Name: הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose גל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למדו את שיטת SDD-AGE לזיהוי וניתוח פולימרים דמויי עמילואיד בתאים. הטכניקה מאפשרת הפרדה יעילה של צבירי חלבונים עמידים ב-SDS ומתאימה ליישומים בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סיימון אלברטי לסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM25874), הווארד יוז רפואי Investigatorship המכון (ל SL), וכן הקרן הלאומית למדע מענק predoctoral הכשרה (עד ר&quot;ה).

<html> חלק 1: הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מגש הליהוק ג&#39;ל. ציוד סטנדרטי עבור אלקטרופורזה DNA אופקי יכול לשמש. עבור מספר גדול של דגימות, אנו מכינים 20 ס&quot;מ X 24 ס&quot;מ לוח עם עד ארבעה 50-היטב מסרקים. ודא הלוח אין שריטות, כמו אלה יכולים לעוות את התמונה כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פתרון 1.5% agarose (בינונית או גבוהה ג&#39;ל חוזק, EEO נמוך) ב 1X טה. הנפח צריך להיות מספיק כדי לצלול לחלוטין את השיניים מסרק - אתה רוצה לטעון מדגם ככל האפשר על מנת למקסם את הזיהוי. מיקרוגל התערובת עד agarose הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות SDS עד 0.1% מן המניות של 10%. מערבולת לערבב. אם agarose כמה מבצרת במהלך שלב זה, redissolve באמצעות צלחת חמה להיזהר רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון למגש הליהוק. שימוש במסרק לרוקן את כל הבועות, כפי שהם יכולים מאוחר יותר להפריע ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל קבע, להסיר מסרקים והמקום הג&#39;ל לתוך הטנק ג&#39;ל. לחלוטין את ג&#39;ל 1X טה לצלול המכיל 0.1% SDS. </li></ol> חלק 2: הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תפוקה גבוהה של lysates שמרים, אנחנו מתחילים עם 2-ml תרבויות גדל לילה טוב 96-חוסם עם תסיסה מהירה. במקרה זה, כל תרבות היא overexpressing חלבון של עניין. בניתוח חלבונים בשפע נמוך, תרבות כרכים גדולים יש להשתמש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים מים צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בפתרון 1 מ&quot;ל spheroplasting. דגירה של כ -30 דקות ב -30 ° C (אתה יכול לאשר את היעילות spheroplasting ידי מיקרוסקופית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 800 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts pelleted במאגר 100 מ&quot;ל תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הבלוק עם קלטת מערבולת על מהירות גבוהה במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה הסלולר פסולת בבית RCF 4000 דקות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות supernatant למיכל חדש, למשל, גם צלחת 96-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, תוכל לקבוע את הריכוז של חלבון lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מדגם 4X את דגימות כדי ליצור lysates המכיל 1X חיץ המדגם. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען ג&#39;ל. אם תרצה, תוכל לחסוך חצי נפח מדגם להרתיח אותו לניתוח SDS-PAGE. על מנת לנטר את מידת העברת מאוחר יותר, כוללים מראש מוכתם SDS-PAGE הסמן. בנוסף, סמן משקל מולקולרי המורכב של חלבונים גדולים מאוד (למשל, עוף הפקטוראלי לחלץ) יכול לשמש כדי להעריך גודל של מתחמי נפתרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה במתח נמוך (3 ≤ V / ס&quot;מ אורך ג&#39;ל) עד ​​הכניסה לצבוע מגיע ~ 1 ס&quot;מ מהקצה של הג&#39;ל. זה ייקח כמה שעות. חשוב הג&#39;ל להישאר רגוע, אחרת דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (לדוגמה, מונומרים) יכול להגביל את גילוי שלהם. </li></ol> חלק 3: העברת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פיסת nitrocellulose לממדי כמו הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 20 חתיכות של GB004 ו -8 פיסות נייר סופג GB002, לממדי כמו הג&#39;ל. חותכים חתיכה נוספת של GB004 לשמש הפתיל; לעשות את זה על 20 סנטימטרים יותר מאשר הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את nitrocellulose, פתילה, ו 4 חתיכות של GB002 ב 1X כפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיכל פלסטיק, להרכיב את ערימת ניירות כדלקמן: 20 חתיכות של GB004 יבש, אז 4 חתיכות של GB002 יבש, אז חתיכה אחת של GB002 מראש רטוב. הנח את nitrocellulose על גבי זה בערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הג&#39;ל על בקצרה את מגש הליהוק במים כדי להסיר את החיץ פועל עודף. ואז, בזהירות מתחילים להחליק את הג&#39;ל את המגש על הערימה. אמנם החלקת ג&#39;ל את המגש, לכבות את הממברנה עם כפות לפי הצורך. חיץ נוסף עוזר למנוע בועות מלהפוך לכודים תחת הג&#39;ל. פיפטה להעביר עובד היטב למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל הועברה מחסנית, לבדוק ביסודיות על בועות. אם יש כאלה, להרים את קצה הג&#39;ל ולהחיל מחדש חוצץ עד בועות יכול להיות עבד החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את יתרת three מראש הרטובות GB002 חתיכות על גבי הג&#39;ל. ודא קשר יסודי בין כל השכבות על ידי גלגול פיפטה בחוזקה לרוחב החלק העליון של המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלע מחסנית העברה עם שני מגשים גבוהות המכיל כפות. לכסות את הפתיל מראש רטוב על פני מחסנית כזו או סוף הפתיל הוא שקוע כפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הערימה העברת התאספו עם מגש פלסטיק נוספת נושאת משקל נוסף (למשל, בקבוק 500 מ&quot;ל מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להמשיך להעביר מינימום של שלוש שעות, או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה, הקרום יכול להיות מעובד על ידי תקן המערבי סופג. </li></ol> Spheroplasting פתרון 1.2 מ &#39;ד סורביטול 0.5 mM MgCl 2 20 מ&quot;מ טריס, pH 7.5 BME 50 מ&quot;מ (להוסיף טרי) 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Zymolyase 100T (להוסיף צח) coration: להדגיש: &quot;&gt; תמוגה הצפת 100 מ&quot;מ טריס 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (להוסיף צח) מעכבי פרוטאז (להוסיף צח) לדוגמא 4X הצפת טה 2X 20% גליצרול 8% SDS כחול bromophenol להעדפה

