פרדיגמות אפיון תרופתי של C. elegans מוטאנטים הילוכים Synaptic

היי, אני קודי לוק ממעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אלבמה. אני קייל לי ואני אראה לך כיצד להכין תולעים לבדיקות חשיפה לפחמימות ו-PTZ. אני ברנרד טו ואני אדגים לכם כיצד לבצע בדיקות פחמימות.

אני קיילין ברי ואני אחראית על הסרטונים של Sea Elegance. במצגת זו, אספר את המצגת הזו ואדגים את מבחן החשיפה ל-PTZ. היום עמיתיי ואני נראה כיצד לאפיין מוטציות העברה סינפטיות עם מודל אלגנטי של אפילפסיה לאחר חשיפה ל-PTZ ופחמימה Alde עם סדרה של זנים מוטנטיים מייצגים.

אז בואו נתחיל. קייל לי יתחיל אותנו היום בהצגת הכנת מבחני פחמימות ALD ביום הראשון של ההליך. ודא שלפחות 30 תולעים בוגרות צעירות מכל גנוטיפ ומכל שכפול יהיו זמינות לבדיקות פחמימות ALD ביום השני.

עדיף אם נסיין יבחר 50 או יותר תולעים L בארבעה שלבים על צלחות NGM טריות ללא קוטלי פטריות היושבות עם e coli OP 50 כמקור מזון. גדל את התולעים במשך 12 עד 24 שעות בטמפרטורה עקבית ומתירנית. 20 מעלות צלזיוס עד 22 מעלות צלזיוס הן הטובות ביותר, אם כי 25 מעלות צלזיוס מקובלות.

ביום השני, הכינו תמיסת מלאי של 100 מילי-מולרית של Al Decarb ו-70% אתנול פזרו את הכמות המתאימה של Al Decarb על צלחות NGM. אנו משתמשים באופן עקבי ב-0.5 מילי-מולארי אל דקארב על ידי ציפוי של 37.5 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי אלדה פחמימה על צלחות פטרי 60 מילימטר ללא אוורור עם 7.5 מיליליטר בגרם. הניחו לצלחות הפחמימות להתייבש במשך כ-30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר.

אין צורך לפצח את המכסים לאחר שהצלחות יבשות. הוסף כמויות עקביות של אי קולי במרכז כל צלחת פחמימות אלדה וייבש עוד 30 עד 60 דקות. בטמפרטורת החדר, אנו בדרך כלל מוסיפים 25 מיקרוליטר של אי קולי OP 50.

נפח זה של OP 50 יוצר מדשאת מזון בגודל מספיק כדי לשמור על התולעים במקום קטן במרכז הצלחת ללא צפיפות. לאחר שמדשאת המזון יבשה, המשך במבחני פחמימות אלבה. בשל האופי הסובייקטיבי של מבחני פחמימות ALD, מומלץ מאוד לבצע ניסויים בצורה עיוורת.

לשם כך. עמית של הנסיין הראשי תייג מחדש את הלוחות המקוריים המכילים את התולעים שיש לבדוק, או שהעמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקוריות לצפני פחמימות אלדה מיד לפני הפעלת טיימר. כעת, לאחר שהלוחות הועברו בורון, ABO ימשיך בניתוח כדי להתחיל בניתוח לספור את מספר התולעים המשותקות.

ישנן שתי גישות עיקריות להגדרת שיתוק חריף המושרה על ידי אל פחמימות. הגישה הראשונה מגדירה שיתוק על ידי הפסקת שאיבת הלוע. בהערת וידאו זו, מבנה כהה הממוקם בתוך לומן הלוע של התולעת מימין למסך.

מבנה זה נקרא המטחנה ומתכווץ באופן קצבי באמצעות מנגנון כולינרגי. התנועה של התולעת בסרטון זה הואטה מאוד מחשיפה לאל דקארב. עם זאת, מטחנת הלוע של התולעת הזו עדיין זזה בבירור.

לכן, תולעת זו אינה משותקת על ידי הפסקת הגדרת השאיבה. יש לראות בסרטון זה כי מטחנת הלוע הממוקמת בצד ימין של המסך אינה מתכווצת עם הפסקת השאיבה כהגדרת העבודה לשיתוק הנגרם על ידי אל דקארב. תולעת זו צריכה להיות משותקת.

עם זאת, כמו התולעת בסרטון הקודם, תולעת זו מציגה תנועות חיפוש מזון קלות מצד לצד. למרות שהתנועה שלה נפגעה על ידי אל דקארב, תנועות אלה ימנעו מהנסיין לראות בתולעת זו משותקת על ידי הגישה השנייה להגדרת שיתוק הנגרם על ידי אל דקארב, חוסר תנועה של כל הגוף וחוסר תגובה למגע. הגישה השנייה להגדרת שיתוק הנגרם על ידי אל דקרב כוללת דחיפה עקבית של כל תולעת עם חוט פלטינה ובדיקת תגובה.

