Reaggregate תרבויות קורנית
August 28th, 2008
בסרטון זה הכנת 2-dGuo שטופלו reaggregate תרבויות התימוס מודגם.
היי, אני אנדריאה ווייט ואני מהמעבדה של גרהם אנדרסון ואריק ג'נקינסון במרכז MRC לוויסות חיסוני באוניברסיטת ברמינגהם. היום אני מציג פרוטוקול להפקת תרביות איברים תימיים מצטברים מחדש, שניתן להשתמש בו כדי לחקור אינטראקציות תאיות מורכבות המתרחשות במהלך התמיינות תאי T. לפני תחילת הליך זה, אונות תימיות עובריות בודדו וטופלו כדי להסיר את כל הלימפוציטים.
ניתן לראות זאת בסרטון נפרד. לאחר מכן מפרקים את האונות החייזריות כדי לייצר תכשיר תאי סטרומל. ולבסוף, התאים מצטברים ליצירת תרבית איברים fmic מצטברת מחדש.
בואו נתחיל. לאחר חמישה עד שבעה ימים בתרבית, ה-LO אמור להיות מוכן לפירוק עבור תכשירי תאי רדוד לטבול את המסננים של 0.8 מיקרומטר בצלחת פטרי המכילה RPMI 1640 בתוספת 10% FCS באמצעות מלקחיים דוחפים בעדינות את כל שיפועי הסיבים שאינם צפים. השתמש במיל אחד לכל חיית מחמד כדי להעביר את האונות לצינור אורף של 1.5 מייל
אנו ממליצים לא יותר מ-50 אונות לכל צינור אורף. אפשר לאונות להתיישב בתחתית הצינור תחת כוח משיכה של יחידת הכבידה והסר את המדיום. שטפו את האונות עם מיל PBS אחד ואז הניחו לאונות לשקוע שוב לתחתית.
חזור על כך בסך הכל שלוש כביסות PBS, הסר את שטיפת ה-PBS האחרונה והוסף 600 מיקרוליטר של 0.25% נסיעות בתמיסה. מניחים את צינור העין באינקובטור של 37 מעלות למשך 25 דקות. יש לערבב בעדינות את האונות באמצעות קצה כחול של מיל אחד על פרפט למשך 10 שניות, ולאחר מכן להחזיר לחממה לאחר 20 דקות, לזרוק את האונות למעלה ולמטה כדי לפרק אותן לחלוטין.
זה אמור לקחת בערך 30 שניות כדי להשיג תרחיף תא בודד, הוסף 400 מיקרוליטר קר כקרח, RPMI 1640 בתוספת 10% FCS כדי לנטרל את כדור הטריפסין imp התאים על ידי צנטריפוגה באלף סל"ד, 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את ה-sup natant והשהה מחדש את הגלולה במיל אחד. RPMI 1640 בתוספת 10% FCS אם תרצה. ספירת תאים.
בדרך כלל היינו מצפים לכ-50,000 תאים לאונה דיוקסזין, החל מ-E 15 סיבי. כעת אנו מוכנים ליצור את תרביות הקורגן המצטברות בצינור אורף של קילומטר וחצי. תאי סטרומה עדינים מעורבים וטריים.
יחד עם CD שנבחר מראש ארבעה CD חיובי שמונה פיברוציטים חיוביים. אנו ממליצים על יחס של אחד לאחד של תאי סטרומה לפיברוציטים. מספר התאים שתשתמשו בהם יהיה תלוי במספר התאים הזמינים ובניסויים שיש לבצע.
אנו ממליצים על לפחות מאה אלף תאים בסך הכל ולא יותר מ -1.5 מיליון תאים. אתה רוצה שאגרגטים V יהיו גדולים מספיק כדי שיהיו ניתנים לשחזור, אבל לא כל כך גדולים שהמרכז ימות תאי גלולה על ידי צנטריפוגה באלף סל"ד למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, הרכיבו בזהירות את מסנן תרבית האיברים.
הסר את כל ה-SUP natin בשלב עם P 200 לכל חיית מחמד. כדור תא המערבולת למשך 10 שניות ליצירת slurry. הנפח צריך להיות סביב אחד עד שניים מיקרוליטר הפה.
לטפו את התרחיץ לחיית מחמד מצויירת דק, תוך שמירה על השעיית התאים בקצה חיית המחמד. תחת המיקרוסקופ המנתח שלנו, העבר בזהירות PET את תמיסת התאים למרכז מסנן של 0.8 מיקרומטר. באופן אידיאלי, יש למקם תאים כטיפה עומדת במעגל בקוטר של מילימטר עד שניים.
