Name: הכנה ותחזוקה של הגב הגרעינים נוירונים רוט בתרבויות מחולקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: למדו הכנה ותחזוקה של תרביות מחולקות לנוירונים מגנגליון השורש הגבי מעכברוש. שיטה זו מאפשרת חקר צמיחת אקסונים ואינטראקציות נוירונליות בסביבה מבוקרת למחקר נוירוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות קתרינה Cosker וסטפני Courchesne לדיונים מועילים.

הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי קולגן: קולגן מעיל P35 רקמה תרבות צלחות ומכניסים לתנור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים לפני שמון חוצצים. הריכוז הסופי של קולגן צריך להיות 0.71 מ"ג / מ"ל ​​מדולל ב .001 N HCl. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של תערובת לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעמיסים גריז: כדי למלא את מטעין גריז, מזרק 60mL תחילה יש מלא שומן ואקום קורנינג. השתמש במזרק כדי למלא את מטעין גריז, לעטוף אותה בנייר כסף ואז החיטוי במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפלון חוצצים: חוצצים ניתן שימוש חוזר לאחר כל ניסוי, אך תחילה יש לנקות כראוי. הסר את המחיצה מהצלחת, לנגב את כל השומן הנותר ומניחים חומצה גופרתית עבור 2 ימים. לאחר הסרת מן החומצה, לשטוף עם מים לרתיחה 3X, במשך 20 דקות, לאפשר לו להתייבש, מקום צלחת פטרי P100 זכוכית החיטוי במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> N2-methylcellulose: לשקול את 1.5g של methylcellulose ולמקם אותו בתוך בקבוק 500ml. הוספת בר מערבבים החיטוי אותו במשך 20 דקות על יבש (מנקודה זו כל העבודה חייב להיות סטרילי). לאחר מכן, להוסיף 500 MLS של נסיוב חינם התקשורת (N 2), ומערבבים בחדר קר עד שהוא נמס. Aliquot לתוך 50 מ"ל conicals ולהקפיא ב -20 ° C. עבור aliquot עובד המניות, אחד conicals 50 מ"ל לתוך צינורות 1mL ולהקפיא ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DRG התקשורת: DMEM, 5% סוס מומת חום בדם, ו -1% סטרפטומיצין פניצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100ng/mL DRGN התקשורת: ריכוז המניות של שניהם גורם גדילה עצבי (NGF) ואת המוח נגזר גורם neurotrophic (BDNF) הוא 1mg/mL. מדולל לכל אחד neurotrophins 1:10,000 לתוך התקשורת DRG. תרבויות ניתן לגדל NGF לבד, זה משנה את המשלים של נוירונים לשרוד התרבויות. הערה: בעת הצורך, ריכוז (ציטוזין arabinoside) AraC הוא 1uM בשימוש בריכוז הסופי של 0.3uM. זה יהיה לעכב את הצמיחה של תאים שוואן ואת גליה אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10ng/mL DRGN התקשורת: לדלל את DRGN 100ng/mL מדיה (01:10) עם התקשורת DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="איור 1" width="392" height="294"> באיור 1. כלים הדרושים הגדרת </li></ol> הגדרת לתאי מחולקים (להתחיל את התהליך הזה 1-2 ימים לפני הניתוח) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לגרד באמצע צלחת מצופה קולגן P35 עם תנועה כלפי חוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 30ul של methylcellulose-N2 על באמצע השריטה. סט צלחות בצד עד המחיצה הוא משומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מתאם 23-מד בדל luer כדי מטעין את המשחה. את מחיצת גריפ טפלון עם זוג 90 ° hemostats זווית ולהניח אותה שטוח עם מחיצת פונה כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ. עקוב אחר המפריד עם גריז לוודא כי בכל פעם מתאם ממוקם בנקודת התחלה חדשה מתאם מוכנס לתוך שומן מן השלב הקודם, כך שיש קו רציף של שומן (ראה תרשים). לאחר גריז מוחל על המחיצה כולה, להפוך לאחד P35 מאכלים מוכנים הפוכים ולמקם אותו כך N2-methylcellulose נגמר בתא באמצע. לחץ כלפי מטה על תחתית צלחת עם פינצטה. הקפד ללחוץ על החלק הפנימי של המחיצה בארבע פינות (השמאלית העליונה, בפינה הימנית התחתונה, הימנית העליונה, השמאלית התחתונה, המצוין בתרשים על ידי "X"). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="איור 2" width="171" height="183"> איור 2: צעדים כדי לשמן את המחיצה הערה: חשוב ללחוץ בחוזקה מספיק כך גריז עושה חותם להשלים עם המנה, אבל אם יותר מדי לחץ נוסף, האקסונים לא לחצות את הגבול לתוך התאים בצד. תרימי את hemostats, להפוך אותו שוב unclamp המפריד. לבסוף, במקום צלחת עם מחיצת מחובר היטב מתחת למיקרוסקופ התמקדות התחתון של התא האמצעי. עם מטעין את השומן, ליצור מחסום קטן (0.25 ס"מ), כך שברגע התאים ממוקמים בתא באמצע שהם לא יכולים לדלוף החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר להגדיר כמה תרבויות, DRG מקום התקשורת בכל התאים בצד ומקום באינקובטור שבו התאים יישמר. אפשר התרבויות לשבת במשך כמה שעות ואז לבדוק דליפה. אם בתקשורת יש דלף לתוך התא האמצעי, אז התרבות הוא שמיש. הערה: כשבני הראשון לומדים את הטכניקה הזו, חשוב להגדיר תרבויות יותר יש צורך בניסוי, כמו כמה יהיה דולף. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="איור 3" width="254" height="191"> איור 3: "טוב לעומת דולף" תרבות </li></ol> נוירונים DRG שמירה בתרבויות מחולקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: החלף DRG התקשורת התאים לצד 100ng/mL DRGN מדיה + AraC. בצע לנתיחה ולהוסיף תאים לתא מרכז (100,000 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: הוסף 10ng/mL מדיה + AraC החיצוני של המחיצה טפלון עד שהתקשורת זורמת מעל המכשול שומן ונוזלים חילופי עם תא מרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: החלף התקשורת התאים צד 100ng/mL DRGN השמטת AraC ואת להקיף עם 10ng/mL DRGN השמטת AraC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6: החלף התקשורת התאים צד 1ng/mL + AraC ואת להקיף עם DRG מדיה + AraC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 9: השתמש לניסויים. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="איור 4" width="267" height="148"> איור 4: תמונות של גופות IHC התא אקסונים דיסטלי הערה: כאשר משנים את התקשורת, חשוב לשאוב את הנוזל מהחלק העליון של תא אחד בצד. כמו כן, לא לשנות את התקשורת מן התא האמצעי עצמו, רק להקיף את, ולתת לו לזרום מעל המכשול גריז למרכז. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