אם לא ניתן לזהות תנועות גוף בעין בלתי, הגישה המועדפת עלינו היא לדחוף את התולעים שלנו פעמיים על הראש ופעמיים על הזנב כל 30 דקות למשך שלוש שעות בסך הכל. כפי שאתם צריכים לראות, התולעת בסרטון הזה לא מזיזה את גופה בבירור. עם זאת, מכיוון שתולעת זו מגיבה לדחיפה על ידי הזזת זנבה בבירור, איננו קוראים לתולעת זו משותקת.

לפי ההגדרה השנייה של שיתוק הנגרם על ידי אל דקרב. כמו התולעת בסרטון הקודם, התולעת הזו לא מזיזה את גופה ולכן דורשת בדיקת דחיפה. עם זאת, בניגוד לתולעת בסרטון הקודם, התולעת הזו לא מגיבה בבירור לדרבון.

לכן, תולעת זו משותקת על ידי ההגדרה השנייה של שיתוק הנגרם על ידי אל דקרב. למרות שההבדל בין משותקים ולא משותקים על ידי אלדה פחמימות יכול להיות עדין, הנסיינים צריכים להיות מסוגלים לזהות שינויים משמעותיים והעברה סינפטית פשוט על ידי התבוננות במספר גדול של תולעים מייצגות שנחשפו ל-Al Decarb מיד לאחר שנאספו לצלחות Al Decarb. תולעים מסוג בר עדיין ניידות.

בסרטון הזה. אפשר לראות את אותן תולעים מסוג בר מהסרטון הקודם לאחר שעה של חשיפה ל-Al Decarb. שימו לב שהתולעים מאטות במידה מסוימת אך עדיין זזות בבירור.

בניגוד לתולעים מסוג בר, המוטאנטים של Tomasin One בסרטון זה משותקים לחלוטין או בקושי זזים לאחר שעה אחת של חשיפה. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מוטציות טומסין 1 שיש להן הפרשת אצטילכולין עודפת מחוסר יכולת לווסת באופן שלילי את שחרור המוליכים העצביים בצמתים עצביים-שריריים, עודף האצטילכולין והסדקים הסינפטיים בצמתים עצביים-שריריים בשילוב עם עיכוב פירוק אצטילכולין, Bial Decarb הופך את המוטציה של טומסין אחד לרגיש יתר על המידה, אם כי לא מוצג כאן, הוצעו תוצאות דומות הנובעות ממבחני אלדה פחמימות עם אובדן אללים של תפקוד של על 43, המקודד את C elegance ortho log של סידן cal חלבון קינאז תלוי מולין שתיים. סרטון זה מציג על 25 מוטנטים, החסרים בהעברת GABAergic מעכבת.

לאחר שעה אחת של חשיפה לפחמימות, בדומה למוטציות טומסין 1 ו-M 43, מוטציות אלה מדגימות ליקויים מוטוריים משמעותיים הנגרמות על ידי פחמימה אלדה ונראה כי הן מושפעות יותר מתולעי בר עם חשיפה לאל דקארב למשך זמן זהה. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מוטציות M 25 עם גירוי יתר של שרירי דופן הגוף משילוב של חשיפה ל-Al Decarb והפחתת העברת GABAergic המובילה ליחס העברה מעורר למעכב גדול יותר בצמתים עצביים-שריריים של CL EL ושיתוק לאחר מכן. עם זאת, מכיוון ש-tomasin אחד על 43 ועל 25 מוטאנטים מפגינים רגישויות דומות ל-Al Decarb בנקודת זמן זו.

למרות שיש סיבות שונות לגירוי יתר של שרירי דופן הגוף, נסיין לא יכול היה לדעת את המנגנון הבסיסי לרגישות יתר מבלי לדעת תחילה את זהותן של מוטציות סיבתיות. בסרטון זה, חזרנו לאותן תולעים מסוג בר מסרטון קודם לאחר שלוש שעות של חשיפה ל-Al Decarb בנקודה הסופית הזו של בדיקת הפחמימות שלנו, צריך לראות בבירור שהתולעים הללו, למרות היותן מסוג בר, משותקות לחלוטין או בקושי זזות. תולעים אלה דומות כעת פנוטיפית למוטציות TOM 1 ו-M 25 המוצגות שעה אחת לאחר החשיפה לפחמימות, ככל הנראה מכיוון שההעברה הכולינרגית המעוררת הגיעה לרמות דומות בניגוד לתולעים מסוג בר, מוטציות Synap Bren 1 נשארות ניידות במידה ניכרת לאחר שלוש שעות של חשיפה לפחמימות אלדה.

תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מוטציות Synaptive Bren one, שחסרות רמות נורמליות של הפרשת נוירוטרנסמיטרים, ויש להן פחות גירוי כולינרגי בשרירי דופן הגוף שלהן מאשר תולעי בר עץ העוקבות אחר רמות זהות של חשיפה לפחמימות אלדה בשלב זה. פוינט על ארבעה מוטאנטים, אשר חסרים באופן ספציפי בהעברה כולינרגית, צריכים להיות בעלי רגישות דומה לאל דקארב כמו מוטציות Synaptive Bren one. לעומת זאת, מוטציות טומסין 1 ו-O 25 רגישות יתר נשארות משותקות, בדומה לתולעים מסוג בר.

ראוי לציין כי תולעים מסוימות, במיוחד אלה העמידות בפני Al Decarb, עשויות לנסות לזחול מהצלחת. במקרה זה, הנסיין עשוי להפיץ כמות קבועה של חומצה פלמיטית, מחסום פיזי לתנועת תולעים. סביב צלחות אל דקארב פיזרנו 25 מיקרוליטר של 10 מיליגרם חומצה פלמיטית למיליליטר אתנול.

זה משלים את פרדיגמת החשיפה של אל דקארב. כעת, אדגים את פרדיגמת החשיפה של Penta Lean Terazol. קיילין ברי תעזור לנו במבחני PTZ.

הכנת תולעים לבדיקות PTZ זהה במהותה להכנת תולעים לבדיקות פחמימות אלדה. ההבדלים המשמעותיים היחידים בין שתי הבדיקות הם הבאים. אנו משתמשים ב-DDH two O כממס PTZ במקום 70% אתנול.

כמו כן, מכיוון שלעתים קרובות אנו לוחים כמויות גדולות יותר של PTZ מאשר פחמימות ALDE, אנו מאפשרים לצלחות להתייבש לפחות שעה אחת לפני הוספת OP 50. ניתן להשתמש בחומצה פלמיטית גם עם PTZ. כמו כן, חשוב לציין ש-PTZ הרבה פחות יציב מפחמימה אלדה ויש לאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בניתוח, ספור את מספר התולעים העוויתות באור אפילפטי כל 30 דקות למשך שעה אחת בסך הכל. עדיף לצבור מספר תולעים עם סוגים שונים של עוויתות בקטגוריות נפרדות כגון עוויתות גוף מלא, עוויתות קדמיות, שאנו מכנים שילוב של עוויתות קדמיות עם שיתוק שרירי דופן הגוף, שאנו מכנים שיתוק טוני-קלוני או שיתוק גוף מלא, שאנו מכנים טוניק טוניק. פעילות דמוית התקף כפי שנראית עם התולעת מימין עוקבת לעתים קרובות אחר עוויתות טוניות-קלוניות כפי שניתן לראות עם התולעת בטוניק השמאלי.

פעילות דמוית התקף יכולה פשוט לנבוע מעייפות שרירים בעקבות עוויתות טוניות-קלוניות חוזרות ונשנות. עם זאת, הנתונים שלא פורסמו שלנו מצביעים על כך שתולעים מסוימות יכולות להפוך לטוניק ב-PTZ באופן דומה לשיתוק המושרה על ידי אל דקרב מבלי שהיו בעבר טוניות-קלוניות. כאן אנו מראים תולעת מוטנטית מייצגת של העברה סינפטית זוחלת בהיעדר אנטגוניסט לקולטן PTZA GABA וגורם התקפים נפוץ במודלים שונים של בעלי חיים של התקפים ואפילפסיה.

שימו לב שהקצה או האף של התולעת מתנדנדים מצד לצד בזמן חיפוש מזון. בסרטון זה, אנו מראים תולעת נוספת מאותו זן מוטנטי של העברה סינפטית ששימש בסרטון הקודם. שימו לב שהתולעת הזו, שנמצאת בנוכחות 2.5 מיליגרם PTZ למיליליטר מים, ממשיכה לרוב להזיז את ראשה מצד לצד בזמן חיפוש מזון.

עם זאת, תולעת זו עוצרת מדי פעם את חיפוש המזון מצד לצד ובמקום זאת דוחפת שוב ושוב את קדמתה קדימה. לבסוף, יש לראות תולעת הנושאת את אותה מוטציה כמו התולעים בשני הסרטונים הקודמים בנוכחות 10 מיליגרם PTZ למיליליטר מים. שימו לב שתולעת זו הפחיתה את חיפוש המזון מצד לצד ודוחפת את החלק הקדמי שלה קדימה בתדירות ובעוצמה גבוהים יותר מאשר עם ריכוז נמוך יותר של PTZ.

