כירורגיה Stereotaxic לשרוד במכרסמים
6 באוקטובר 2008
ניטור של רמות הנוירוטרנסמיטר תאי מוח באזורים שונים של בעלי חיים באופן חופשי לנוע מציע תובנות על הקשר בין שחרור הנוירוטרנסמיטר והתנהגות. בשנת vivo microdialysis יחד עם זיהוי אלקטרוכימי מספק אנטומי מעולה ברזולוציה כימיים ומידע איך עצבית הבסיס משתנה על ידי מניפולציות תרופתי או פיזיולוגי.
שלום, אני ברנדה גייגר מהמעבדה של עמנואל פוטוס במחלקה לפרמקולוגיה וטיפול ניסויי בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טאפטס. ואני לורן פרנק, גם אני מהמעבדה. היום נדגים ניתוח סטריאוטקטי בר-הישרדות במכרסמים.
הליך זה כולל את הגדרת המכשור והכנת בעל החיים לניתוח, ולאחר מכן ביצוע הניתוח הסטריאוקסיס. נתחיל בתהליך. לפני תחילת הפעולה, הגדירו את המכשיר הסטריאוקסיס והכינו את כל החומרים הדרושים.
וודאו כי האזור והמכשירים נקיים ומעוקרים. לאחר מכן, הכינו את בעל החיים לניתוח. אדגים היום את הניתוח באמצעות חולדה מסוג Sprague Dawley בת 10 שבועות.
אנו משתמשים גם בחולדות מסוג spray dolly בנות שלושה חודשים ובעכברים מסוג C 57 black six J בני חודשיים, אשר דורשים מתאם פלטפורמה ייעודי. הרדמו את החולדה באמצעות הזרקה תוך-בטנית (IP) של תמיסה המכילה 60 milligrams per kilogram ketamine ו-10 milligrams per kilogram Xylazine. שמרו על חום גוף של בעל החיים באמצעות פד חימום המפולט על ידי תרמוסטט.
לאחר שווידאת כי בעל החיים נמצא תחת הרדמה וטמפרטורת גופו התייצבה בערך המתאים, התחל בניתוח. כדי להתחיל בניתוח, גדל את פרועת בעל החיים באמצעות תספורת חשמלית, מהאוזניים ועד למרווח שבין העיניים. מרח יוד על האזור הגזור, אך הקפד להגן על העיניים מפניו.
כעת קבעו את בעל החיים על המכשיר הסטריאוטקסי. לצורך כך, ראשית קבעו מוט אוזן אחד בתעלת האוזן, ולאחר מכן החזיקו אותו במקומו והחליקו פנימה את מוט האוזן השני, כך שהראש לא יוכל לזוז מצד לצד, אך האף יוכל לזוז למעלה ולמטה. אבטחו את הפה באמצעות התושבת הקדמית של סרגל המשתמש במכשיר הסטריאוטקסי כדי לוודא שהראש נמצא במנח אופקי.
יש לשמור על זווית של 90 מעלות בין הסרגל למרכז קרקפית בעל החיים. לאחר שבעל החיים ממוקם במקומו, בצעו חתך קדמי-אחורי (anterior posterior) בקרקפית באמצעות סכין מנתחים סטרילית. הרחיבו את החתך מהלמבדה (lambda) ועד למרווח שבין עיני בעל החיים.
השתמשו בפינצטות המוסטטיות (hemostats) כדי להסית את העור ולשמור על החתך פתוח. ייבשו את פני הגולגולת החשופים בעזרת מספר מקלוני צמר גפן. לאחר מכן, הניחו את הקנולה המנחה על המעמד שלה.
לאחר מכן, אתרו את נקודת bgma על הגולגולת ומיקמו את קנולת המדריך ישירות מעל מיקום זה. רשמו את הקואורדינטות הקדמיות (anterior), האחוריות (posterior) והצדדיות (lateral) ביחס ל-bgma. מצאו את הקואורדינטות המדויקות הדרושות להצבת הגשוש (probe).
בעזרת האטלס הסטריאוטקטי, מקמו את קנולת ההובלה לקואורדינטות הנכונות על ידי הוספה או הפחתה מה-bgma. הורידו את קנולת ההובלה עד שתיגע בגולגולת, ואז רשמו קואורדינטה ונטראלית זו. סמנו בסימון עיפרון מיקום זה על הגולגולת.
כאן תבצעו את הקידוח. כדי להתחיל בקידוח, הסירו את קנולת המנחה ועקרו את מקדח הקידוח.
