הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ'יק מוקדם
27 באוקטובר 2008
סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.
הליך זה מתחיל בטיפול בקיבוע, מתנול ופרוטאינאז K בעוברים, ולאחר מכן דגירה של לילה עם בדיקה אחת לחפור פנימה או לחפור ובדיקה. שני עוברי פלואורסצאין איזותיוציאנט או ZI מודגרים עם נוגדן חפירה בעקבות תגובת צבע עם פוספטאז אלקליין חפירה. הפעילות מושבתת והעוברים מודגרים.
עם FSE מבוצעת תגובת צבע נוגדנים עם Zi והעוברים מקובעים. היי, אני דלפין מהמעבדה של ריק פינל במרכז לרפואה סביבתית וגנומית באוניברסיטת טקסס ביוסטון. היום נראה לך נוהל לביצוע הכלאה במקום שני צבעוניים בעובר הגוזל.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לנתח את ההשפעות של תרופות אנטי-אפילפטיות על גנים בקיבה ובעצבים. אז בואו נתחיל כדי לבצע הכלאה באתרה על עוברי אפרוחים, פתח תחילה ביצה על ידי הקשה על הקליפה בעזרת מלקחיים והסרת חתיכות מהקליפה. מסירים את האלבומין העבה בעזרת מלקחיים ומטים את שק החלמון בעזרת מלקחיים גסים כך שהעובר פונה כלפי מעלה בעזרת מספריים עדינים.
חותכים ריבוע שק חלמון סביב העובר. מוציאים את העובר מהחלמון בעזרת כף ומניחים בכלי המכיל קרח. קר PBS תחת מיקרוסקופ דיסקציה הסר בזהירות את הממברנות והעביר את העובר לכלי טרי המכיל קרח.
PBS קר מחזיק את העובר עם מלקחיים ושואב את ה-PBS במכסה האדים. החלף את זה ב-4% אלדהיד פרפורמי ב-PBS ואפשר לעובר להתייצב בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר קיבוע העוברים, יש לשאוב את תמיסת הקיבוע ולהשליך כראוי כפסולת כימית.
מלאו את המנה ב-PBS קר כקרח בעזרת מחט מיקרו נימית קהה או סכין מיקרו-דיסקציה מחוררים את הראש ואת חללי הלב. כדי למנוע לכידה של בדיקה. הנח את העוברים ב-DEP CPBS המכיל 0.1% בין 20, ולאחר מכן יבש את העוברים בשטיפה מסדרת מתנול למשך 10 דקות כל אחד ב-25%50%75% ו-100% מתנול ב-PBT.
חזור על שטיפת 100% מתנול. כעת ניתן לאחסן את העוברים במינוס 20 מעלות צלזיוס במתנול. בבקבוקוני נצנוץ זכוכית של 20 מיליליטר.
כדי לבצע את הכלאת האינסטטוס, יהיה צורך תחילה להחזיר את העוברים. לשם כך יש לשטוף את העוברים 10 דקות כל אחד ב-75%50% ו-25% מתנול ב-PBT. לבסוף, שטפו פעמיים במשך 10 דקות כל אחת.
ב-PBT, הסר את תמיסת ה-PBT מהבקבוקונים והחלף בתמיסת חלבון K של חמישה מיקרוגרם למיליליטר. שלושה מיליליטר לבקבוקון. גלגלתי בעדינות את הבקבוקון כדי לוודא שכל התכולה חשופה לתמיסת פרוטאינאז K.
השאירו בתמיסת פרוטאינאז K למשך דקה עד חמש דקות, תלוי בשלב העובר. בינתיים, הכינו תמיסת קיבוע קרה כקרח באמצעות פיפטת עבר נטולת RNA, הסירו את תמיסת הפרוטאינאז K והוסיפו שני מיליליטר מתמיסת הקיבוע. מניחים מיד את הבקבוקון על קרח למשך 20 דקות בדיוק.
לאחר מכן, שטפו את העוברים בטמפרטורת החדר על מוטטור. בצע שתי שטיפות של 10 דקות ב-PBT ולאחר מכן שטיפה אחת של 10 דקות במאגר הכלאה של 50% ב-PBT. לאחר מכן שטפו פעם אחת ב-100% מאגר הכלאה דגרו על העוברים בשני מיליליטר של מאגר הכלאה למשך ארבע עד חמש שעות.
ב-65 מעלות צלזיוס. העוברים מוכנים כעת להכלאה עם חפירת בדיקות וסינתזת בדיקה מצומדת מתוארת בחומר התומך. הגשושית הצפויה לתת אות חזק צריכה להיות מסונתזת עם FSE המכיל נוקלאוטידים, ואילו את הבדיקות החלשות יותר יש לסנתז עם חפירה המכילה נוקלאוטידים.
אזהרה מוקדמת של בדיקות במאגר הכלאה באמצעות בקבוקון של שני מיליליטר. הסר את מאגר ההכלאה מהעוברים והחלף מיד את מאגר ההכלאה בתמיסת הבדיקה. חשוב לא לתת לעוברים להתייבש לדגור במשך 16 שעות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
לאחר שלב הכלאת הבדיקה, החלף את תמיסת הבדיקה במאגר הכלאה. בצע שתי שטיפות של 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטוף במשך 15 דקות בתערובת אחד לאחד של הכלאה, חיץ וחומצה מאלית שוב ב-65 מעלות צלזיוס. לאחר שלב זה, אינך צריך עוד להשתמש בתנאים נטולי RNA.