אם התרחיץ מתחיל להתפשט, אפשר לנוזל בתרחיץ להתנקז דרך הקופה לפני הפקדת התאים הנותרים. מניחים את המנה בקופסת כריכים מפלסטיק ואוטמים. באשר לתרביות איברי התימוס, ומניחים קופסה באינקובטור, אנו צוברים תרביות למבנים שלמים תוך 18 שעות מהתרבית.
לאחר ארבעה עד חמישה ימים של תרבית, הם ייצרו גם CD 4 חיובי שמונה שלילי וגם CD 4 שלילי שמונה תת-קבוצות ציטים בוגרים חיוביים. התחלה עם 50 אונות שטופלו בדיוקסזין אמורה לתת מספיק תאי סטרומה כדי להכין שלוש עד חמש תרביות מצטברות מחדש. תרביות אלו מופיעות בדרך כלל כתלוליות קוהרנטיות של תאים שניתן לדחוף אותם מהמסננים באמצעות מלקחיים מבלי לשבש אותם.
זה עתה תיארנו את השיטה שבה ניתן לחקור ברירה חיובית על ידי תאי אפיתל F. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור ברירה שלילית בתיווך תאים דנדריטיים. לבסוף, על ידי שימוש בפיברוציטים טרנסגניים TCR או תאי סטרומה חסרים בדרגה אחת או תאי סטרומה חסרים בדרגה שתיים.
מערכת זו מאפשרת חקירות נפרדות של בחירת תאי T חיוביים CD 4 או CD 8 חיוביים. תודה שהתכווננת.
סקירה
סרטון זה מדגים את הכנת תרבויות תימוס מחדש שטופלו ב-2-dGuo. תרבויות אלו חיוניות לחקר התמיינות תאי T ואינטראקציות תאיות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה תאית
- תרבויות איברים של התימוס
רקע
- תרבויות איברים של התימוס משמשות לחקר התפתחות תאי T.
- תרבויות מחודשות מאפשרות בדיקה של אינטראקציות תאיות.
- טיפול ב-2-dGuo משמש להכנת אונות התימוס.
- הבנת התמיינות תאי T חיונית למחקר אימונולוגי.
מטרת המחקר
- להפיק תרבויות איברים של התימוס מחודשות.
- לחקור תהליכי התמיינות תאי T.
- לחקור אינטראקציות תאיות בסביבה מבוקרת.
שיטות ששימשו
- בידוד וטיפול באונות התימוס העובריות.
- פירוק ליצירת תכשירים של תאים סטרומליים.
- צבירה של תאים ליצירת תרבויות מחודשות.
- דגירה ותצפית על התפתחות התרבות.
תוצאות עיקריות
- תרבויות מחודשות יוצרות מבנים שלמים תוך 18 שעות.
- נוצרים תת-קבוצות של תאי T חיוביים ל-CD4 ו-CD8.
- השיטה מאפשרת מחקר של בחירה חיובית ושלילה.
- שימוש בפיברוציטים טרנסגניים של TCR לחקירות נוספות.
מסקנות
- הפרוטוקול מדגים ביעילות את התמיינות תאי T.
- תרבויות מחודשות מספקות כלי חשוב למחקרים אימונולוגיים.
- מחקר נוסף יכול להשתמש בשיטה זו למחקרים שונים על בחירת תאי T.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of stromal compartment roles in T-cell development and selection.
- Enables functional validation of candidate targets involved in thymic microenvironment signaling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects of specific cell types or genetic backgrounds.
- Provides a platform for hypothesis-driven manipulation of thymic selection processes.
Screening & Assay Development
- Generates reproducible three-dimensional cultures for standardized functional assays.
- Allows quantitative assessment of T-cell subset differentiation under defined conditions.
- Supports assay development for evaluating modulators of thymic selection or stromal function.
- Enables scalable preparation of organotypic cultures for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant thymic microenvironments for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanisms of T-cell selection.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo immune development processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal-hematopoietic interactions and pathway elucidation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organotypic cultures for functional evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of T-cell subset generation and selection outcomes.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant immune development and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse genetic backgrounds and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes three-dimensional culture preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional roles of thymic compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to cell separation, counting, and organ culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell ratios and culture conditions for reproducibility.
- Adaptable to various genetic models, including transgenic or MHC-deficient backgrounds.
- Limited by the scalability of primary tissue sourcing and manual aggregation steps.
