Name: הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למד הכנת תרביות איברים קורנית עובריות עם טיפול ב-2-dGuo לחקר התפתחות תאי T ודינמיקת תאים לימפואידיים. שיטה זו מאפשרת מחקר מערכת החיסון בתנאי מעבדה מבוקרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

בקר <a href="http://www.springerprotocols.com/">הפרוטוקולים שפרינגר</a> לקבלת מידע נוסף אודות הכנת לשעבר תרבויות vivo התימוס איברים.

למחברים אין ניגודי בריאות להצהיר עליהם.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

הכנת 2-dguo שטופלו תרבויות איברים קורנית

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

ב, CD4 התימוס בשלה 8 + thymocytes להביע מחדש באופן אקראי T-cell receptor α ו-b-שרשרת אירועים גנים עוברים סלקציה חיובית ושלילית מבוסס על היכולת שלהם לזהות histocompatibility self-peptide/major מורכבות (MHC) מולקולות לידי ביטוי הרתי סטרומה תאים. בניתוח vivo התפקיד של תאים סטרומה הרתי במהלך בחירת intrathymic קשה בגלל המורכבות הסלולר של microenvironment הרתי ב היציב התימוס מבוגר, ועל ידי חוסר מיקוד אסטרטגיות מתאימות כדי לתפעל ביטוי גנים בפרט תאים סטרומה הרתי. הראינו כי microenvironment הרתי ניתן להשפיע בקלות באמצעות reaggregate תרבויות איבר התימוס, המאפשרים הכנת תלת ממדי אונות התימוס מתאי סטרומה ו הלימפה מוגדר במבחנה. למרות אחרות במערכות חוץ גופית תמיכה כמה היבטים של התפתחות תא T, reaggregate תרבות איבר התימוס נשאר רק במערכת במבחנה מסוגל לתמוך בכיתה MHC יעיל I ו-II בתיווך אירועי מבחר thymocyte, ולכן יכול לשמש ככלי יעיל ללמוד הסדרת תאית ומולקולרית של בחירה חיוביות ושליליות של התימוס.

וידאו זה מדגים את לנתיחה והסרה של בלוטת התימוס העובר, כמו גם הכנת תרבויות vivo לשעבר של 2-dGuo שטופלו התימוס.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

בטימוס, ידוע כי אינטראקציות בין מקדמי תאי T מתפתחים לבין תאי סטרומה, הכוללים תאים אפיתליאליים קורטיקליים ומדולריים, ממלאות...