לאחר מכן, קדחו חור בקוטר 0.5 מילימטר בסימון העיפרון עד להגעה לצדו השני של הגולגולת. בדקו באמצעות קנולה מדריך (guide cannula) אם היא עוברת דרך החור ללא מגע עם הדפנות. המשיכו לקדוח ולבדוק עד שהקנולה תוכל לעבור דרך החור במסלול ישר.
יש להיזהר לא לחדור דרך קרומי העטיפה של המוח (meninges) או דרך כלי דם. לאחר ביצוע החור, השתמשו במחט סטרילית כדי לנקב בעדינות את הקרומים על מנת לאפשר הכנסה חופשית של קנולת ההנחיה. לאחר מכן, השתמשו במקדח ידני כדי ליצור שישה חורים עבור ברגי הגולגולת.
שניים קדמיים, שניים צדיים ושניים אחוריים לחור הקנולה. סטריליזציה של שישה ברגי עצם מנירוסטה והחדרתם לגולגולת עד שהם מעוגנים היטב. לאחר השחלת הברגים, נקה את קנולת ההנחיה באתנול והמתן לייבושה, ולאחר מכן התקן והורד באיטיות את ההנחיה לקואורדינטה הוונטרלית המתאימה.
הקנולה מורדת מעלה ומטה כדי למנוע נזק למוח. ודאו שהדפנות אינן נוגעות ושהיא נכנסת בצורה אנכית מוחלטת. לאחר מכן, הסירו את התפסנים (hemostats).
ערבבו כמות דקה של דבק שיניים נוזלי וכסו בעזרת שפכטל את קנולת המדריך, את הברגים ואת שאר הגולגולת בשכבה דקה. לאחר מכן, מקמו את בורג העיגון מדיאלית ומאחורי ברגי הגולגולת האחוריים והחזיקו אותו במקומו בעזרת פינצטה. הכינו מנה נוספת של דבק, הפעם בעובי רב יותר, וכסו לחלוטין את הקנולה ואת ברגי העיגון בכמות דבק מספקת כדי להבטיח את קיבעונם כאשר הדבק יסמיך.
אך לפני שהחומר מתקשה, הפרד את העור ממכסה המלט ועדן את מכסה המלט בעזרת השפכטול כדי לוודא שהוא חלק מכל הצדדים ואינו מגרה את העור. מאוחר יותר, מוסיפים מלט נוסף כדי לחזק את הקנולה המנחה ולגשר בינה לבין שאר מתקן הראש. לאחר שהמלט הדנטלי התייבש לחלוטין, הוצא את החיה מהמכשיר.
לאחר מכן, מרחו את האנטיביוטיקה המקומית bacitracin מסביב לכל כיסוי המלט. לאחר מכן, הניחו זריקה תוך-שרירית של penicillin, ואחריה זריקה תת-עורית של saline. החזירו את בעל החיים לכלובו ועקבו אחריו עד שיחזור להיות בהכרה.
לאחר מכן, החזירה את בעל החיים לכלובו להחלמה. לאחר ההחלמה, עקוב אחר בעל החיים מדי יום עד לסיום הניסוי כדי לזהות סימני זיהום ולהעריך כאב ומצוקה.
יש להחדיר 0.1 עד 0.5 מיליגרם לקילוגרם של buprenorphine תת-עורי פעמיים ביום, לפי הצורך, אם נראה כי בעל החיים סובל מכאב. בנוסף, יש להעניק טיפול מקומי ב-bacitracin וטיפול סיסטמי ב-penicillin. במקרה של זיהומים לאחר הניתוח, או אם אחד מהסימנים נמשך יותר מ-12 שעות לאחר הניתוח, יש להביא את בעל החיים להריגה הומנית.
הצגנו בפניכם כיצד לבצע ניתוח סטריאוטקטי שורד במכרסמים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על סביבה סטרילית במהלך הניתוח ולעקוב מקרוב אחר בעל החיים לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום, וכן להניח את בעל החיים על פסי התמיכה בצורה נכונה, כדי שמיקום קנולת המדריך יהיה מדויק.
זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בניטור רמות של מוליכים עצביים חוץ-תאיים בבעלי חיים הנעים באופן חופשי, תוך קישור שחרור המוליכים העצביים להתנהגות. הוא מדגיש את השימוש במיקרודיאליזה in vivo ובבלייה אלקטרוכימית להשגת רזולוציה אנטומית וכימית משופרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- מדעי ההתנהגות
רקע
- הבנת הדינמיקה של מוליכים עצביים היא חיונית לקשירת הפעילות המוחית להתנהגות.