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE דווח לראשונה על ידי Kryndushkin et al. 1, ללמוד SDS עמידים קומפלקסים של [PSI +] הפריון של שמרים, ומצא כי השימוש הנרחב ללמוד הן הפריון ואת הפריון הלא אגרגטים 2-9. עם זאת, העברה של חלבונים כדי אלקטרופורזה קרום הבאים ג&#39;ל agarose הוא בעייתי, והוא יכול להביא תמונה כתם מעוות 5. בנוסף, טכניקה electroblotting שקוע הנפוץ ביותר מציג מגבלות מעשיות בגודל של הג&#39;ל ולכן מספר דגימות כי יכול להיות מעובד. אנחנו צריכים לטפל בבעיות אלה על ידי המעסיק להעביר נימי כלפי מטה 10, הליך פשוט אשר משתמשת ערמת ניירות סופג יבש להעברת חלבונים מן הג&#39;ל על קרום nitrocellulose. העברת נימי מונע עיוות ומאפשר ג&#39;לים גדול להיות מעובד בנקל. יש כמה דברים לשקול לפני השימוש SDD-AGE. לקבלת דוגמיות גולמי (למשל, lysates), immunodetection של חלבונים מסוימים הוא הכרחי. SDD-AGE אינו מלא לפגל קומפלקסים חלבונים של עניין, כל כך את החלבון (ים) כדי להתגלות חייב לשאת תג epitope מחוץ לאזור amyloidogenic. Lysates יכולים בדרך כלל להיות מוכנים כפי שהם היו להיות נורמלי SDS-PAGE, עם שני הבדלים חשובים. ראשית, הטיפול חייב להילקח מוגברת כדי למנוע השפלה ידי proteolysis. התנאים חלקית denaturing משמש כאן אינם מספיקים כדי להשבית פרוטאזות, והוא יכול גם לייצר חלבונים היעד רגישים יותר proteolysis. השתמש קוקטייל להשלים מעכבי פרוטאז בריכוז לפחות כפולה מומלץ. שנית, חימום הדגימות יש להימנע. אם פקד כל מונומר שלילי הרצויה, למשל כדי לאשר גבוהה מולקולרית משקל מינים שאינם בשל שינויים קוולנטיים, דגירה של 10 דקות בשעה 95 ° C יכול לשמש, אשר תשחזר ביותר amyloids לחלבון monomeric.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>ניטרוסלולוז Hybond-C extra</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>נייר בלטינג GB004</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>נייר בלטינג GB002 (3MM Chr)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

