Reaggregate תרבויות קורנית

שלום, אני אנדריאה וייט מהמעבדה של גרהאם אנדרסון ואריק ג'נקינסון במרכז MRC לבקרת מערכת החיסון באוניברסיטת בירמינגהם. היום אציג פרוטוקול להפקת תרביות איברים תימיים מרו-אגרגטיים (re-aggregate), שניתן להשתמש בהן כדי לחקור אינטראקציות תאיות מורכבות המתרחשות במהלך התמיינות תאי T. לפני תחילת הליך זה, בודדו אונויות תימוס עובריות ועובדו להסרת כל הלימפוציטים.

ניתן לראות זאת בסרטון נפרד. לאחר מכן, האונות ה-alienoid מופרדות כדי להפיק תכשיר של תאי סטרומה. ולבסוף, התאים מאוגדים כדי ליצור תרבית איברים של re-aggregate fmic.

נתחיל בתהליך. לאחר חמישה עד שבעה ימי תרבית, ה-LO אמור להיות מוכן לפירוק לצורך הכנת תאי shoal; טבול את המסננים של 0.8 µm בצלחת פטרי המכילה RPMI 1640 בתוספת 10% FCS. באמצעות פינצטה, דחף בעדינות כל רסיסי סיב שאינם צפים. השתמש בפיפט של 1 ml כדי להעביר את האונות למבחנה מסוג eend orph של 1.5 ml.

אנו ממליצים על לא יותר מ-50 אונויות לכל מבחנת eend orph. יש לאפשר לאונויות לשקוע לתחתית המבחנה תחת כבידה יחידה ולהסיר את המדיום. יש לשטוף את האונויות עם 1 mL PBS ולאחר מכן להמתין עד שהאונויות ישקעו שוב לתחתית.

חזור על פעולה זו עבור סך של שלושה שטיפות PBS, הסר את שטיפת ה-PBS האחרונה והוסף 600 µL של תמיסת tripsin בריכוז 0.25%. הנח את מבחנת ה-Eppendorf באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 25 דקות. בצע טריטורציה עדינה של האונות באמצעות טיפ כחול של 1 mL בפיפט רב-ערוצי למשך 10 שניות, ולאחר מכן החזר לאינקובטור; לאחר 20 דקות, בצע שאיבה ופליטה (pipetting) של האונות למעלה ולמטה כדי לפרק אותן לחלוטין.

כדי להגיע לתליה של תאים בודדים, יש להוסיף 400 µL של RPMI 1640 קפוא בקרח בתוספת 10% FCS כדי לנטרל את ה-trypsin. יש לשקיע את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה במהירות של 1,000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, להסיר את הנוזל העליון (supernatant) ולששוב את המשקע ב-1 mL של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS במידת הצורך. יש לספור את התאים.

בדרך כלל אנו מצפים לכ-50,000 תאים לכל lobe של ה-dioxazine, החל משלב E 15 fibrous. כעת אנו מוכנים להקים את האגרגט של תרביות fmic Corgan בתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית (Eppendorf) של 1.5 ml. ערבב תאי stromal טריים שהוכנו זה עתה.

יחד עם פיברוציטים חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD8 שנבחרו מראש. אנו ממליצים על יחס של בערך אחד ለአחד בין תאי סטרומה לפיברוציטים. מספר התאים שבהם תשתמשו יהיה תלוי במספר התאים הזמינים ובניסויים שיבוצעו.

אנו ממליצים על כמות כוללת של לפחות מאה אלף תאים ולא יותר מ-1.5 מיליון תאים. יש להבטיח שצבירי ה-V יהיו גדולים מספיק כדי להיות ניתנים לשחזור, אך לא גדולים מדי כך שהמרכז ימות. יש לרכז את התאים למשקע באמצעות סבב ב-1,000 RPM למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 4 °C, הרכיבו בזהירות את מסנן תרבית האיברים.

הסר את כל ה-supernatant מהשלב באמצעות פיפט P 200. ערבב את משקע התאים בוורטקס למשך 10 שניות ליצירת תמיסה סמיכה (slurry). הנפח צריך להיות כ-1 עד 2 µL.

העבירו את תמיסת התאים לפיפט דק, תוך שמירה על סספנסיות התאים בקצה הפיפט. תחת מיקרוסקופ הדיססקציה, טפטפו בזהירות את תמיסת התאים למרכז של מסנן בעל נקבוביות של 0.8 µm. באופן אידיאלי, יש להניח את התאים כטיפה עומדת במעגל שקוטרו 1 עד 2 mm.

אם התעלה מתחילה להתפשט, יש לאפשר לנוזל שבתעלה להתנקז דרך ה-pos לפני הפקדת התאים הנותרים. יש להניח את הצלחת בקופסת סנדוויץ' מפלסטיק ולאטום אותה. בדומה לתרביות איברים של תימוס, יש להניח את הקופסה באינקובטור; תרביות אגרגציה יוצרות מבנים שלמים בתוך 18 שעות של תרבית.

לאחר ארבעה עד חמישה ימי תרבית, הן ייצרו תתי-אוכלוסיות של תאי cyte בוגרים, הן CD4 positive CD8 negative והן CD4 negative CD8 positive. התחלה עם 50 אונונים (lobes) שעובדו ב-dioxazine אמורה לספק מספיק תאי סטרומה להכנת שלוש עד חמש תרביות רה-אגרגציה (reaggregate). תרביות אלו נראות בדרך כלל כגבשושיות תאים קוהרנטיות שניתן להסיר מהמסננים באמצעות פינצטה מבלי להרוס אותן.

תיארנו זה עתה את השיטה לבחינת ברירה חיובית על ידי תאי אפיתל של ה-F. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לבחון ברירה שלילית המתווכת על ידי תאים דנדריטיים. לבסוף, ניתן להשתמש ב-FIBROCYTES טרנסגנביים ל-TCR או בתאים סטרומליים חסרי MHC Class one או MHC Class two.

מערכת זו מאפשרת מחקרים נפרדים של ברירה (selection) של תאי T חיוביים ל-CD4 או חיוביים ל-CD8. תודה שצפיתם.