Name: שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב ציק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: למד את שיטת מכתים נוגדן שלם הר בצ'יק להדמיית ביטוי אנטיגנים בעוברים צעירים באמצעות נוגדנים מצומדים ל-HRP. השיטה מאפשרת חתכי שעווה וניתוח היסטולוגי מפורט של אתרי האנטיגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נוגדנים חד שבטיים (15.3B9, PAX7) שפותח על ידי (J. Dodd, TM Jessell וא Kawakami) התקבלו בנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותחה בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה מדעים ביולוגיים , איווה. DP הוא חתן פרס רות Kirschstein DA021977 1F32-01A1 מן המכון הלאומי האמריקני לשימוש בסמים. עבודה זו נתמכה על ידי מ &#39;מרגרט Alkek קרן אל RHF.

I. סקירה סכמטית: סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים אימונוהיסטוכימיה הר שלם בעובר האפרוח. ראשית, העובר הוא קבוע PFA [IHC1]. ואז, פעילות peroxidase אנדוגני הוא הרווה [IHC2]. העובר הוא מודגרות אז הנוגדן העיקרי [IHC3]. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות ב נוגדנים משני [IHC4]; התגובה צבע מתגלה באמצעות DAB [IHC5] ו מכתים נוגדן מופיע כתום [IHC6]. <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure 1.png" alt="איור 1" width="600" height="573" /> חלק 1: תיקון העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה הר שלם על עוברי חומוס, ביצה פותח לראשונה על ידי הקשה על פגז עם מלקחיים והסרת חתיכות של הקליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אלבומין עבה עם מלקחיים, ו להטות את שק החלמון עם מלקחיים גס כל כך עובר את פניהם כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים בסדר, לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר. מוציאים את העובר מן החלמון עם כפית, ומניחים צלחת ובה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר בזהירות את הקרומים וחלמון והעברת עובר לצלחת טרי המכיל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העובר למטה עם מלקחיים וסיכות חרקים, ואת לשאוב PBS. החלף את זה עם PFA 4% ב-PBS, ומאפשרים לעובר לתקן 1h ב RT. </li></ol> חלק 2: עוברים הכנות לקראת השלב נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער את זיהום מיקרוביאלי פוטנציאל, להשתמש DDH 2 O בכל השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העובר הוא קבוע, לשאוב את הפתרון מקבע ועושה כראוי כמו פסולת כימית. מלאו את המנה עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, בעזרת סכין microdissection, לחתוך ריבוע סביב העובר להסיר ממברנות extraembryonic. הסר סיכות חרקים עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיכות הוסרו, להשתמש סוף קהה פיפטה פסטר להעביר את העובר כדי בקבוקון המכיל scintillation עם PBT (PBS pH 7.4, טריטון X 0.5%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העובר עם PBT, 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBT מבקבוקון הנצנץ, ולהחליף PBTx המכיל 0.3% H 2 O 2 כדי להשבית peroxidase אנדוגני פוטנציאליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 ב RT על nutator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם העובר PBT, 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3 פעמים במשך 30 דקות כל אחד. </li></ol> חלק 3: דגירה נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים את העובר עם נוגדנים, להתחיל לשטוף את העובר במשך שעה אחת במאגר חסימה או 1% BSA / NGS 1% / PBT (אנו משתמשים NGS כי נוגדנים משני גדל עז). לדגור על nutator למשך שעה אחת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן העיקרי 01:01 במאגר חוסם, ואת העובר דגירה בפתרון זה עבור 2 ימים 4 ° C על nutator. הגורם העיקרי דילול נוגדן תלוי בבחירת הנוגדן הראשוני. כאן, אנו משתמשים נוגדן מן התפתחותית מחקרים Hybridoma הבנק, אשר כאמור supernatent. אנו לדלל אותה 01:01 בחסימת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, לבצע 3 10 דקות שוטף ב PBT, ואחריו 3 1 שעות שוטף של PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, לדלל את הנוגדן 1:2500 משני חיץ חוסם (במקרה זה peroxidase מצומדות-עיזים אנטי עכבר IgG (H + L), ו העובר דגירה בפתרון זה O / N ב 4 ° C על nutator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו 3 10 דקות שוטף ב PBT, ואחריו 3 1 שעות שוטף ב PBT. </li></ol> חלק 3: תגובת צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפתח את התגובה צבע של העובר מוכתם, תחילה לבצע 2 20 דקות שוטף של טריס חיץ (100mm טריס HCl, pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים לפזר מצע DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride) ב טריס חוצץ ב 500μg/ml מתחת למכסה המנוע קטר; לשמור על פתרון בחושך, על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר האחרון לשטוף טריס חיץ מן העובר בקבוקון המכיל ולהחליף פתרון DAB 5 מ&quot;ל משלב 3.2. שמור בחושך על nutator עבור 20 mn. השלך Eppendorf קצה בדלי המכיל פתרון אקונומיקה 10% על מנת לטהר DAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין המניה 0.3% H 2 O 2 ב DH 2 O על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מניות 50μl H 2 O 2 ל בקבוקון המכיל עוברים DAB. שמור בחושך. אחרי 1-2 דקות, לפקח התגובה תחת מיקרוסקופ. </li></ol> חלק 4: עיבוד העובר על צילום היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התגובה צבע הושלמה, להיפטר DAB בדלי אקונומיקה. החלף עם 5 מ&quot;ל מים מהברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 2 10 דקות שוטף ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תהליך הצילום חתך שעווה, מייבשים בסדרה אתנול (25%, 50%, 75% ו 100%) במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את אתנול עם 0.5-1 מ&quot;ל שמן עץ הארז (זה יהפוך את השקוף העובר). תהליך לצילום בשמן עץ ארז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הצילום, לחזור אל העובר בקבוקון ולהחליף את שמן עץ ארז עם 100% אתנול. חזור על שלב אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף דוארthanol עם FCF 5% ירוק מהיר ב 100% אתנול, ו דגירה במשך 3 דקות (שלב זה יגרום עוברים גלוי עבור היסטולוגיה). החלף פתרון מהיר ירוק FCF עם 100% אתנול ו תהליך היסטולוגיה. </li></ol> נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="איור 2" width="600" height="498" /> בדוגמאות להלן, עוברים הם גזור בשלבים HH 10 (א), 12 (ב) ו -11 (ג); עוברים להראות ביטוי PAX 7 ב crestas עצביים המתעוררים גם somites ו בצינור העצבי (A, B); ב (ג), notochord התווית 15.3B9 (לא-1) (נוגדנים הניתנים על ידי התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק).