עכשיו אתה מוכן לבצע את תגובת צבע החפירה ואחריה תגובת הצבע של פיץ. כדי לבצע תחילה את הכלאת הנוגדנים ותגובת הצבע, שטפו את העוברים פעמיים למשך 20 דקות כל אחד במאגר חומצה מאלית. לאחר מכן שטפו במשך שעה אחת ב-2% VBR במאגר חומצה מאלית.
לבסוף, צפה במשך חמש שעות בחסימת חיץ לדלל נוגדן חפירה אחד עד 2000 במאגר חוסם ודגירה על העוברים בתמיסה זו על מוטטור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בצע שלוש שטיפות של 10 דקות במאגר חומצה מאלית ולאחר מכן שלוש שטיפות של שעה במאגר חומצה מאלית. יש לשטוף פעמיים למשך 20 דקות כל אחת.
ב- NTMT הוסף 200 מיקרוליטר מצע N-B-T-B-C-I-P ל -10 מיליליטר. NTMT מוציא מיד NTMT מהבקבוקון עם העובר ומחליף במיליליטר אחד עד שניים. מקום מאגר N-B-T-B-C-I-P בחושך.
עקוב אחר תגובת הצבע לאחר 20 דקות ובמרווחים של 20 דקות לאחר מכן. כאשר הצבע הכחול התפתח כראוי, שטפו את העוברים ב-PBS למשך 10 דקות. לאחר מכן החלף את ה-PBS ב-4% אלדהיד פרפורמים ב-PBS.
יש לתקן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את העובר לשטיפת בקבוקון חדשה ב-PBT פעמיים למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן שתי שטיפות של 10 דקות במאגר חומצה מאלית. דגרו את העוברים במאגר חומצה מאלית למשך 30 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
עכשיו הגיע הזמן לבצע את הדגירה השנייה של הנוגדנים ותגובת הצבע. על מנת לזהות את הבדיקה השנייה שלנו, שטפו את העוברים פעמיים למשך 10 דקות כל אחד במאגר חומצה מאלית. שעה אחת ב-2% BBR במאגר חומצה מאלית.
ואז חמש שעות בחסימה מדללים את הפוספטאז האלקליין בשילוב נוגדן נגד FTSE אחד עד 500 במאגר חוסם ודוגרים על העוברים בתמיסה זו בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר בוצעו שלוש שטיפות של 10 דקות במאגר חומצה מאלית ואחריהם שלוש שטיפות של שעה במאגר חומצה מאלית. לאחר מכן, יש לשטוף פעמיים למשך 20 דקות כל אחת.
ב-Tris HCL, הכינו חמישה מיליליטר של תמיסת עבודה וקטורית אדומה ב-tris HCL על פי פרוטוקול היצרן. הסר מיד את ה-triss HCL מהבקבוקון והחלף במאגר האדום הווקטורי. הניחו את הבקבוקונים בחושך.
עקוב אחר תגובת הצבע לאחר 30 דקות ובמרווחים של 30 דקות לאחר מכן, לאחר התפתחות הצבע האדום, העבר את העוברים ל-PBS. אתה סוף סוף מוכן לתקן ולעבד את העוברים. מעבירים אותם לכלי קיבוע המכיל 4% פרפורם, אלדהיד ומקבעים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס.
יש לכבס פעמיים ב-PBS 10 דקות לכל כביסה כדי לעבד לצילום. העבירו את העוברים ל-20% גליצרול ב-PBS. זה יהפוך את העוברים לשקופים לעיבוד לחיתוך שעווה.
מעבירים את העוברים בחזרה ל-PBS, שוטפים פעמיים למשך 10 דקות כל אחד, מתייבשים בסדרת מתנול למשך 10 דקות כל אחד, מחליפים את המתנול בפרופנול ודוגרים למשך שלוש דקות. הסר את הפרופנול והחלף ב-1 2 3 4 טטרה הידרו נאפ פילין למשך 20 דקות, ואחריו היסטו שקוף, שתי שטיפות למשך שעה כל אחת. החליפו בתערובת אחד לאחד של היסטו שקוף ושעווה ודגרו בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה.
החלף תמיסה זו בשעווה ותהליך להיסטולוגיה. עובר זה מסומן עם חמצן דיגו בגרביים, שתי בדיקות בכחול ודלתא פיצי בדיקה אחת המופיעה באדום. תגובת הצבע הראשונה חושפת את דפוס ההבעה של גרביים. שניים.
סמן לצלחת העצבית שפותח במעבדה של תג רמת ד"ר רובין sox שני תאים חיוביים נראים כחולים בעקבות תגובה עם N-B-T-B-C-I-P. לאחר מכן אותו עובר מעובד לתגובת הצבע השנייה, החושפת את דפוס הביטוי של דלתא אחת. סמן לצלחת הסגמנטלית שפותח במעבדתו של ד"ר דומינגו אנריקה דלתא תאים חיוביים אחד נראים אדומים, בעקבות תגובה עם וקטור אדום.
