הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

שלום, אני רנדל הופמן, סטודנט לתואר שני במעבדת סוזן ליינוס במחלקה לביולוגיה ב-MIT. היום אני הולך להציג בפניכם חומר ניקוי למחצה אגרו רוז, אלקטרופורזה של ג'ל או גיל SDD. המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו כדי לסנן פריונים וחלבונים אלוגניים אחרים.

הגרסה שלנו לגיל SDD היא פשוטה ואמינה וניתן להתאים אותה כך שתתאים לכל מספר של דגימות. עמילואידים עמידים במיוחד בפני דנטורציה על ידי SDS, מה שמאפשר להפריד אותם מחלבונים אחרים באמצעות SDDH. עם זאת, לא ניתן להשתמש בנתונים מ-SDDH כשלעצמם כדי לאשר שמשהו הוא עמילואיד.

כדי לעשות זאת, עליך להשתמש בטכניקות אחרות. עם זאת בחשבון, הרשו לי להראות לכם. ניתן לבצע S-D-D-H-S-D-D-H באמצעות ציוד סטנדרטי לאלקטרופורזה אופקית של DNA.

ראשית, עליך להרכיב את מגש יציקת הג'ל. גודל המנגנון יהיה תלוי בכמה דגימות יש לך. עבור מספר רב של דגימות, אנו משתמשים בלוח בגודל 20 על 24 סנטימטר, ועד ארבעה מסרקים של 50 בארות.

כדי להכין את הג'ל, תזדקק לחוזק ג'ל בינוני או גבוה נמוך, EEO agros, מאגר XTAE אחד ותמיסת מלאי של 10% של SDS Make תמיסת AROS של 1.5% ו-XTAE אחד. תרצה להפוך את הג'ל לסמיך ככל האפשר כדי שתוכל לטעון את מירב הדגימה ולמקסם את הזיהוי. מחממים את התערובת במיקרוגל עד להמסה מלאה.

הוסף במהירות את מניית 100 XSDS ל-0.1% והסתחרר כדי לערבב. אם חלק מהאגרו מתמצק במהלך שלב זה, אדום, ממיסים אותו על פלטה חמה. היזהר לא לתת לזה לרתיחה.

לאחר הוספת SDS מכיוון שהתמיסה תבעבע בקלות, שפכו את התמיסה הזו למגש היציקה כשהיא עדיין חמה. לאחר מכן השתמש במסרק כדי להיפטר מכל בועות שעלולות להפריע בהמשך במהלך העברת הג'ל. לאחר שהג'ל מתקרר ומתמצק לחלוטין, הסר בזהירות את המסרקים והניח את הג'ל למיכל.

טבלו לחלוטין את הג'ל ב-XTAE אחד עם 0.1% SDS. כעת אתה מוכן לטעון את הדוגמאות שלך. דגימות החלבון המשמשות ב-SDDH מוכנות בדיוק כמו בדף SDS עם שני יוצאים מן הכלל חשובים.

ראשית, עליך להימנע מחימום הדגימות שעלולות לפגוע באגרגטים למונומרים של חלבונים. שנית, הקפד להימנע מפירוק חלבון. מכיוון שתנאי הדנטורה המשמשים כאן אינם מספיקים כדי לנטרל את כל הפרוטאזות, אנו ממליצים להשתמש לפחות בריכוז כפול מהריכוז המומלץ של קוקטייל מעכב פרוטאז מלא.

בהדגמה זו, נשתמש בליזטים מתאי שמרים שמבטאים יתר על המידה חלבון מסוים מעניין. בדרך כלל אנו משתמשים בשני מיל בן לילה. תרביות שגדלו ב-96, בלוקים זמינים מ-VWR, אך כאשר מנתחים חלבונים בשפע נמוך, יש להשתמש בכמויות תרבית גדולות יותר.

קצור את התאים על ידי צנטריפוגה של התרבית ב -2000 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרה נטנט ושטוף את התאים על ידי Resus השעיה במים וצנטריפוגה שוב לאחר הסיבוב השני, הסר את הסופרנטנט ושרף את התאים בתמיסת ציפוי רזרבית. ה-zy בתמיסה מעכל את דפנות התא, מה שיאפשר לך לחבר את התאים ביעילות ונפח קטן של מאגר ליזה. דוגרים במשך 30 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס.

גלולה את תאי הפלסטיק הרזרביים הפעם ב 800 RCF למשך חמש דקות. הסר את הסט לחלוטין והשהה מחדש כל כדור ו -100 מיקרוליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן, מכסים את הבלוק בסרט ומערבולת במהירות גבוהה למשך שתי דקות.

זה עוזר לכל הפלסטיק הכדורי להוציא את הפסולת הסלולרית ב-4,000 RCF. במשך שתי דקות. העבירו בזהירות את ה-S natin לצלחת PCR של 96 בארות.

בדרך כלל, אנו מנתחים מאות דגימות בכל פעם במעבדה שלנו, כך שכדי לסייע לנו בכך היא מערכת טיפול בנוזלים. אם תרצה, קבע את ריכוז החלבון של הליזטים. לאחר מכן, הוסף ארבעה x מאגר דגימה לדגימות כדי ליצור ליזטים המכילים מאגר דגימה אחד x דגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כעת טען את הדגימות לג'ל. אם תרצה, שמור מחצית מהדגימות לניתוח דפי SDS. כמו כן, טען סמני משקל מולקולרי, כולל סמנים מוכתמים מראש וסמן משקל מולקולרי גבוה מאוד כגון תמצית פלקטור עוף.