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בביצוע כל הר מכתים נוגדן בעוברים אפרוח צעיר. פרוטוקול זה משמש בעיקר לאפיון במרחב ובזמן של נוגדנים הרומן חומוס 2,3, כמו גם לשימושם של סמנים antigenic ידוע כדי לקבוע מומים עובריים הבאים להעליב 4.

<table><tbody><tr><td>ביצים</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td>מופיות, HH4 (16 שעות)</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 או דומה</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור אוטומטי Marsh</td><td>אחר</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מעוקלת (1)</td><td>כלי</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה (2)</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות פלסטיק</td><td>כלי</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>נורית גומי</td><td>כלי</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת קפילרה של פסטור</td><td>כלי</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>קצה מעוגל באמצעות להבה</td></tr><tr><td>סכין מיקרו-דיסקציה</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>משמש לחיתוך העובר מהממברנות הסובבות לאחר קיבוע</td></tr><tr><td>סוכן הקשחה ובסיס של Sylgard 184 Silicon Elastomer</td><td>ריאגנט</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>ערבב חלק אחד של סוכן הקשחה עם 9 חלקים של בסיס; השאר למשך הלילה ב-37C</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>ריאגנט</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>ריאגנט</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים</td><td>ריאגנט</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>עבור נוגדנים אלה, החוקרים השתמשו בתורמים מעכברים</td></tr><tr><td>נוגדן Goat Anti-Mouse IgG (H+L) מצומד לפרוקסידאז</td><td>ריאגנט</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride</td><td>ריאגנט</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>יש להוסיף ב-20-; יש להמתין עד שהבקבוק יגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>שמן עץ ארז</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>סיכות Minuten בקוטר 0.2mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי הנוגדן בפיתוח, המוח צינור somite עצביים. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים מכתים כל הר נוגדנים באמצעות נוגדנים HRP משני מצומדות: ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. Peroxidase שנית, אנדוגני הוא מובטל, העובר חשוף ואז נוגדן ראשוני. לאחר מספר שוטף, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים משני מצומדות כדי HRP. פעילות peroxidase מתגלה באמצעות תגובה עם המצע diaminobenzidine. לבסוף, העובר מקובע ומעובד צילום חתך. היתרון של שיטה זו על השימוש של נוגדנים ניאון היא כי עוברי יכול להיות מעובד על חתך שעווה, ובכך לאפשר לימוד של אתרי אנטיגן חתך. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג&#39;יין דוד וטום Jessell<sup&gt; 1</sup&gt;.