שלום, אני ויל ג'נקינסון מהקבוצה של גרהם אנדרסון ואריק ג'נקינסון במרכז MRC לבקרת מערכת החיסון באוניברסיטת ברמינגהם. היום אדגים לכם טכניקה להקמת תרביות של איברים של תימוס עוברי. בנוסף, אראה לכם כיצד לטפל בתרביות איברים אלו באמצעות two dioxazine.וזהו חומר שהוא רעיל באופן סלקטיבי לתאי לימפואידים בתרבית איברים. קיימים מספר יישומים של טכניקה זו במעבדה. יישום אחד כזה הוא ייצור של תרביות איברים מרו-אגרגטיות.יישומים נוספים כוללים את חקר השלבים השונים של התפתחות התאים, ובשימוש בתרביות של איברים תימوسیים עובריים, אנו יכולים להוסיף ריאגנטים המעכבים או מעוררים מסלולים שונים, מה שמאפשר לנו לחקור את תפקידם של מולקולות ספציפיות בתהליך זה. אז בואו נתחיל. השלב הראשון בהכנת תרביות של איבר התימוס הוא קצירת עוברים של עכברים ביום 14 או 15 משני עד שלושה אמהות הריונות.ראשית, רססו את העכבר שעבר הרדמה עם 70% ethanol. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי למשוך את הפרווה ובצעו חתך בצורת V באזור הבטן באמצעות מספריים, החל מהשלפוחית ובמשך שתי הקרניים הצדדיות של הרחם. הוציאו את קרן הרחם והניחו אותה בתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 סנטימטרים.חתכו לאורך דופן הרחם והוציאו את העוברים שעדיין נמצאים בשקי השילייה שלהם. שטפו אותם בצלחת פטרי המכילה 10 ml PBS באמצעות שני זוגות פינצטות עדינות. קרעו בזהירות את שק השילייה ושחררו את העובר מהשק ומהשלשייה.בשלב הבא, העבירו את העוברים לפטרי פטרי נקייה המכילה 10 מ"ל של תערובת שווה (50:50) של PBS עם RPMI 1640. מצע עם 10% FCS תחת מיקרוסקופ dissection, כאשר העובר טבול במצע, בצעו דקפיטציה (ניתוק ראש) לעובר באמצעות פינצטה. פתחו את פני השטח הקדמיים של דופן בית החזה על ידי הנחת קצותיה של פינצטה סגורה לתוך חלל בית החזה, ולאחר מכן פתחו את הפינצטה כדי לחשוף את חלל בית החזה הפנימי.הסיר את כל מערכת הנשימה והלב, הריאות, הקנה והתימוס על ידי אחיזה עדינה מתחת ללב, והנח אותם בתוך צלחית של 35 מילימטר המכילה 5 mL של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ביום 14 עד 15 של העובר. אונוי התימוס הראשוניים ממוקמים ממש מעל הלב, משני צדי הקנה.הסיר את אונוני התימוס הבודדים באמצעות פינצטה עדינה, וכן הסר רקמת חיבור עודפת וכל שארית דם דבקה לפני ההעברה לתרבית איברים. כעת אנו מוכנים לתרבית איברים. כדי להכין רעלן לימפואידי, קח תמיסת מלאי של 9 mM של 2-deoxycytidine והכן 600 µL בתוך צלחת פטרי פלסטיק חיידקית בקוטר 90 מ"מ.הוסיפו 4 mL של מצע DMEM שחומם מראש וסובבו את הצלחת כך שכל פני השטח יהיו מכוסים במצע. כמובן, אם ברצונכם להכין תרביות לימפואידיות לבדיקת התפתחות תאי T, השאירו את שני ה-dioxazine מחוץ לצלחת באמצעות פינצטה. הניחו בצלחת שתי ספוגי עטיפה סטריליים, שנגזרו מראש לגודל של 1 cm².המתינו כ-30 שניות עד שהתווך ייספג בספוג. לאחר מכן, הפכו את הספוג כדי להרטיב את שני צדדיו. פעולה זו מבטיחה שהתווך שבצלוחית יגיע לרקמה, שוב, באמצעות פינצטה.הניחו מסנן סטרילי מראש של 0.8 micron על פניו של כל ספוג. המסננים מונחים בצד המבריק כלפי מעלה על תומכי הספוג כדי להעביר את נתחי התימוס למסנן לתרבית איברים; אנו מעדיפים להשתמש בפיפט זכוכית של בקרה כדי להכין פיפטים מזכוכית. חממו את צינורית הזכוכית מעל להבת מבער בנזן, וכאשר הזכוכית תהיה גמישה, הוציאו אותה מהלהבה ומשכו את שני הקצוות כדי למתוח את הזכוכית לאורך של עד 10 סנטימטרים, והניחו לזכוכית להתקרר.לאחר מכן, משכו כל קצה כדי לשבור את הזכוכית. פעולה זו יוצרת שתי פיפטות מזכוכית בעלות קצה מחודד. האזור הדק של כל אחת מהן הוא באורך של כחמישה סנטימטרים עם קצה שקוטרו כ-0.5 מילימטרים.להכנת מכשיר השאיבה, מקריאו קצה פיפטה מפלסטיק בקצה השני כפיה ושימו את הקצה הקהה של פיפטת זכוכית בתוך הפיתול. שאבו בזהירות אונולי תימוס בודדים באמצעות פיפטת הפה והניחו אותם על פני מסנן נייר של 0.8 micron. בתרבית איברים, אנו ממליצים להניח חמישה עד שישה אונולי תימוס על כל מסנן, לסך הכל של 10 עד 12 אונולי תימוס לכל צלחת.דבר זה מאפשר מרחב רב לצמיחת תרביות האיברים ומאפשר לשני ה-dioxazine להשמיד את כל התאים הלימפואידיים האנדוגניים. לאחר הגדרת התרביות, הרכיבו מכסה של קופסת סנדוויץ' באמצעות מכסה של צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר כפלטפורמה, ומלאו מים מזוקקים כפולה כך שיהיו ממש מתחת למפלס הפלטפורמה. מקמו עד שלוש צלחות בתוך הקופסה ואטמו את המכסה לקופסה בעזרת סרט דבק.במכסה צריכים להיות שני חורי אוורור בקוטר חמישה מילימטרים, שנקדחו בפינות נגדיות. יש להניח את הקופסאות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 10%CO2 למשך חמישה עד שבעה ימים, ולאחר מכן אנו מפרקים ומאחדים מחדש תרביות אלו כדי לחקור אינטראקציות של אתרים סตรומליים בתימוס בסביבה תלת-ממדית מבוקרת. לאחר תקופת תרבית, לרוב של חמישה עד שבעה ימים, קוצרים את ה-F talks על ידי טבילת מסננים במצע ודחיפה עדינה של האונות החוצה בעזרת פינצטה; ניתן לראות ש-lymphoid f tos הם בדרך כלל קטנים יותר וציסטיים בהשוואה לאונות לימפואידיות שלא טופלו ב-dioxazine.כעת הצגתי בפניכם את הטכניקה להקמה של תרביות איברים של תימוס עוברי. בפרוטוקול זה, הראינו כיצד לטפל בתרביות איברים של תימוס עוברי באמצעות 2-dioxazine, דבר המוביל לריקון של כל התאים הלימפואידיים, בדרך כלל לאחר חמישה עד שבעה ימי תרבית של התימוס. אנו משתמשים בתרביות איברים אלו כדי להפיק תרביות איברים שעברו ר-אגרגציה (re-aggregate).עם זאת, זו אינה הטכניקה היחידה. אנו משתמשים גם בתרביות של איברי תימה עובריים שלא טופלו בדיוקסזין (dioxazine), לצורך השתלה תחת הקפסולה של הכליה בעכברי תימה. בנוסף, אנו משתמשים בתרביות של איברי תימה עובריים לימפואידיים כדי לחקור את התפתחות תאי T בתנאים מבוקרים in vitro, אשר נקיים מהשפעות משניות שעלולות להתרחש in vivo.זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה הכנת 2-dGuo שטופלו reaggregate תרבויות התימוס מודגם.