אם תרצו, חשוב לשמור על הג'ל קריר כדי למנוע דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך, לכן כדאי להריץ אותו בחדר הקירור. הפעל את הג'ל במתח נמוך פחות משלושה וולט לסנטימטר מאורך הג'ל. הפעל את הג'ל במשך מספר שעות עד שהדייר מגיע לכסנטימטר אחד מקצה הג'ל.

מכיוון שעמילואיד אינו עובר דנטורציה על ידי 2% SDS בטמפרטורת החדר, הוא יישאר שלם בעוד קומפלקסים אחרים, כולל רוב האגרגטים שאינם עמילואידים, מתנתקים בנוכחות 2% SDS. לפיכך, רוב החלבונים יהיו מונומריים ויעברו במהירות דרך הג'ל. בעוד שעמילואידים בעלי משקל מולקולרי גבוה עמידים ל-SDS ינדדו לאט יותר.

לאחר מכן, הג'ל יהיה מוכן להעברה. למרות שניתן להשתמש במספר שיטות העברה, אנו משיגים את התוצאות הטובות ביותר באמצעות העברה נימית. מכיוון שהעברת נימים יכולה להכיל כל גודל של ג'ל, מעשי לנתח מאות דגימות בהעברת נימים.

ערימה של ניירות ספיגה יבשים פועלת כדי למשוך חיץ דרך הג'ל ומפקידים חלבונים על קרום ניטרוצלולוז המונח בין הניירות לג'ל. תצטרך לחתוך חתיכת ניטרוצלולוז, כגון קשר גבוה C, בנוסף לאותם מידות כמו הג'ל. תצטרך גם לחתוך 20 חתיכות של GBO או ארבע ושמונה חתיכות של נייר GBO או שניים לאותו גודל כמו הג'ל.

GB oh four הוא מאוד עבה וסופג. בעוד ש-GBO oh two הוא הרבה יותר דק ובעל מרקם עדין יותר, מה שמבטיח מגע אחיד יותר עם הממברנה. חותכים חתיכה נוספת של GBO oh four שתשמש כפתיל, והופכים אותה לרחבה יותר בכ-20 סנטימטרים מהג'ל הטבול.

ה-UL WIC החנקני וארבע חתיכות של GBO oh שתיים ו-XTBS אחד במיכל פלסטיק מרכיבים ערימת ניירות כדלקמן, 20 חתיכות GBO יבש הו ארבע. ואז ארבע חתיכות GBO יבשות הו שתיים. ואז חתיכה אחת של GBO רטוב מראש הו שתיים.

הניחו את הניטרוצלולוזה על גבי הערימה הזו. שטפו את הג'ל על מגש היציקה לזמן קצר במים כדי להסיר עודפי מאגר זורם. לאחר מכן התחל בזהירות להחליק את הג'ל מהמגש אל הערימה תוך החלקת הג'ל מהמגש עם TBS לפי הצורך.

המאגר הנוסף מסייע במניעת בועות להילכד בג'ל. פיפטת ההעברה פועלת היטב למטרה זו לאחר שהג'ל הועבר לחלוטין לערימה. בדוק היטב אם יש בועות, אם יש כאלה.

הרם את קצה הג'ל והחל מחדש את המאגר עד שניתן יהיה לעבד את הבועות. שים את שלושת ה-GBO הרטובים מראש הו שתי חתיכות על גבי הג'ל. הקפידו על מגע יסודי בין כל השכבות על ידי גלגול פיפטה בחוזקה על פני החלק העליון של הערימה.

אגף את ערימת ההעברה עם שני מגשים מוגבהים המכילים TBS עטפו את הפתיל הרטוב מראש על פני הערימה, כך ששני קצות הפתיל שקועים. ב-TBS מכסים את ערימת ההעברה המורכבת במגש פלסטיק נוסף הנושא משקל נוסף כגון בקבוק מים של 500 מיל. הפתיל ישאב חיץ מהמגשים וניירות הספיגה היבשים ימשכו את המאגר דרך הג'ל במהלך מספר שעות.

זה יפקיד את החלבונים על הממברנה, יאפשר להעברה להמשיך לפחות שלוש שעות או למשך הלילה. לאחר השלמת העברת הנימים, ניתן לעבד את הממברנה על ידי כתמים מערביים סטנדרטיים. כאן אתה רואה כתם טיפוסי של חלבונים שהתבטאו יתר על המידה בזן שמרים הנוטה לחלבונים מסוימים ליצור עמילואיד.

אתם יכולים לראות בבירור שחלק מהמועמדים שלנו יוצרים עמילואיד או מינים עמידים ל-SDS במשקל מולקולרי גבוה כמו אלה המוצגים כאן וכאן. אחרים, לעומת זאת, אינם יוצרים אגרגטים והם מונומרים לחלוטין כמו אלה ואלה. נוסף על כך, אתם יכולים לראות שגודל הפולימרים העמילואידים משתנה כתלות בחלבון, שאותו אתם יכולים לראות בשני המסלולים האלה.

זה עתה הראינו לכם שיטה פשוטה לניתוח אגרגטים בלתי מסיסים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון עמילואידים של פריונים מועמדים. אנו מקווים שנהניתם לצפות במצגת שלנו ולמצוא את הטכניקה הזו שימושית ומחקרים על חלבונים אימונוגניים של איימי. תודה על הצפייה ובהצלחה במחקר שלך.