שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

סרטון זה מדגים את השלבים השונים של אימונוהיסטוכימיה של עובר שלם (whole Mount immunohistochemistry) בעובר של אפרוח תוך שימוש בנוגדנים שניתים המצומדים ל-HRP. ראשית, העובר מקובע ב-para formaldehyde. לאחר מכן, פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית מושתקת.

לאחר מכן מדגירים את העובר בנוגדן ראשוני. לאחר מספר שטיפות, מדגירים את העובר בנוגדן שני המצומד ל-HRP. תגובת הצבע נחשפת באמצעות מצע DAB, וצביעת הנוגדנים מופיעה בצבע כתום. היתרון של שיטה זו על פני שימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים הוא שניתן להכין את העוברים לחיתוך בפרפין, ובכך לאפשר את חקר אתרי האנטיגן בחתך רוחב.

שלום, אני דלפין ממעבדת FIN במרכז לרפואה סביבתית וגנומית ב-Texas A&M ביוסטון. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע צביעות נוגדנים בשיטת hormone mount בעוברי דג זהב (cheek embryos) באמצעות נוגדנים המצומדים ל-HRP. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את מורפולוגיית העוברים לאחר טיפול בתרופות אנטי-אפילפטיות.

בואו נתחיל בביצוע אימונוהיסטוכימיה של דגימה שלמה (whole mount) בעוברי אפרוח. ראשית, פתחו ביצה על ידי הקשה על הקליפה באמצעות פינצטה והסרה של חלקי קליפה. הסירו את האלבומין העבה בעזרת פינצטה והטו את שק החלמון באמצעות פינצטה גסה כך שהעובר יפנה כלפי מעלה.

בשלב הבא, השתמשו במספריים עדינים כדי לגזור ריבוע של שק החלמון סביב העובר. הוציאו את העובר מהחלמון בעזרת כפית והניחו אותו בצלחת המכילה PBS תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הסירו בזהירות את הממברנות מהחלמון והעבירו את העובר לצלחת נקייה המכילה PBS.

לאחר העברת העובר, קבעו את העובר באמצעות פינצטה וסיכות לחרקים ושאבו את ה-PBS. החליפו זאת ב-4% PFA ב-PBS והניחו לעובר להיקבע למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי למזער זיהום מיקרוביאלי פוטנציאלי. השתמשו ב-H2O דה-יוני בכל השלבים הבאים; לאחר קיבוע העובר, שאבו את תמיסת הקיבוע והשליכו אותה כראוי כפסולת כימית.

מלאו את הצלחת ב-BS. לאחר מכן, בעזרת סכין למיקרו-דיסקציה, חתכו ריבוע מסביב לעובר כדי להסיר קרומים חו-עובריים עודפים. הסירו את סיכות החרקים באמצעות פינצטה לאחר שסיכות הובדלו. השתמשו בפיפטת פסטור בעלת קצה קהה כדי להעביר את העובר לבקבוק סינטילציה המכיל PBT.

שטפו את העובר עם PBT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. הסירו את ה-PBT מבקבוק הסינצילציה והחליפו אותו ב-PBTX המכיל 0.3%H 2 0 2 על מנת לנטרל פריקסידאז אנדוגנית פוטנציאלית. הדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על מכשיר ערבוב (mutator).

שטוף את העובר ב-PBT תחילה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל פעם. לצביעת העובר בנוגדן, התחל בשטיפת העובר למשך שעה אחת בבופר חסימה (blocking buffer) או ב-1%BSA 1%NGS.

אנו משתמשים ב-NGS מכיוון שהנוגדן המשני הופק מעז. דגרו במכשיר mutator למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, דללו את הנוגדן הראשוני ביחס של אחד לאחד בבופר חסימה ודגרו את העובר בתמיסה זו למשך יומיים ב-4 °C. במכשיר mutator.

גורם הדילול של הנוגדן הראשוני תלוי בבחירת הנוגדן הראשוני. כאן אנו משתמשים בנוגדן מבנק ההיברידומות DOMA למחקרי התפתחות, המסופק כתחליב על (supernatant). אנו מדללים אותו ביחס של אחד לאחד בבופר חסימה.

