שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

סרטון זה מדגים את השלבים השונים של אימונוהיסטוכימיה של עובר שלם (whole Mount immunohistochemistry) בעובר עוף תוך שימוש בנוגדנים משניים המשורשרים ל-HRP. ראשית, העובר מקובע בפרהפורמלהיד. לאחר מכן, פעילות פראוקסידאז אנדוגנית מנוטרלת.

לאחר מכן, העובר מדוגר בנוכחות נוגדן ראשוני. לאחר מספר שטיפות, העובר מדוגר בנוכחות נוגדן משני המשולב עם HRP. תגובת הצבע נחשפת באמצעות סובסטרט DAB, וצביעת הנוגדנים מופיעה בצבע כתום. היתרון של שיטה זו על פני שימוש בנוגדיים פלואורסצנטיים הוא שניתן לעבד את העובריים לחתכים בשעווה, ובכך לאפשר את חקר אתרי האנטיגן בחתך רוחבי.

שלום, אני דלפין ממעבדת FIN במרכז לרפואה סביבתית וגנומית ב-Texas A&M ביוסטון. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע צביעות נוגדנים בשיטת mount של הורמונים בעוברים של דגים בשימוש בנוגדנים מצומדים ל-HRP. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את מורפולוגיית העוברים לאחר טיפול בתרופות אנטי-אפילפטיות.

אם כן, נתחיל בביצוע אימונוהיסטוכימיה של עיקרי עוברי עוף (whole mount). ראשית, פתחו ביצה על ידי נקישה על הקליפה בעזרת פינצטה והסרה של חלקי הקליפה. הסירו את האלבומין העבה בעזרת פינצטה והטו את שק החלמון בעזרת פינצטה גסה כך שהעוברית תפנה כלפי מעלה.

בשלב הבא, השתמשו במספריים עדינות כדי לגזור ריבוע מהשקיק החלבוני מסביב לעובר. הוציאו את העובר מהחלמון בעזרת כף והניחו אותו בצלחת המכילה PBS תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הסירו בזהירות את הקרומים מהחלמון והעבירו את העובר לצלחת נקייה המכילה PBS.

לאחר העברת העובר, קבעו אותו בעזרת פינצטה וסיכות פינינג ושאבו את ה-PBS. החליפו זאת ב-4% PFA ב-PBS והשאירו את העובר לקיבוע למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי למזער זיהום מיקרוביאלי פוטנציאלי. השתמשו ב-H2O דה-יוניביליזד בכל השלבים הבאים לאחר קיבוע העובר; שאבו את תמיסת הקיבוע והשליכו אותה כפסולת כימית בהתאם להנחיות.

מלא את הצלחת ב-BS. לאחר מכן, באמצעות סכין למיקרו-דיסקציה, גזור ריבוע סביב העובר כדי להסיר קרומים חוּלייתיים עודפים. הסר את הסיכות בעזרת פינצטה לאחר שהסיכות הוצאו. השתמש בפיפטה בעלת קצה קהה כדי להעביר את העובר למבחורת סינץילציה המכילה PBT.

שטפו את העובר עם PBT שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל פעם. הסירו את ה-PBT מבקבוק הסינٹیגציה והחליפו אותו ב-PBTX המכיל 0.3%H 2 0 2 על מנת לנטרל פרוקסידאז אנדוגני פוטנציאלי. הדגרימו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר.

שטפו את העובר ב-PBT תחילה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל פעם. לצביעת העובר בנוגדן, התחילו בחשיפת העובר למשך שעה אחת לתמיסת חסימה (blocking buffer) או ל-1%BSA 1%NGS.

אנו משתמשים ב-NGS מכיוון שהנוגדן המשני הופק מעז. לאחר הדגירה, הדגרו על mutator למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, דללו את הנוגדן הראשוני ביחס של אחד לאחד בבופר חסימה והדגרו את העובר בתמיסה זו למשך יומיים ב-4 °C. על mutator.

פירוק הנוגדן הראשוני תלוי בבחירת הנוגדן הראשוני. כאן אנו משתמשים בנוגדן מבנק ההיברידומה DOMA של מחקרי התפתחות, המסופק כנוזל על (supernatant). אנו מדללים אותו ביחס של אחד לאחד בתמיסת חסימה.