Reaggregate תרבויות קורנית

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

סרטון זה מדגים פרוטוקול ליצירת תאי T פונקציונליים ספציפיים לאנטיגן מתאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC באמצעות מערכת תרבית תימית תלת-ממדית. תרבית משותפת של תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC עם עכברים אנדוגניים מדולדלי לימפוציטים, אונות תימיות עובריות, הביאה להבשלה מוצלחת של תאי T ליצירת CD8αβ+ MHC class I+ iPSC שמקורם במהגרים תימיים (iTEs).

מערכת תרבות תימית תלת-ממדית ליצירת מהגרים תימיים שמקורם ב-iPSC

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

אנו מתארים את הכנת פרוסות הרתי, בשילוב עם cytometry זרימה, יכול לשמש מודל בחירה חיובית ושלילית לפתח תאי T. פרוסות הרתי ניתן להתאים גם לניתוח באתרו של הגירה thymocyte, לוקליזציה, ואיתות באמצעות immunofluorescence ושני פוטון מיקרוסקופית.

הכנה ויישומים של תרבויות Organotypic הרתי Slice

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 '-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.

הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להיווצרות אורגנואידים אנושיים של בלוטת התימוס המופקת מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC) הגדלים בהידרוג'לים תלת-ממדיים של פיברין, במטרה לתמוך בהבשלת תאי אפיתל תימיים (TEC) ובתחזוקה ממושכת, כמו גם במבחנה, כמו גם במבחנה.

היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין

למד הכנת תרביות איברים קורנית עובריות עם טיפול ב-2-dGuo לחקר התפתחות תאי T ודינמיקת תאים לימפואידיים. שיטה זו מאפשרת מחקר מערכת החיסון בתנאי מעבדה מבוקרים.

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

גלה סרטונים נוספים