לאחר מכן, בצעו שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות ב-PBT, ולאחריהם שלושה שלבי שטיפה של שעה אחת ב-PBT. לאחר השטיפה, דללו את הנוגדן המשני ביחס של 1:2,500 בתמיסת חסימה. במקרה זה, השתמשו ב-goat anti-US IgG המשורשר ל-peroxidase והדגיפו את העובר בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C על שייקר.

בצעו שלושה שטיפות של 10 דקות ב-PBT, ולאחריהן שלושה שטיפות של שעה אחת ב-PBT כדי לפתח את תגובת הצבע של העובר הצבוע. בצעו שתי שטיפות ראשונות של 20 דקות בבופר tris של 100 millimolar tris, HCL pH 7.4. לאחר מכן, הסירו את שטיפת בופר ה-TS האחרונה מהמבחנה המכילה את העובר והחליפו אותה בחמישה milliliters של תמיסת DAB.

השאירו את הדגימה בחושך במכשיר ה-mutator למשך 20 דקות. השליכו את טיפ ה-einor לדלי המכיל תמיסת אקונומיקה בריכוז 10%. כדי לחטא את ה-DAB, הוסיפו 16 µL.

הוסף H₂O₂ למבחנה המכילה את העוברים ב-DAB. שמור את המבחנה בחושך. לאחר 10 דקות, עקב אחר התגובה תחת מיקרוסקופ עד להשלמת תגובת הצבע. השלך את ה-DAB לדלי עם אקונומיקה, והחלף אותו בחמישה מיליליטרים.

מי ברז. לאחר מכן, בצע שני שלבי שטיפה של 10 דקות ב-PBS לצורך עיבוד לצילום וחיתוך בפרפין. התייבש את העובר הצבוע בסדרת אתנול, 25% 50% 75% ו-100% למשך 10 דקות כל אחת.

לאחר הדהידרציה, החליפו את האתנול ב-0.5 עד 1 מיליליטר של שמן ארז (cedarwood oil). פעולה זו תהפוך את העובר לשקוף לצורך צילום בשמן ארז. לאחר הצילום, החזירו את העובר לבקבוקון והחליפו את שמן הארז ב-100% ethanol.

לבסוף, החליפו את האתנול ב-5% fast green FCF ב-100% ethanol והדגירו למשך שלוש דקות. שלב זה יגרום לעובריו להיות גלויים לצורך היסטולוגיה. החליפו את תמיסת ה-fast green FCF ב-100% ethanol והמשיכו בעיבוד להיסטולוגיה.

להלן שלוש דוגמאות של עוברים צבועים. עוברים אלו, בשלב 11, מסומנים עם 15.3 B תשעה או לא. אחד, נוגדן ספציפי לחבל הנודאלי (nodal cord) שפותח במעבדה של Jane dod ו-Tom Gessel.

לאחר שתי דקות ב-DAB, העובר עדיין שקוף. לאחר 20 דקות ב-DAB, מופיע סימון קל בחוט הצומת (nodal cord). לבסוף, לאחר 40 דקות, הסימון של חוט הצומת מושלם.

בדוגמה זו, אנו מראים כיצד PAC seven, נוגדן שפותח במעבדתו של Tom Jessel, מזהה שלבים מוקדמים של סגירת צינור העצבים, כמו גם תאי רב-עצביים קרניאליים המגיעים מהמוח האמצעי. כאן העובר סומן באמצעות פרובה של Croc 20 ממעבדתו של David Wilkinson, ולאחר מכן בנוגדן אחד. הרגע הראינו לכם כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה של עוברים שלמים.

ניתן להשתמש בפרוצדורה זו גם בעוברים שעברו עיבוד מוקדם עבור היברידיזציה במקום (in situ hybridization) של דגימה שלמה. במקרה זה, קבעו את העובר לזמן קצר של שעה אחת לאחר ההיברידיזציה במקום, ולאחר מכן המשיכו לצביעה בנוגדנים. וזהו.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.