הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

שלום, אני רנדאל הופמן, סטודנט לתארים מתקדמים במעבדתה של סוזן לינוס במחלקה לביולוגיה ב-MIT. היום אני אציג בפניכם את שיטת האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עם דטרגנט חצי-דנטורטיבי, או SDD-AGE. המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו כדי לסרוק פריונים וחלבונים אלגנולוגיים אחרים.

הגרסה שלנו של SDD age היא פשוטה ואמינה וניתנת להרחבה כדי להתאים לכל מספר של דגימות. עמילואידים עמידים באופן יוצא דופן לדנטורציה על ידי SDS, מה שמאפשר להפרידם מחלבונים אחרים באמצעות SDDH. עם זאת, לא ניתן להסתמך על נתונים מ-SDDH לבדם כדי לאשר שחומר מסוים הוא עמילואיד.

כדי לעשות זאת, עליכם להשתמש בטכניקות אחרות. עם זאת בראשכם, הרשו לי להדגים לכם. ניתן לבצע S-D-D-H-S-D-D-H באמצעות ציוד סטנדרטי לאלקטרופורזה אופקית של DNA.

ראשית, יש להרכיב את תבנית יציקת הג'ל. גודל המכשיר יהיה תלוי במספר הדגימות שברשותכם. עבור מספר רב של דגימות, אנו משתמשים בלוח של 20 על 24 סנטימטרים ובעד ארבעה מסרקים של 50 בארות.

להכנת הג'ל, תזדקק ל-agarose בעל חוזק ג'ל בינוני או גבוה, דל ב-EEO, באפר 1X TAE, ותמיסת מלאי של 10% SDS. הכן תמיסת agarose בריכוז 1.5% בתוך באפר 1X TAE. מומלץ להכין את הג'ל עבה ככל האפשר כדי שתוכל להטעין את כמות הדגימה המקסימלית ולמקסם את הגילוי. חמם את התערובת במיקרוגל עד להמסה מלאה של ה-agarose.

הוסיפו במהירות את מלאי ה-100 XSDS ל-0.1% וסובבו את המבחנה לערבוב. אם חלק מהחומר התגבש במהלך שלב זה, המיסו אותו על פלטה חימום. היזהרו שלא להביאו לרתיחה.

לאחר הוספת SDS, מכיוון שהתמיסה עלולה להקציף בקלות, יש למזג אותה לתבנית היציקה בעוד היא חמה. לאחר מכן, השתמשו במסרק כדי להסיר בועות שעלולות להפריע בהמשך במהלך העברת הג'ל. לאחר שהג'ל התקרר לחלוטין והתמצק, הסירו בזהירות את המסרקים והניחו את הג'ל בתוך המיכל.

טבלו את הג'ל לחלוטין ב-one XTAE עם 0.1%SDS. כעת ניתן להטעין את הדגימות. דגימות החלבון המשמשות ב-SDDH מוכנות בדיוק כמו ב-SDS page, למעט שני חריגים חשובים.

ראשית, יש להימנע מחימום הדגימות, שעלול לגרום לדנטורציה של האגרגטים למonomers של חלבון. שנית, יש להקפיד על מניעת דגרדציה של החלבון. מכיוון שתנאי הדנטורציה המשמשים כאן אינם מספיקים כדי לנטרל את כל הפרוטאזות, אנו ממליצים להשתמש בריכוז הגבוה לפחות פי שניים מהריכוז המומלץ של תערובת מעכבי פרוטאזה מלאה (complete protease inhibitor cocktail).

בהדגמה זו, נשתמש בליזטים מתאי שמרים המבטאים באופן יתר חלבון מסוים שמעניין אותנו. בדרך כלל אנו משתמשים בתרביות של 2 מ"ל שגודלו באופן לילה בלוחות של 96 בארות הזמינים מ-VWR, אך כאשר מנתחים חלבונים בריכוז נמוך, יש להשתמש בנפחי תרבית גדולים יותר.