בסרטון הזה, אנחנו הוכיחו כיצד להכין ולתחזק לתאי מחולקים לשימוש נוירונים DRG culturing. בוצע כהלכה, מערכת זו מאפשרת הפרדה בין גוף התא של האקסון כדי ללמוד על המנגנונים שבאמצעותם neurotrophins אותות מעבר אקסונים ארוכים. מאז יש בידוד fluidic בין התאים, היא מאפשרת גירוי טיפול סלקטיבי או של תא אחד ללא התאים האחרים להיות מושפע. תרבויות מחולקים קאמרית יכול לתמוך סוגי תאים אחרים, כולל נוירונים אוהדת בגרעיני צוואר הרחם מעולה, הנוירונים הגנגליון ברשתית, ועל נוירונים בקליפת המוח. הבנה מרחבית של הולכת אותות neurot...

<table><tbody><tr><td>collagen</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>N2-methylcellulose 400CPS</td><td>ריאגנט</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפריד טפלון</td><td>אחר</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>סוגים רבים אחרים של מפרידים זמינים</td></tr><tr><td>מסרק סיכות</td><td>כלי</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>מטען גריז</td><td>כלי</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>ריאגנט</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>ריאגנט</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>גריז לוואקום גבוה</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>מתאם luer stub בכיול 23</td><td>כלי</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>פינצטאות המוסטט בזווית 90&amp;#x00B0;</td><td>כלי</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה ותחזוקה של הגב הגרעינים נוירונים רוט בתרבויות מחולקים

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

נוירונים להאריך תהליכים axonal כי הם רחוקים בגוף התא innervate רקמות היעד, שם היעד הנגזרות גורמי גדילה נדרשים להישרדות תפקוד עצבי ו. Neurotrophins נדרשים במיוחד כדי לשמור על בידול של הישרדות innervating עצב סנסורי אבל השאלה כיצד אלה יעד הנגזרות neurotrophins לתקשר אל גוף התא של הנוירונים innervating כבר על שטח של מחקר פעיל במשך 30 שנים. המודל המקובל בדרך כלל של כמה אותות neurotrophin להגיע לגוף התא מציעה כי איתות endosomes לשאת אות retrogradely לאורך האקסון. כדי ללמוד התחבורה מדרדר, מערכת התרבות פותחה במקור על ידי רוברט Campenot, שבו גופי התא מבודדים האקסונים שלהם. הטכניקה של הכנת אלה מחולקים לתאי עבור culturing נוירונים משחזר את הגירוי החושי סלקטיבית של מסופי נוירון המתרחשת בעקבות שחרור vivo של יעד הנגזרות neurotrophins. אירועים איתות מדרדר הדורשים ארוכי טווח תחבורה תלויה microtubule מדרדר להיות השלכות חשובות בטיפול בהפרעות ניוון עצבי.

