה גם "בקתת התולעים", אנו חוקרים מנגנונים של מחלות נוירולוגיות ב-Caenorhabditis elegans. ואחרי יום ארוך של ניסויים פוריים, אנו מתגמלים את עצמנו בפעילות פנאי. שלום, אני אדם נייט, סטודנט לתואר ראשון ממעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אלבמה.

היום, אני ואחרים נראה כיצד לבצע בדיקת ניוון של נוירוני דופמין ב-C Elegans. אני אבצע הכלאה בין זן תולעים עם ניוון נוירוני דופמין לבין זנים טרנסגניים המבטאים באופן יתר גנים מועמדים הקשורים למחלה ונוירוני דופמין. שלום, אני אדם הרינגטון, סטודנט לתואר שני במעבדת Caldwell.

היום אראה לכם כיצד להכין תולעי טרנסגניות לניתוח נוירוני דופמין. שלום, אני Shu Amichi ואני סטודנט לתואר מתקדם. כאן אראה לכם כיצד לבצע בדיקה לנוירוני הדופמין של C. elegans, הנקראים CEPs ו-ALMs.

בדרך כלל, תולעים המבטאות GFP בלבד בנוירוני הדופמין אינן מראות מוות תאי. עם זאת, בנוכחות CLE, תבחינו בתופעה זו ובניוродеגנרציה תלוית גיל. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבטא טרנסגן באופן משותף בנוירוני הדופמין כדי לקבוע אם הוא יכול להגביר או לדכא את הרעילות המושרית על ידי CLE. אז בואו נתחיל.

לפני ביצוע ניתוח נוירוני הדופמין, עלינו להכריז תחילה הצלבה של זני GaN המתאימים כדי להתחיל להניח שמונה תולעים המבטאות הן את alpha nucle והן את GFP תחת השליטה של הפרומוטור הספציפי לנוירוני דופמין dat one על פלטת ההזדווגות. כעת, הוסיפו שתי תולעי ca טרנסגניות בשלב L4 המציגות ביטוי ספציפי לנוירוני דופמין של הגן המועמד למחקר, וכן ביטוי של הסמן הפלואורסצנטי הניתן לבחירה DS red two בתאי שריר דופן הגוף. חשוב לציין שעבור כל מבנה טרנסגן אנו מייצרים שלושה קווי טרנסגנים יציבים.

따라서 הכלאה גנטית זו צריכה להתבצע באופן פרטני עבור כל אחד משלושת הקווים היציבים שנצרו. לאחר יומיים, יש להסיר ולהשליך את הזכרים לאחר יומיים עד שלושה ימים נוספים. יש לבחון את דור ה-F1.

קיימים מספר צאצאים זכרים וההכלאה הצליחה. בשלב הבא, העבירו בנפרד לצלחות חדשות חמישה בעלי חיים בשלב L4 מכל הכלאה, אשר מראים הן את הסמן הפלואורסצנטי GFP שהורש מהזכר והן את הסמן הפלואורסצנטי DS red 2 של שרירי דופן הגוף שהורש מההורה מהזן hamadi. בעלי החיים המועברים חייבים להיות בשלב L4 כדי להבטיח שהם עדיין לא הגיעו לשלב ההפריה.

כאשר הזכרים נמצאים על הצלחת, אפשרו לבעלי החיים להפריה עצמית במשך שלושה עד ארבעה ימים כדי להפיק דור שני (F2). כעת, בצעו ניקוי של צאצאי ה-F2; לשם כך, העבירו חמישה עד 10 בעלי חיים המציגים את שני הסמנים (cent markers) לצלחות אינדיבידואליות משלהם.

לאחר מכן, סננו את דור ה-F3 כדי למצוא צלחות שבהן מאה אחוזים מהבעליים מבטאים GFP בנוירונים דופמינרגיים וחלק מהבעליים מבטאים את הסמן הפלואורסצנטי DS red two בתאי שרירי דופן הגוף. בעליים אלו יהיו הומוזיגוטים לגבי הגנים alpha synuclein ו-GFP, וכן יעבירו באופן יציב את הטרנסגן שנוצר. עם השלמת הסינון, נהיה מוכנים לבצע את הניתוח של הנוירונים הדופמינרגיים.

כדי להתחיל בניתוח הנוירונים, הכינו מצע טרי של שלושת בעלי החיים שזוהו בשלב הקודם. הכינו מצע עבור כל אחד משלושת הקווים הטרנסגניים. בנוסף, הכינו מצע של זן ה-alpha-synuclein GFP לבדו כביקורת, ואפשרו לתולעים לגדול עד לבגרות.

לאחר שהתולעים הגיעו לבגרות, העבירו 30 עד 40 בעלי חיים טרנסגניים מכל קו לצלחת חדשה. אפשרו להם להטיל ביצים במשך חמש שעות בטמפרטורה של 20 °C. לאחר חמש שעות, הסירו אותם והשליכם.