- מיקרודיאליזה מאפשרת איסוף דגימות מאזורים ספציפיים במוח.
- סריקה אלקטרוכימית מספקת ניתוח בזמן אמת של רמות המוליכים העצביים.
- מניפולציות פרמקולוגיות ופיזיולוגיות יכולות לשנות את התמסורת העצבית הבסיסית.
מטרת המחקר
- להדגמת המתודולוגיה לניטור רמות של מוליכים עצביים in vivo.
- לבחינת הקשר בין שחרור מוליכים עצביים לבין תוצאות התנהגותיות.
- לספק תובנות לגבי ההשפעות של מניפולציות שונות על התמסורת העצבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקת מיקרודיאליזה in vivo.
- שיטות גילוי אלקטרוכימיות.
- הסדרה ניסויית לניטור בעלי חיים הנעים בחופשיות.
- התערבויות פרמקולוגיות להערכת שינויים בתמסורת עצבית.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של רמות מוליכים עצביים באזורי מוח מובחנים.
- הדגמה של שינויים בתמסורת עצבית כתוצאה ממניפולציות פרמקולוגיות.
- ביסוס קשר בין שחרור מוליכים עצביים לבין התנהגויות שנצפו.
- אספקת מסגרת למחקרים עתידיים על דינמיקת תמסורת עצבית.
מסקנות
- מיקרודיאליזה in vivo היא כלי בעל ערך לחקר דינמיקת מוליכים עצביים.
- גילוי אלקטרוכימי משפר את ההבנה של תהליכי העברת אותות עצביים בנבדקים חיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון תוצאות התנהגותיות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח סטריאוטקסי שרידותי במכרסמים מאפשר השתלה מדויקת של קנולות מנחות וגששי מיקרודיאליזה למדידה in vivo של רמות מוליכים עצביים חוץ-תאיים. יכולת זו היא קריטית לבחינת פרמקודינמיקה של מערכת העצבים המרכזית (CNS), לתמיכה בתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים של היפותזות מכניסטיות בגילוי תרופות למחלות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות. גישה זו מספקת רזולוציה אנטומית וכימית גבוהה, המאפשרת רציפות תרגומית משלב הגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של דינמיקת מוליכים עצביים בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים או פיזיולוגיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי קישור פעולת התרכובת לשינויים נוירוכימיים באזורי מוח ספציפיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי מתן אפשרות להחדרת תרופה לאתר ספציפי והערכת התגובה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מודלים מאושרים של מכרסמים עבור בדיקות נוירוכימיות כמותיות באמצעות מיקרודיאליזה ו-HPLC-EC.
- מאפשר דגימה רב-שחזורה וסטנדרטית של מוליכים עצביים חוץ-תאיים לצורך הערכת תרכובות בהמשך התהליך.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מטרות ומסלולים מרובים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מדדים נוירוכימיים in vivo עם נקודות קצה רלוונטיות למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מספק רצף ממחקרים מכניסטיים בשלב הגילוי למודלים פרה-קליניים של יעילות ובטיחות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון המבוסס על נתונים נוירוכימיים כמותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו נטמעת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת בחינה מבוססת-השערות של מטרות ומסלולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) במודלים של חיות חיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים באמצעות מדידה נוירוכימית ישירה.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות ותיקוף של בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מספקת נתונים נוירוכימיים ברזולוציה גבוהה להשוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים מכניסטיים לבין התאמה של סמנים ביולוגיים פרה-קליניים ורלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-שימושית למחקרי פרמקולוגיה של ה-CNS במספר תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה כירורגיים ואנליטיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נקודות קצה נוירוכימיות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של נכסי CNS מותאמי סיכונים על בסיס מעורבות תפקודית של המטרה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים סטריאוטקסיים במכרסמים ובטכניקות של דגימה נוירוכימית.
- נדרש גישה לציוד ייעודי כגון מסגרות סטריאוטקסיות, פרוbes של מיקרודיאליזה ומערכות HPLC-EC.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדת של פרוטוקולים כירורגיים ואנליטיים בין צוותים שונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור זני מכרסמים שונים או אזורי מוח רלוונטיים.
- רזולוציית הזמן מוגבלת על ידי מרווחי הדגימה של המיקרודיאליזה, בדרך כלל 20–30 דקות לדגימה.