עובר זה מסומן ב-digo ב-PAC 6 בדיקה בכחול ו-fitzy SHH באדום. תגובת הצבע הראשונה חושפת את דפוס הביטוי של PAC 6, סמן לקפלים העצביים ולסומיטים המתפתחים שפותח במעבדתו של ד"ר מרטין גולדינג פאק. שישה תאים חיוביים נראים כחולים בעקבות תגובה עם N-B-T-B-C-I-P.
תגובת הצבע השנייה חושפת את דפוס הביטוי של סמן SHHA עבור הנור וקו האמצע הגחוני של הצינור העצבי שפותח במעבדתו של ד"ר קליף טבן. תאים חיוביים ל-SHH נראים אדומים, לאחר תגובה עם אדום וקטורי. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע הכלאה של צבע ו- c ברי העוף.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתמיסות שטופלו בעומק C כמו גם בחיטוי, pfas ו-vi סטרילי. על מנת למזער את המגע עם RNAs הוא בשלבים 3 עד 5. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
הסרטון הזה מדגים היברידציה in situ בשני צבעים, טכניקה להדמיית דפוסי הביטוי המרחביים והזמניים של שני גנים שונים בעובר תרנגולת צעיר. ההליך כולל קיבוע, טיפול במתנול ופרוטאינאז K, ודגירה עם בדיקות ספציפיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנטי
רקע
- היברידציה in situ בשני צבעים מאפשרת הדמיית ביטוי גנים בעובר.
- שיטה זו הוצגה במקור על ידי חוקרים ידועים בתחום.
- הבנת דפוסי ביטוי גנים חיונית למחקרים בביולוגיה התפתחותית.
- עוברי תרנגולת משמשים כאורגניזם מודל למחקרים כאלה.
מטרת המחקר
- להדמיית דפוסי הביטוי של שני גנים בו זמנית.
- לספק מתודולוגיה מפורטת לחוקרים בתחום.
- לשפר את ההבנה של אינטראקציות גנים במהלך התפתחות עוברית.
שיטות ששימשו
- קיבוע של עוברי תרנגולת.
- טיפול במתנול ופרוטאינאז K.
- דגירה עם בדיקות מסומנות בדיגוקסיגנין.
- תגובת צבע עם נוגדנים להדמיה.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של דפוסי ביטוי גנים בעובר.
- הדגמה של יעילות השיטה בשני צבעים.
- הבחנה ברורה של מיקומים של ביטוי גנים.
- יישומים פוטנציאליים במחקר ביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- ההיברידציה in situ בשני צבעים היא טכניקה בעלת ערך.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים שונים בתחום ביטוי גנים.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את יישומייה במחקרים התפתחותיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous visualization of two gene expression patterns in chick embryos, supporting mechanistic de-risking in early target validation. By providing spatial and temporal resolution of gene co-expression, it enhances predictive confidence in pathway analysis during discovery biology. The approach is particularly relevant for neurodevelopmental and cardiovascular target interrogation where embryonic models inform translational relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing co-expression patterns of signaling molecules and transcription factors in developing tissues.
- Operational Value: Enables functional target validation through spatial mapping of gene activity in neural tube, somite, and heart primordia.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic relationships between genes involved in developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Quantitative Output: Generates spatially resolved, colorimetric readouts enabling comparison of gene expression across experimental conditions.
- Reproducibility: Standardized fixation and hybridization steps support assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects embryonic gene expression to postnatal pathophysiology in neurodevelopmental and cardiac disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by validating target expression in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement in developing tissues prior to mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, supporting hypothesis testing and pathway clarification before lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking by visualizing gene co-expression in developing embryos, clarifying functional relationships between targets.
- Screening: Generates spatially resolved expression data that can inform assay design for compound screening in relevant tissues.
- Analytics: Produces dual-colorimetric readouts allowing quantitative comparison of gene expression patterns under different conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by confirming expression of developmental markers in tissues relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating multiple gene targets across developmental timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing spatial relationships between co-expressed genes in developing tissues.
- Operational Value: Standardized protocol ensures reproducibility across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Improves target selection confidence, reducing late-stage failure due to incorrect mechanistic assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated expression in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological dissection and molecular hybridization techniques.
- Dependent on access to dissection microscopes, hybridization ovens, and colorimetric detection systems.
- Necessitates standardization of probe synthesis and antibody titration across users.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of fixation and permeabilization steps.
- Practical limitations include embryo availability, stage-specific permeability, and signal multiplexing constraints beyond two colors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:49
Introduction
1:16
Fixing and Dehydrating the Embryos
3:28
Prehybridzation
5:15
Hybridizing Embryos with DIG- and FITC- Coupled Probes
6:41
DIG Antibody Incubation and Color Reaction
9:40
FITC Antibody Incubation and Color Reaction
11:52
Fixation and Processing
13:34
Results
15:08
Conclusion