קצרו את התאים על ידי סבוב של התרבית בצנטריפוגה ב-2000 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הסבוב, הסירו את הנוזל העליון (supra natant) ושטפו את התאים על ידי השעיה מחדש במים וסבוב נוסף בצנטריפוגה. לאחר הסבוב השני, הסירו את הנוזל העליון והשעיו את התאים בתמיסת פלטה (plating solution) רזרבית. האנזימים שבתמיסה מעכלים את דפנות התאים, מה שיאפשר לכם לבצע ליזיס לתאים ביעילות עם נפח קטן של בופר ליזיס. הדגירו למשך 30 דקות ב-30 degrees Celsius.

בשלב זה, השק את תאי הפלסטיק השאריים ב-800 RCF למשך חמש דקות. הסר את העלייה לחלוטין והשהה מחדש כל משקע ב-100 microliters של באפר ליזיס. לאחר מכן, כסה את הבלוק בסרט דביק ובצע ערבול במערבל vortex במהירות גבוהה למשך שתי דקות.

פעולה זו מסייעת לכל פלסטיקי הכדור להשקיע את השאריות התאיות ב-4,000 RCF למשך שתי דקות. העבר בזהירות את הסופרנטנט ללוח PCR בעל 96 בארות.

בדרך כלל, אנו מנתחים מאות דגימות בו-זמנית במעבדה שלנו, ולכן אנו נעזרים במערכת לטיפול בנוזלים (liquid handling system) כדי לסייע לנו בכך. במידת הצורך, קבעו את ריכוז החלבון של הליזטים. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת דגימה (sample buffer) בריכוז 4x לדגימות כדי להוביל לליזטים המכילים תמיסת דגימה בריכוז 1x, והדגרימו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כעת טענו את הדגימות לתוך הג'ל. במידה ורציתם, שמרו מחצית מהדגימות לצורך ניתוח SDS page. כמו כן, טענו סמני משקל מולקולרי, כולל סמנים צבועים מראש וסמן בעל משקל מולקולרי גבוה מאוד, כגון תמצית flector s מעוף.

במידת הצורך, חשוב לשמור על הג'ל קריר כדי למנוע דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך, לכן ייתכן שתרצו להריץ אותו בחדר קירור. הריצו את הג'ל במתח נמוך של פחות משלושה וולטים לסנטימטר מאורך הג'ל. הריצו את הג'ל במשך מספר שעות עד שהצבע מגיע למרחק של כסנטימטר מקצה הג'ל.

מכיוון שחלבון עמילואיד אינו עובר דנטורציה על ידי 2% SDS בטמפרטורת החדר, הוא יישאר שלם בעוד שקומפלקסים אחרים, כולל רוב המצברים שאינם עמילואידיים, יתפרקו בנוכחות 2% SDS. לפיכך, רוב החלבונים יהיו במצב מונומרי וינועו במהירות דרך הג'ל, בעוד שחלבון העמילואיד בעל המשקל המולקולרי הגבוה והעמיד ל-SDS ינוע לאט יותר.

לאחר מכן, הג'ל יהיה מוכן להעברה. למרות שניתן להשתמש בשיטות העברה מרובות, אנו מקבלים את התוצאות הטובות ביותר באמצעות העברה קפילרית. מכיוון שהעברה קפילרית יכולה להתאים לכל גודל של ג'ל, היא מעשית לניתוח של מאות דגימות.

ערימה של ניירות בלוטים (blotting papers) יבשים משמשת למשיכת התמיכה (buffer) דרך הג'ל, ובכך היא מרסבת את החלבונים על ממברנת ניטרוצלולוז הממוקמת בין הניירות לג'ל. יהיה עליך לגזור פיסת ניטרוצלולוז, כגון high bond C, extra, בממדים זהים לאלו של הג'ל. כמו כן, תצטרך לגזור 20 פיסות של נייר בלוטים מסוג GBO oh four ושמונה פיסות של נייר בלוטים מסוג GBO oh two באותו גודל של הג'ל.