צבירה עמילואיד קשורה רבים misfolding פתולוגיות חלבון בבסיס המאפיינים זיהומיות של פריונים, שהם conformationally עצמית בניית תבנית חלבונים, כי הם חשבו שיש תפקידים מועילים אורגניזמים נמוכה יותר. Amyloids היה קשה ללמוד לשמצה בשל שבחוסר שלהם הטרוגניות מבנית. עם זאת, החלטה של ​​פולימרים עמילואיד על בסיס גודל שבחוסר אבקת כבר מתאפשרת על ידי חצי Denaturing דטרגנט-agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDD-AGE). טכניקה זו היא למצוא שימוש נרחב לגילוי ואפיון של וריאנטים עמילואיד קונפורמציה. הנה, אנחנו מדגימים עיבוד של טכניקה זו המאפשרת את השימוש בו יישומים בקנה מידה גדול, כגון מסכי עבור פריונים הרומן amyloidogenic חלבונים אחרים. השיטה החדשה SDD-AGE משתמשת להעביר נימי של אמינות גדולה יותר וקלות השימוש, והוא מאפשר לכל ג&#39;ל בגודל להיות לאכלס. לכן, מספר גדול של דגימות, שהוכן תאים או חלבונים מטוהרים, יכול להיות מעובד בו זמנית עבור נוכחות של SDS מסיס conformers של החלבונים המתויגים.

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

אגרגציה של עמילואיד קשורה לפתולוגיות רבות של קיפול חלבונים שגוי ומהווה את הבסיס לתכונות הזיהומיות של פריונים, שהם...