הבוגרים מאפשרים לעוברים להתפתח במשך שלושה עד ארבעה ימים ב-20 degrees Celsius עד שהם מגיעים לשלב L four. לאחר מכן, העבירו כמאה בעלי חיים טרנסגניים בשלב L four לצלחת המכילה 0.04 mg/mL של 5-fluoro-2'-deoxyuridine.

אנלוג נוקליאוטידי זה מונע את התפתחות הדור הבא באמצעות עיכוב של סינתזת DNA. מכיוון שצלוחיות FDUR רגישות לאור, הגנו אותן מהאור על ידי השארת הצלוחיות תחת כיסוי ועטופות באופן מלא. הכין פד הג'ל עבור ניתוח התולעים.

יש להשתמש באלו כשהם טריים ולא להניח להם להתייבש. הניחו שתי זכוכיות מיקרוסקופ שעליהן מדבקה המודבקת לאורכן. המדבקה משמשת כמרווח ליצירת שכבות בעובי שווה.

הניחו זכוכית כיסוי שלישית ביניהם על השולחן. כעת הם ממוקמים בשורה של שלושה.

הניחו טיפה של שעווה מותכת במרכז השקף והניחו במהירות שקף נוסף מעליו, בניצב לשני השקפים הראשונים ובאופן שחוצה את שלושת השקפים. חזרו על הפעולה כדי להכין מספר רפידות נוספות, בהתאם למספר הדגימות שייבחנו. לאחר שרפידות השעווה מוכנות, הניחו טיפה של 6 µL של חומר הרדמה בריכוז 3 mM על זכוכית כיסוי בגודל 22 על 30 מילימטר.

העבירו 40 בעלי חיים בוגרים אל הטיפה ולאחר מכן הפכו את מכסה הזכוכית על גבי פד ה-agros. חזרו על הפעולה עבור כל אחד מהקוים האחרים. בדקו 30 בעלי חיים לכל קו כדי לקבוע את נוכחותם של כל נוירון CEP ונוירון D.

באמצעות מיקרוסקופ תרכוב עם פלואורסצנציית epi בקוביות מסננים המאפשרות הדמיה של FITC או GFP, נשתמש בקוביות מסננים של endo G-F-P-H-Y-Q כדי לתעד נתונים בגיליון דירוג. בעלי חיים מסוג wild type שומרים על ביטוי מלא של GFP בשיעורים בכל ארבעת נוירוני ה-CEP ובשני נוירוני ה-A DE. בעלי חיים בודדים המראים אובדן של נוירוני D מדורגים כ-wild type או כניווניים.

נוירונים אלה נרשמים כ-LG או אובדן של GFP. באופן דומה, ניתן להעריך את מידת הניוון על ידי ספירת סך הנוירונים שאבדו בכל חיה, וכן את אוכלוסיית הנוירונים; הניתוח חוזר פעמיים נוספות, תוך שימוש ב-30 חיות נוספות לכל קו בכל ניסוי.

מחשבים את הממוצע של מספר התולעים הכולל המציגות נוירונים דופמינרגיים מסוג בר (wild type) משלושת סבבי הניתוח. לאחר מכן, מבוצע ניתוח סטטיסטי להגנה עצבית באמצעות מבחן t של Student, כאשר ערך P נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי. כדי להשוות בין תולעי ביקורת לבין זנים המבטאים באופן יתר גנים מועמדים בנוירונים דופמינרגיים, יש לבצע ניתוח זה בימים שונים לאחר השכתת הביצים, כאשר ימי הניתוח המתאימים נקבעים באופן אמפירי.

לדוגמה, קבענו כי 77%, 87% ו-90% מהחיות עם alpha CLE פלוס GFP מראות נוירונים דופמינרגיים ניווניים ביום השישי, השביעי והעשירי לאחר הפיתוח, בהתאמה. לכן, אם אנו חוזים שהטרנסגן הנבדק עשוי להגביר את הניוון העצבי, נבצע את הניתוח ביום השישי. באופן דומה, טרנסגן שעשוי לדכא את הניוון העצבי ינותח בימים השביעי והעשירי.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע בדיקת ניוון עצבי של דופמין ב-sea elegance. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור: ראשית, להשתמש במארקר מתאים לברירה במהלך הכלאות גנטיות. שנית, להשתמש בזכרים בריאים וב-L four HEDIS לצורך ההכלאות.

שלישית, ודאו שאתם מבצעים ספירה מדויקת ועקבית של נוירוני CEP ו-DE. הליך זה יאפשר לכם לבצע בדיקה מהירה של גורמים גנטיים שעשויים להגביר או לדכא ניוון עצבי המושרה על ידי alpha alpha CLE. וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.