GB 04 הוא עבה מאוד וסופג. לעומת זאת, GB 02 דק בהרבה ובעל מרקם עדין יותר, המבטיח מגע אחיד יותר עם הממברנה. גזרו פיסה נוספת של GB 04 לשימוש כפתיל, כך שתהיה רחבה בכ-20 סנטימטרים מהג'ל הטבול.

הניחו UL WIC של חנקן, ארבעה חתיכות של GBO oh two וחתיכה אחת של XTBS בתוך מכל פלסטיק; הרכיבו ערימה של ניירות באופן הבא: 20 חתיכות של GBO oh four יבש, לאחר מכן ארבע חתיכות של GBO oh two יבש, ולאחר מכן חתיכה אחת של GBO oh two שהורטבה מראש.

הניחו את הניטרוצלולוז על גבי ערימה זו. שטפו את הג'ל שעל תבנית היציקה בקצרה במים כדי להסיר עודפי תמיסת ריצה (running buffer). לאחר מכן, התחילו להחליק בזהירות את הג'ל מהתבנית אל הערימה, תוך כדי הרטבת הממברנה ב-TBS במידת הצורך.

הבופר הנוסף מסייע במניעת לכידת בועות בתוך הג'ל. פיפטת העברה מתאימה למטרה זו לאחר שהג'ל הועבר במלואו למערכת העברת החלבונים (stack). יש לבדוק ביסודיות אם קיימות בועות.

הרימו את קצה הג'ל והוסיפו שוב באפר עד שניתן יהיה להוציא את הבועות. הניחו את שלושת פיסות ה-GBO שהורטבו מראש שנותרו על גבי הג'ל. הבטיחו מגע מלא בין כל השכבות על ידי גלגול של פיפט באופן נחרץ לאורך החלק העליון של הערימה.

הנח משני צדי ערמת ההעברה שתי מגשים מוגבהים המכילים TBS, ופרס את הפתיל הרטוב על פני הערמה, כך ששני קצות הפתיל טבולים בנוזל. כס את ערמת ההעברה המורכבת במגש פלסטיק נוסף שעליו מונח משקל, כגון בקבוק מים של 500 מ"ל. הפתיל יספוג בופר מהמגשים וניירות הספיגה היבשים ימשכו את הבופר דרך הג'ל במשך מספר שעות.

פעולה זו תשקיע את החלבונים על גבי הממברנה; יש לאפשר להעברה להימשך לפחות שלוש שעות או במהלך הלילה. לאחר השלמת ההעברה הקפילרית, ניתן לעבד את הממברנה בשיטת western blotting סטנדרטית. כאן ניתן לראות blot טיפוסי של חלבונים שהיו בביטוי יתר (over expressed) בזן של שמרים המגביר את נטייתם של חלבונים מסוימים ליצור עמילואיד.

ניתן לראות בבירור שחלק מהמועמדים שלנו יוצרים עמילואיד או מינים עמידים ל-SDS בעלי משקל מולקולרי גבוה בצורה טובה מאוד, כמו אלה המוצגים כאן וכאן. אחרים, לעומת זאת, אינם יוצרים אגרגטים והם מונומריים לחלוטין, כגון אלה ואלה. בנוסף, ניתן לראות שגודל פולימרי העמילואיד משתנה בהתאם לחלבון, כפי שניתן לראות בשני הנתיבים הללו.

הצגנו בפניכם שיטה פשוטה לניתוח אגרגטים בלתי מסיסים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון עמילואידים של פריונים פוטנציאליים. אנו מקווים שנהניתם מהצגתנו ושמצאתם טכניקה זו שימושית למחקרים של חלבונים אימונוגניים מסוג Amy. תודה שצפיתם ובהצלחה במחקרכם.