שלום, אני רנדל הופמן, סטודנט לתואר שני במעבדתה של סוזן לינוס במחלקה לביולוגיה ב-MIT. היום אני אציג בפניכם את שיטת האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עם דטרגנט חצי-דנטורטיבי, או SDD-AGE. המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו כדי לסרוק פריונים וחלבונים אלגנוגניים אחרים.הגרסה שלנו ל-SDD age היא פשוטה ואמינה וניתן להרחיבה כדי להכיל כל מספר של דגימות. עמילואידים עמידים באופן חריג לדנטורציה על ידי SDS, מה שמאפשר להפריד אותם מחלבונים אחרים באמצעות SDDH. עם זאת, לא ניתן להשתמש בנתונים מ-SDDH כשלעצמם כדי לאשר שחומר מסוים הוא עמילואיד.כדי לעשות זאת, עליכם להשתמש בטכניקות אחרות. עם זאת בחשבון, הרשו לי להראות לכם. ניתן לבצע S-D-D-H-S-D-D-H באמצעות ציוד סטנדרטי לאלקטרופורזה אופקית של DNA.ראשית, יש להרכיב את תבנית יציקת הג'ל. גודל המכשור יהיה תלוי במספר הדגימות שברשותכם. עבור מספר רב של דגימות, נשתמש בלוח בגודל 20 על 24 סנטימטרים, ועד ארבעה מסרקים בעלי 50 שיניים.להכנת הג'ל, תזדקקו ל-agarose בעל חוזק ג'ל בינוני או גבוה, נמוך ב-EO, באפר 1X TAE, ותמיסת מלאי 10% של SDS. הכינו תמיסת agarose בריכוז 1.5% ב-1X TAE. מומלץ להכין את הג'ל עבה ככל האפשר כדי שתוכלו להעמיס את כמות הדגימה המקסימלית ולמקסם את הגילוי. חממו את התערובת במיקרוגל עד להמסה מלאה של ה-agarose.הוסיפו במהירות את תמיסתו המרוכזת של 100 XSDS ל-0.1% וסובבו את המבחנה לערבוב. אם חלק מה-agro התגבש במהלך שלב זה, המיסו אותו על פלטה חשמלית. היזהרו שלא להגיע לרתיחה.לאחר הוספת SDS, מכיוון שהתמיסה עלולה להקציף בקלות, יש למזג אותה לתבנית היציקה בעוד היא חמה. לאחר מכן, השתמשו במסרק כדי להסיר בועות שעלולות להפריע בשלב מאוחר יותר במהלך העברת הג'ל. לאחר שהג'ל התקרר לחלוטין והתמצק, הסירו בזהירות את המסרקים והניחו את הג'ל בתוך המיכל.טבול את הג'ל לחלוטין ב-XTAE עם 0.1%SDS. כעת ניתן להטעין את הדגימות. דגימות החלבון המשמשות ב-SDDH מוכנות בדומה לthose של SDS page, למעט שתי חריגות חשובות.ראשית, יש להימנע מחימום הדגימות, שכן הדבר עלול לגרום לדנטורציה של האגרגטים למנומרים של חלבון. שנית, יש להקפיד על מניעת דגרדציה של החלבון. מכיוון שתנאי הדנטורציה המשמשים כאן אינם מספיקים כדי לבטל את פעילותן של כל הפרוטאוזות, אנו ממליצים להשתמש בריכוז הגבוה לפחות פי שניים מהריכוז המומלץ של תערובת מעכבי פרוטאוזות מלאה (complete protease inhibitor cocktail).בהדגמה זו, נשתמש בליזאטים מתאי שמרים המבטאים באופן יתר חלבון מסוים הנבדק. בדרך כלל אנו משתמשים בתרביות של 2 מיליליטר שגודלו למשך לילה בלוחות של 96 בארות הזמינים מ-VWR, אך כאשר מנתחים חלבונים בריכוז נמוך, יש להשתמש בנפחי תרבית גדולים יותר.קצרו את התאים על ידי צנטריפוגציה של התרבית ב-2000 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את התאים על ידי השהיה מחדש במים וביצוע צנטריפוגציה פעם נוספת. לאחר הסיבוב השני, הסירו את הנוזל העליון והשהו את התאים בתמיסת פלטינג מתאימה. האנזימים בתמיסה יעכלו את דפנות התאים, מה שיאפשר לכם לפרק (lyse) את התאים ביעילות באמצעות נפח קטן של באפר ליזיס. הדגירו למשך 30 דקות ב-30 °C.בשלב זה, שקעו את תאי הפלסטיק העודפים ב-800 RCF למשך חמש דקות. הסירו את העלון לחלוטין והשעיקו מחדש כל משקע ב-100 µL של בופר לייס (lysis buffer). לאחר מכן, כסו את הבלוק בסרט דביק ובצעו ערבול ב-vortex במהירות גבוהה למשך שתי דקות.פעולה זו מסייעת לכל פלסטיקי הכדור לשקע את השאריות התאיות ב-4,000 RCF למשך שתי דקות. העבר בזהירות את התוצר ללוח PCR בעל 96 בארות.בדרך כלל, אנו מנתחים מאות דגימות בבת אחת במעבדה שלנו, ולכן כדי לסייע לנו בכך אנו משתמשים במערכת לטיפול בנוזלים. במידת הצורך, קבעו את ריכוז החלבון של הליזטים. לאחר מכן, הוסיפו sample buffer בריכוז 4x לדגימות כדי להכין ליזטים המכילים sample buffer בריכוז 1x, והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.כעת העמיסו את הדגימות לתוך הג'ל. במידת הצורך, שמרו מחצית מהדגימות לניתוח SDS page. כמו כן, העמיסו סמני משקל מולקולרי, כולל סמנים צבועים מראש וסמן בעל משקל מולקולרי גבוה מאוד, כגון תמצית chicken flector s.במידת הצורך, חשוב לשמור על הג'ל קריר כדי למנוע דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך, ולכן ייתכן שתרצו להריץ אותו בחדר קירור. הריצו את הג'ל במתח נמוך, פחות משלושה וולטים לסנטימטר מאורך הג'ל. הריצו את הג'ל במשך מספר שעות עד שהצבע מגיע למרחק של כסנטימטר מקצה הג'ל.