כאן אנו מתארים את הטכניקה של הכנת ושמירה לתאי מחולקים עבור נוירונים culturing חושית של הגרעינים השורש הגבי.

נוירונים מקימים שלוחות אקסוניות המתרחקות משמעותית מגוף התא כדי לעצב רקמות מטרה, שבהן נדרשים גורמי גדילה המופקים מהמטרה עבור...

הליך זה מתחיל ביצירת שריטה באמצעות מסרק סיכות במרכז פלטה מצופה קולגן, והטפטפת של 30 µL של Methylcellulose למרכז השריטות. יש לשמן כל מחיצה באמצעות טוען גריז ולהצמיד אותה לפלטה מצופה קולגן. יש להעביר 100,000 תאים מעוברים של חולדה בשלב E 15 לתא האמצעי.לאחר תשעה ימים, התאים יפרוסו אקסונים אל תוך התא הצדדי ויהיו מוכנים לניסוי. שלום, אני מריה מרפי מהמעבדה של ד"ר רוזלין סיגל במחלקה לאונקולוגיה פדיאטרית במכון לסרטן דנה-פארבר. היום נדגים לכם פרוצדורה להכנה ותחזוקה של נוירונים מגרעיני שורש של Dosa בתרביות מופרדות לתאים.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את השליחויות של נוירוטרופינים. אם כך, נתחיל. לפני הכנת התאים המופרדים, יש לצפות פלטות תרבית רקמה P 35 בקולגן.כדי לבצע זאת, הוסיפו למשבצות מיליליטר אחד של תמיסת קולגן בריכוז 0.71 mg/mL ב-0.001 N HCl והדגירו אותן בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים. לאחר יומיים, צרו שריטה במרכז המשבצות המצופות בקולגן באמצעות מסרק סיכות (pin rake), תוך ביצוע תנועה כלפי חוץ.לאחר מכן, הניחו 30 µL של N two Methylcellulose במרכז השריטה. הניחו את הצלחות בצד. בשלב הבא, חברו מתאם lure stub בכיול 23 gauge למטען הגריז.אחזו במחיצת הטפלון באמצעות צבת המוסטט מזווית 90 מעלות והניחו אותה שטוחה תחת מיקרוסקופ, כאשר המחיצה פונה כלפי מעלה. תוך써 צפייה דרך המיקרוסקופ, מרחו גריז

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

סרטון זה מדגים בניית מערכת תרבית תאים בת שלושה תאים באמצעות קולגן ושומן לא תגובתי. מערכת זו משמשת לצפייה באינטראקציות בין תאי גליומה ואקסונים בזמן אמת.

הכנת צלחות תרבית ממודרות מצופות קולגן לתרבית תאי עצב

הסרטון מדגים את ההתרבות המשותפת של נוירוני גנגליון שורש גבי (DRG) עם תאי Schwann. תאי עצב DRG גדלים תחילה על קרום מתוח מראש לצמיחה מיושרת של אקסונים. לאחר מכן מוצגים תאי Schwann, אשר נצמדים לאקסונים, מבודדים אותם ומקדמים הישרדות ותפקוד של תאי עצב.

תרבית משותפת של תאי Schwann עם נוירוני DRG על קרום מתוח מראש

סרטון זה מדגים שיטה לקצירת תאי עצב מגרעיני השורש הגבי (DRG). DRG מעמוד השדרה של חולדה מבודד, מטופל באנזימים, ולאחר מכן מנותק מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. תאי העצב מופרדים מתאי גלייה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ומתורבתים במדיום גידול.

טכניקה לקצירת וניתוק גרעיני שורש גבי עבור תרביות עצביות

סרטון זה מדגים את מודל ההתרבות של צמח גנגליון שורש גבי ותאי Schwann. בתנאי קוטורטור, חומצה אסקורבית מקדמת התמיינות של תאי Schwann לצורות myelinating. תאי Myelinating Schwann עוטפים את האקסונים מספר פעמים כדי ליצור מעטפת מיאלין, החיונית לתפקוד העצבים.

גידול משותף של צמח גנגליון שורש גבי עם תאי Schwann למיאלינציה של נוירונים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גרעיני שורש גבי (DRG) מעמוד השדרה של החולדה. DRGs שנכרתו מעמוד השדרה מטופלים באנזימים ומנתקים מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. התאים מגודלים בתרבית בתווך המכיל מעכבים וגורמי גדילה המגבילים את התפשטות תאי הגליה ומקדמים צמיחה עצבית, בהתאמה.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

למדו הכנה ותחזוקה של תרביות מחולקות לנוירונים מגנגליון השורש הגבי מעכברוש. שיטה זו מאפשרת חקר צמיחת אקסונים ואינטראקציות נוירונליות בסביבה מבוקרת למחקר נוירוביולוגי.

הכנה ותחזוקה של הגב הגרעינים נוירונים רוט בתרבויות מחולקים

גלה סרטונים נוספים