תוצאות אלה מדגימות תלות במינון של PTZ, שאנו רואים עם כל מוטציות ההעברה הסינפטיות הרגישות ל-PTZ. חשוב לציין, חשיפה ל-PTZ אינה מספיקה כדי לגרום לעוויתות דמויות אפילפטיות בתולעים מסוג בר. כמו כן, ניסינו אך לא צפינו בעוויתות דמויות אפילפטיות הנגרמות על ידי PTZ בתולעים עם ליקויים ספציפיים בהעברה כולינרגית כגון על ארבע או תולעים עם העברה כולינרגית מוגזמת כגון טומסין אחד.

לכן, צריך להיות אפשרי לאפיין עוד יותר מוטציות העברה סינפטיות עם עמידות לפחמימות אלדה מגירעונות בתפקוד הסינפטי הכללי או ליקויים ספציפיים בהעברה כולינרגית על סמך הרגישויות היחסיות שלהם ל-PTZ. אולי באופן מפתיע, הפחתה חזקה של הפונקציה ONC 25 מוטציה, שחסרה ביטוי GABA הניתן לזיהוי באלגנטיות C. נוירונים מוטוריים מעכבים אינם מציגים פרכוסי אור אפילפטיים ספונטניים כפי שניתן לראות בסרטון זה.

מוטציה ONC 25 על 10 מיליגרם PTZ למיליליטר מים. עם זאת, מפגין עוויתות טוניות-קלוניות חזקות, אם כי לא הוצגו רק עוויתות קדמיות עם תנועה מסוימת קדמו לעוויתות טוניות-קלוניות הקשורות ל-ONC 25 וחיקו את העוויתות של מוטציות סינאפ ברן אחד. לכן, נסיין לא צריך להניח שכל המוטציות המעכבות של GABA יציגו עוויתות טוניות-קלוניות או פעילות דמוית התקף טוניק הקשורה באופן הדוק בנוכחות PTZ, במיוחד בהתחשב בסבירות להשיג אללים מוטנטיים היפומורפיים.

כעת, לאחר שהדגמנו רגישות יתר לפחמימות אלדה ול-PTZ על ידי מוטציות מעכבות של GABA, אך רק רגישות יתר לפחמימות אלדה ורגישות רגילה ל-PTZ על ידי מוטנטים חסרי ויסות שלילי של העברה כולינרגית. אפשר לתהות איך נראים מוטנטים של אובדן תפקוד UNC 43 ב-PTZ מכיוון שהם גם רגישים יתר לפחמימות אלדה כמו מוטציות ההעברה הסינפטיות האחרות שלנו ב-43 מוטאנטים אינם מציגים אפילפסיה ברורה כמו עוויתות בהיעדר PTZ, אם כי למוטאנטים אלה יש התכווצויות גוף מלאות נדירות שאינן חוזרות על עצמן, אך עדיין ספונטניות לאחר חשיפה ל-10 מיליגרם PTZ למיליליטר מים ב-43, אובדן תפקוד מוטציות קיימות, חזקות, חוזרות על עצמן ותלויות מינון עוויתות גוף מלא. בשלב זה, תוצאות אלה אינן חד משמעיות, אך נראה כי הן מצביעות על כך של-43 אסור להיות תפקיד ספציפי בהעברת GABAergic מעכבת או תפקיד בוויסות שלילי בלבד של שחרור נוירוטרנסמיטרים.

במערכת העצבים C elegance, זה עתה הראינו לכם כיצד לאפיין מוטציות העברה סינפטיות של CL elgan עם ממריצים עצביים משלימים, אלדה פחמימה, מעכב כולינאסטראז ואנטגוניסט לקולטן PTZA GABA. כאשר עוקבים אחר פרדיגמה פרמקולוגית משלימה, זכור כי מידת הרגישות לגירוי עצבי אחד אינה יכולה לחזות את מידת הרגישות לממריץ העצבי האחר ניצול מבחני פחמימות אלדה אמור לעזור להבחין בין מוטציות GABA מעכבות, המובילות את בוב על PTZ, אך רגישות יתר לפחמימות אלדה ממוטציות חסרות תפקוד סינפטי כלליות, שגם הם מובילים את בוב על PTZ, אך עמידים בפני פחמימות. יתר על כן, יש להבין כי מוטציות מעכבות GABA מביאות את בוב ל-PTZ בעוד שתולעים חסרות ויסות שלילי של העברה כולינרגית נראות פראיות ב-PTZ.

לכן, ניתן להשתמש במבחן ה-PTZ גם כדי להבחין בין סוגים אלה של מוטציות העברה סינפטיות, ששתיהן רגישות יתר לפחמימות Alde. לסיכום, גישה משלימה עם מבחני פחמימות PTZ ו-Alde אמורה לאפשר לנסיין לאפיין מוטציות העברה סינפטיות אלגנטיות של C באופן שאינו אפשרי עם כל אחת מהתרופות לבד. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.