מכיוון שקומילואיד אינו עובר דנטורציה בריכוז של 2% SDS בטמפרטורת החדר, הוא יישאר שלם בעוד שקומפלקסים אחרים, כולל רוב המצברים שאינם עמילואידיים, יתפרקו בנוכחות 2% SDS. לפיכך, רוב החלבונים יהיו מונומריים וינועו במהירות דרך הג'ל, בעוד שעמילואידים בעלי משקל מולקולרי גבוה העמידים ל-SDS ינועו לאט יותר.לאחר מכן, הג'ל יהיה מוכן להעברה. למרות שניתן להשתמש בשיטות העברה מגוונות, אנו מקבלים את התוצאות הטובות ביותר באמצעות העברה קפילרית. מכיוון שהעברה קפילרית יכולה להתאים לכל גודל של ג'ל, היא מעשית לניתוח של מאות דגימות.ערמה של ניירות ספיגה יבשים משמשת למשיכת התמיכה (buffer) דרך הג'ל, ובכך היא משקיעה את החלבונים על גבי ממבנה ניטרוצלולוזה הממוקם בין הניירות לג'ל. יש לחתוך פיסת ניטרוצלולוזה, כגון high bond C, extra, לממדים התואמים לאלו של הג'ל. כמו כן, יש לחתוך 20 חתיכות של נייר ספיגה מסוג GBO oh four ושמונה חתיכות של נייר ספיגה מסוג GBO oh two, באותו הגודל של הג'ל.GB 04 הוא עבה מאוד וסופג. לעומתו, GB 02 דק בהרבה ובעל מרקם עדין יותר, המבטיח מגע אחיד יותר עם הממברנה. גזרו חתיכה נוספת של GB 04 לשימוש כפתיל, כך שתהיה רחבה בכ-20 סנטימטרים מהג'ל הטבול.הניחו UL WIC ניטרוס וארבעה חתיכות GBO oh two ואחד XTBS במיכל פלסטיק והרכיבו ערימה של ניירות באופן הבא: 20 חתיכות של GBO oh four יבש. לאחר מכן ארבע חתיכות של GBO oh two יבש. לבסוף חתיכה אחת של GBO oh two שהורטבה מראש.הניחו את הניטרוצלולוז על גבי ערימה זו. שטפו את הג'ל שבתבנית היציקה קצרות במים כדי להסיר עודפי תמיסת ריצה (running buffer). לאחר מכן, התחילו להחליק בזהירות את הג'ל מהתבנית אל הערימה, תוך כדי הרטבת הממברנה ב-TBS לפי הצורך בזמן החלקת הג'ל מהתבנית.הבופר הנוסף עוזר למנוע מלכוד של בועות בתוך הג'ל. פיפטה להעברה מתאימה למטרה זו לאחר שהג'ל הועבר במלואו למערך הערימה. יש לבדוק ביסודיות אם קיימות בועות.הרימו את קצה הג'ל והחילו שוב תמיפת בופר עד להסרת כל הבועות. הניחו את שלושת חלקי ה-GBO שנותרו, לאחר שהורטבו מראש, על גבי הג'ל. הבטיחו מגע מלא בין כל השכבות על ידי גלגול חזק של פפטה מעל פני הערימה.הקיפו את ערימת ההעברה בשתי מגשים מוגבהים המכילים TBS והניחו את הפתיל הרטוב מעל הערימה, כך שכל אחד מקצות הפתיל טבול בנוזל. כסו את ערימת ההעברה המורכבת במגש פלסטיק נוסף שמעליו מונח משקולת, כגון בקבוק מים של 500 מ"ל, בתוך TBS. הפתיל יספוג באפר מהמגשים וניירות הספיגה היבשים ימשכו את הבאפר דרך הג'ל לאורך מספר שעות.פעולה זו תשקיע את החלבונים על הממברנה; יש להניח להעברה להימשך לפחות שלוש שעות או למשך הלילה. לאחר השלמת ההעברה הקפילרית, ניתן לעבד את הממברנה בשיטת western blotting סטנדרטית. כאן ניתן לראות blot טיפוסי של חלבונים שהביטוי שלהם היה יתר (over expressed) בזן של שמרים שגורם לחלבונים מסוימים לנטות ליצור עמילואיד.ניתן לראות בבירור שחלק מהמועמדים שלנו יוצרים עמילואיד או מינים עמידים ל-SDS בעלי משקל מולקולרי גבוה בצורה יעילה מאוד, כפי שמוצג כאן וכאן. אחרים, לעומת זאת, אינם יוצרים אגרגטים והם מונומריים לחלוטין, כגון אלה ואלה. בנוסף, ניתן לראות שגודל פולימרים העמילואיד משתנה בהתאם לחלבון, כפי שניתן לראות בשני הנתיבים הללו.הרגע הצגנו בפניכם שיטה פשוטה לניתוח של אגרגטים בלתי מסיסים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון עמילואידים של פריונים מועמדים. אנו מקווים שנהניתם מהצגה זו ותמצאו טכניקה זו מועילה למחקרי חלבונים אימונוגניים מסוג Amy. תודה שצפיתם בהם ובהצלחה במחקריכם.

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

סרטון זה מדגים את ההפרדה הדו-ממדית המבוססת על אלקטרופורזה של סיבי עמילואיד, ג'ל אגרוז. הטכניקה מפרידה את צברי העמילואיד הפולימורפיים בהתבסס על גודלם ההטרוגני.

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

דו"ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.

זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

מחקר זה מתאר שיטות ניסוי לאפיון ביוכימי של GFAP והמוטציות הגורמות למחלות, תוך התמקדות בהרכבת פילמנט, הצבירה ושינוי פוסט-תרגום. נבדקו בחלבוני GFAP טהור גבוה, וחשפו תובנות לגבי מנגנוני מחלת אלכסנדר שעשויים לספק מסגרת לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות ולהבנת מוטציות GFAP והפרעות נלוות.

גישות ניסיוניות לניתוח ביוכימי של חלבון חומצי סיבי גליאלי ושל וריאנטים הקשורים למחלה

למדו את שיטת SDD-AGE לזיהוי וניתוח פולימרים דמויי עמילואיד בתאים. הטכניקה מאפשרת הפרדה יעילה של צבירי חלבונים עמידים ב-SDS ומתאימה ליישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

גלה סרטונים נוספים