Name: Reaggregate תרבויות קורנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: למדו הכנת תרבויות קורנית מורכבות מחדש לחקר הבדלת תאי T ואינטראקציות תאיות. שיטה זו מאפשרת ייצור תת-אוכלוסיות CD4+ ו-CD8+ ומחקר בחירה חיובית ושלילית במערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

לקבלת מידע נוסף על הכנת reggregate תרבויות התימוס בקר <a href="http://www.springerprotocols.com/">הפרוטוקולים שפרינגר</a> .

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate תרבויות קורנית

Reaggregate Thymus Cultures

ב, CD4 התימוס בשלה 8 + thymocytes להביע מחדש באופן אקראי T-cell receptor α ו-b-שרשרת אירועים גנים עוברים סלקציה חיובית ושלילית מבוסס על היכולת שלהם לזהות histocompatibility self-peptide/major מורכבות (MHC) מולקולות לידי ביטוי הרתי סטרומה תאים. בניתוח vivo התפקיד של תאים סטרומה הרתי במהלך בחירת intrathymic קשה בגלל המורכבות הסלולר של microenvironment הרתי ב היציב התימוס מבוגר, ועל ידי חוסר מיקוד אסטרטגיות מתאימות כדי לתפעל ביטוי גנים בפרט תאים סטרומה הרתי. הראינו כי microenvironment הרתי ניתן להשפיע בקלות באמצעות reaggregate תרבויות איבר התימוס, המאפשרים הכנת תלת ממדי אונות התימוס מתאי סטרומה ו הלימפה מוגדר במבחנה. למרות אחרות במערכות חוץ גופית תמיכה כמה היבטים של התפתחות תא T, reaggregate תרבות איבר התימוס נשאר רק במערכת במבחנה מסוגל לתמוך בכיתה MHC יעיל I ו-II בתיווך אירועי מבחר thymocyte, ולכן יכול לשמש ככלי יעיל ללמוד הסדרת תאית ומולקולרית של בחירה חיוביות ושליליות של התימוס.

בסרטון זה הכנת 2-dGuo שטופלו reaggregate תרבויות התימוס מודגם.

Reaggregate תרבויות קורנית

תאים סטרומליים בתוך רקמות לימפואידיות מאורגנים למבנים תלת-ממדיים המספקים פיגום אשר סניב כי הוא שולט על הנדידה ו...