בשלב הבא, בצעו שלושה שטיפות של 10 דקות ב-PBT, ולאחריהן שלוש שטיפות של שעה אחת ב-PBT. לאחר השטיפה, דללו את הנוגדן המשני ביחס של 1 ל-2,500 בבופר חסימה (blocking buffer). במקרה זה, השתמשו ב-goat anti-US IgG המשורשר ל-peroxidase והדגירו את העובר בתמיסה זו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במערבל (mutator).

בצעו שלושה שטיפות של 10 דקות ב-PBT, ולאחריהן שלוש שטיפות של שעה אחת ב-PBT, כדי לפתח את תגובת הצבע של העובר הצבוע. בצעו שתי שטיפות ראשונות של 20 דקות בבופר tris בריכוז 100 millimolar tris, HCL pH 7.4. לאחר מכן, הסירו את שטיפת בופר ה-TS האחרונה מהמבחנה המכילה את העובר והחליפו אותה ב-5 milliliters של תמיסת DAB.

השאירו את הדגימה בחושך בתוך המערבב (mutator) למשך 20 דקות. השליכו את קצה הפ pipette אל הדלי המכיל תמיסת אקונומיקה בריכוז 10%. לצורך דה-קונטמינציה של DAB, הוסיפו 16 µL.

העבירו H 2 0 2 מהמלאי למבחנה המכילה את העוברים ב-DAB. שמרו אותה בחשכה. לאחר 10 דקות, עקבו אחר התגובה תחת מיקרוסקופ עד להשלמת תגובת הצבע. השליכו את ה-DAB לדלי עם תמיסת הלבנה והחליפו בחמישה מיליליטרים.

מי ברז. לאחר מכן, בצע שני שטיפות של 10 דקות ב-PBS לצורך עיבוד לצילום וחיתוך בפרפין. ייבש את העובר הצבוע בסדרת אתנול, 25%, 50%, 75% ו-100%, למשך 10 דקות כל אחת.

לאחר הדהידרציה, החליפו את האתנול ב-0.5 עד 1 מיליליטר של שמן ארז (cedarwood oil). פעולה זו תהפוך את העובר לשקוף לצורך צילום בשמן ארז. לאחר הצילום, החזירו את העובר לבחלול והחליפו את שמן הארז ב-100% ethanol.

לבסוף, החליפו את האתנול ב-5% fast green FCF ב-100% ethanol והדריגו למשך שלוש דקות. שלב זה יהפוך את העוברים לנראים לצורך היסטולוגיה. החליפו את תמיסת ה-fast green FCF ב-100% ethanol והמשיכו בעיבוד להיסטולוגיה.

להלן שלוש דוגמאות של עוברים צבועים. עוברים אלה בשלב 11 מסומנים עם 15.3 B nine או לא. One, נוגדן ספציפי לחוט הנודאלי (nodal cord) שפותח במעבדה של ג'יין דוד וטום גסל.

לאחר שתי דקות ב-DAB, העובר עדיין שקוף. לאחר 20 דקות ב-DAB, מופיע סימון קל בחבל הצומתי (nodal cord). לבסוף, לאחר 40 דקות, הסימון של החבל הצומתי הושלם.

בדוגמה זו, אנו מראים כיצד PAC seven, נוגדן שפותח במעבדתו של Tom Jessel, מזהה שלבים מוקדמים של סגירת צינור העצבים וכן תאי רכס עצבי קרניאליים הבקיעים מהמוח האמצעי. כאן העובר סומן באמצעות גשושית Croc 20 ממעבדתו של David Wilkinson, ולאחר מכן באמצעות נוגדן אחד. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה שלוואים (whole mount immunohistochemistry) בעוברים.

ניתן להשתמש בפרוצדורה זו גם עבור עובריים שעברו עיבוד קודם לערבוב באתר (whole mount in situ hybridization). במקרה זה, קבעו את העובר למשך שעה אחת לאחר ביצוע ה-in-situ hybridization, ולאחר מכן המשיכו לצביעה בנוגדנים. וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.