שלום, אני אנדריאה וייט מהמעבדה של גרהאם אנדרסון ואריק ג'נקינסון במרכז MRC לבקרת מערכת החיסון באוניברסיטת בירמינגהם. היום אציג פרוטוקול להפקת תרביות איברים תימיים מרו-אגרגטיים (re-aggregate), שניתן להשתמש בהן כדי לחקור אינטראקציות תאיות מורכבות המתרחשות במהלך התמיינות תאי T. לפני תחילת הליך זה, בודדו אונויות תימוס עובריות ועובדו להסרת כל הלימפוציטים.ניתן לראות זאת בסרטון נפרד. לאחר מכן, האונות ה-alienoid מופרדות כדי להפיק תכשיר של תאי סטרומה. ולבסוף, התאים מאוגדים כדי ליצור תרבית איברים של re-aggregate fmic.נתחיל בתהליך. לאחר חמישה עד שבעה ימי תרבית, ה-LO אמור להיות מוכן לפירוק לצורך הכנת תאי shoal; טבול את המסננים של 0.8 µm בצלחת פטרי המכילה RPMI 1640 בתוספת 10% FCS. באמצעות פינצטה, דחף בעדינות כל רסיסי סיב שאינם צפים. השתמש בפיפט של 1 ml כדי להעביר את האונות למבחנה מסוג eend orph של 1.5 ml.אנו ממליצים על לא יותר מ-50 אונויות לכל מבחנת eend orph. יש לאפשר לאונויות לשקוע לתחתית המבחנה תחת כבידה יחידה ולהסיר את המדיום. יש לשטוף את האונויות עם 1 mL PBS ולאחר מכן להמתין עד שהאונויות ישקעו שוב לתחתית.חזור על פעולה זו עבור סך של שלושה שטיפות PBS, הסר את שטיפת ה-PBS האחרונה והוסף 600 µL של תמיסת tripsin בריכוז 0.25%. הנח את מבחנת ה-Eppendorf באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 25 דקות. בצע טריטורציה עדינה של האונות באמצעות טיפ כחול של 1 mL בפיפט רב-ערוצי למשך 10 שניות, ולאחר מכן החזר לאינקובטור; לאחר 20 דקות, בצע שאיבה ופליטה (pipetting) של האונות למעלה ולמטה כדי לפרק אותן לחלוטין.כדי להגיע לתליה של תאים בודדים, יש להוסיף 400 µL של RPMI 1640 קפוא בקרח בתוספת 10% FCS כדי לנטרל את ה-trypsin. יש לשקיע את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה במהירות של 1,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, להסיר את הנוזל העליון (supernatant) ולששוב את המשקע ב-1 mL של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS במידת הצורך. יש לספור את התאים.בדרך כלל אנו מצפים לכ-50,000 תאים לכל lobe של ה-dioxazine, החל משלב E 15 fibrous. כעת אנו מוכנים להקים את האגרגט של תרביות fmic Corgan בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית (Eppendorf) של 1.5 ml. ערבב תאי stromal טריים שהוכנו זה עתה.יחד עם פיברוציטים חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD8 שנבחרו מראש. אנו ממליצים על יחס של בערך אחד ለአחד בין תאי סטרומה לפיברוציטים. מספר התאים שבהם תשתמשו יהיה תלוי במספר התאים הזמינים ובניסויים שיבוצעו.אנו ממליצים על כמות כוללת של לפחות מאה אלף תאים ולא יותר מ-1.5 מיליון תאים. יש להבטיח שצבירי ה-V יהיו גדולים מספיק כדי להיות ניתנים לשחזור, אך לא גדולים מדי כך שהמרכז ימות. יש לרכז את התאים למשקע באמצעות סבב ב-1,000 RPM למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 4 °C, הרכיבו בזהירות את מסנן תרבית האיברים.הסר את כל ה-supernatant מהשלב באמצעות פיפט P 200. ערבב את משקע התאים בוורטקס למשך 10 שניות ליצירת תמיסה סמיכה (slurry). הנפח צריך להיות כ-1 עד 2 µL.העבירו את תמיסת התאים לפיפט דק, תוך שמירה על סספנסיות התאים בקצה הפיפט. תחת מיקרוסקופ הדיססקציה, טפטפו בזהירות את תמיסת התאים למרכז של מסנן בעל נקבוביות של 0.8 µm. באופן אידיאלי, יש להניח את התאים כטיפה עומדת במעגל שקוטרו 1 עד 2 mm.אם התעלה מתחילה להתפשט, יש לאפשר לנוזל שבתעלה להתנקז דרך ה-pos לפני הפקדת התאים הנותרים. יש להניח את הצלחת בקופסת סנדוויץ' מפלסטיק ולאטום אותה. בדומה לתרביות איברים של תימוס, יש להניח את הקופסה באינקובטור; תרביות אגרגציה יוצרות מבנים שלמים בתוך 18 שעות של תרבית.לאחר ארבעה עד חמישה ימי תרבית, הן ייצרו תתי-אוכלוסיות של תאי cyte בוגרים, הן CD4 positive CD8 negative והן CD4 negative CD8 positive. התחלה עם 50 אונונים (lobes) שעובדו ב-dioxazine אמורה לספק מספיק תאי סטרומה להכנת שלוש עד חמש תרביות רה-אגרגציה (reaggregate). תרביות אלו נראות בדרך כלל כגבשושיות תאים קוהרנטיות שניתן להסיר מהמסננים באמצעות פינצטה מבלי להרוס אותן.תיארנו זה עתה את השיטה לבחינת ברירה חיובית על ידי תאי אפיתל של ה-F. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לבחון ברירה שלילית המתווכת על ידי תאים דנדריטיים. לבסוף, ניתן להשתמש ב-FIBROCYTES טרנסגנביים ל-TCR או בתאים סטרומליים חסרי MHC Class one או MHC Class two.מערכת זו מאפשרת מחקרים נפרדים של ברירה (selection) של תאי T חיוביים ל-CD4 או חיוביים ל-CD8. תודה שצפיתם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את לנתיחה והסרה של בלוטת התימוס העובר, כמו גם הכנת תרבויות vivo לשעבר של 2-dGuo שטופלו התימוס.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

סרטון זה מדגים פרוטוקול ליצירת תאי T פונקציונליים ספציפיים לאנטיגן מתאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC באמצעות מערכת תרבית תימית תלת-ממדית. תרבית משותפת של תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC עם עכברים אנדוגניים מדולדלי לימפוציטים, אונות תימיות עובריות, הביאה להבשלה מוצלחת של תאי T ליצירת CD8αβ+ MHC class I+ iPSC שמקורם במהגרים תימיים (iTEs).

מערכת תרבות תימית תלת-ממדית ליצירת מהגרים תימיים שמקורם ב-iPSC

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרת תאי אפיתל תימיים (TECs) עם שיפוע צפיפות לבידוד FACS. הוא גם מראה את השימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 כדי לקדם את היווצרות הצבירה של TEC. המיקרו-סביבות של הידרוג'ל EAK16-II/EAKIIH6 מספקות את התצורה התלת-ממדית הדרושה לשמירה על ההישרדות והתפקוד של ה-TEC.

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג&#39;ל

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תימוציטים שליליים כפולים מתימוס העכבר ולאחר מכן התמרה רטרו-ויראלית ותרבית משותפת על מערכת תרבית משותפת של קו תאי סטרומה דמוי מח עצם דמוי דלתא (OP9-DL4) לניתוח פונקציונלי נוסף.

תרבית משותפת והתמרה של תימוציטים מורינים על תאי סטרומה דמויי דלתא המבטאים 4 כדי לחקור אונקוגנים בלוקמיה של תאי T

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להיווצרות אורגנואידים אנושיים של בלוטת התימוס המופקת מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) הגדלים בהידרוג'לים תלת-ממדיים של פיברין, במטרה לתמוך בהבשלת תאי אפיתל תימיים (TEC) ובתחזוקה ממושכת, כמו גם במבחנה, כמו גם במבחנה.

היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין

למדו הכנת תרבויות קורנית מורכבות מחדש לחקר הבדלת תאי T ואינטראקציות תאיות. שיטה זו מאפשרת ייצור תת-אוכלוסיות CD4+ ו-CD8+ ומחקר בחירה חיובית ושלילית במערכת החיסון.

Reaggregate תרבויות קורנית

גלה סרטונים נוספים