וידאו זה מדגים כל הר אימונוהיסטוכימיה, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של אנטיגן ניתן דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג&#39;יין דוד וטום Jessell.

עובר האפרוהו הוא כלי בעל ערך בחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. השקיפות שלו, הנגישות והקלות שבה ניתן למניפולציה, הופכות אותו ל...

סרטון זה מדגים את השלבים השונים של אימונוהיסטוכימיה של עובר שלם (whole Mount immunohistochemistry) בעובר של אפרוח תוך שימוש בנוגדנים שניתים המצומדים ל-HRP. ראשית, העובר מקובע ב-para formaldehyde. לאחר מכן, פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית מושתקת.לאחר מכן מדגירים את העובר בנוגדן ראשוני. לאחר מספר שטיפות, מדגירים את העובר בנוגדן שני המצומד ל-HRP. תגובת הצבע נחשפת באמצעות מצע DAB, וצביעת הנוגדנים מופיעה בצבע כתום. היתרון של שיטה זו על פני שימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים הוא שניתן להכין את העוברים לחיתוך בפרפין, ובכך לאפשר את חקר אתרי האנטיגן בחתך רוחב.שלום, אני דלפין ממעבדת FIN במרכז לרפואה סביבתית וגנומית ב-Texas A&M ביוסטון. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע צביעות נוגדנים בשיטת hormone mount בעוברי דג זהב (cheek embryos) באמצעות נוגדנים המצומדים ל-HRP. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את מורפולוגיית העוברים לאחר טיפול בתרופות אנטי-אפילפטיות.בואו נתחיל בביצוע אימונוהיסטוכימיה של דגימה שלמה (whole mount) בעוברי אפרוח. ראשית, פתחו ביצה על ידי הקשה על הקליפה באמצעות פינצטה והסרה של חלקי קליפה. הסירו את האלבומין העבה בעזרת פינצטה והטו את שק החלמון באמצעות פינצטה גסה כך שהעובר יפנה כלפי מעלה.בשלב הבא, השתמשו במספריים עדינים כדי לגזור ריבוע של שק החלמון סביב העובר. הוציאו את העובר מהחלמון בעזרת כפית והניחו אותו בצלחת המכילה PBS תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הסירו בזהירות את הממברנות מהחלמון והעבירו את העובר לצלחת נקייה המכילה PBS.לאחר העברת העובר, קבעו את העובר באמצעות פינצטה וסיכות לחרקים ושאבו את ה-PBS. החליפו זאת ב-4% PFA ב-PBS והניחו לעובר להיקבע למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי למזער זיהום מיקרוביאלי פוטנציאלי. השתמשו ב-H2O דה-יוני בכל השלבים הבאים; לאחר קיבוע העובר, שאבו את תמיסת הקיבוע והשליכו אותה כראוי כפסולת כימית.מלאו את הצלחת ב-BS. לאחר מכן, בעזרת סכין למיקרו-דיסקציה, חתכו ריבוע מסביב לעובר כדי להסיר קרומים חו-עובריים עודפים. הסירו את סיכות החרקים באמצעות פינצטה לאחר שסיכות הובדלו. השתמשו בפיפטת פסטור בעלת קצה קהה כדי להעביר את העובר לבקבוק סינטילציה המכיל PBT.שטפו את העובר עם PBT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. הסירו את ה-PBT מבקבוק הסינצילציה והחליפו אותו ב-PBTX המכיל 0.3%H 2 0 2 על מנת לנטרל פריקסידאז אנדוגנית פוטנציאלית. הדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על מכשיר ערבוב (mutator).שטוף את העובר ב-PBT תחילה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן שלוש פעמים למשך 30 דקות בכל פעם. לצביעת העובר בנוגדן, התחל בשטיפת העובר למשך שעה אחת בבופר חסימה (blocking buffer) או ב-1%BSA 1%NGS.אנו משתמשים ב-NGS מכיוון שהנוגדן המשני הופק מעז. דגרו במכשיר mutator למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, דללו את הנוגדן הראשוני ביחס של אחד לאחד בבופר חסימה ודגרו את העובר בתמיסה זו למשך יומיים ב-4 °C. במכשיר mutator.גורם הדילול של הנוגדן הראשוני תלוי בבחירת הנוגדן הראשוני. כאן אנו משתמשים בנוגדן מבנק ההיברידומות DOMA למחקרי התפתחות, המסופק כתחליב על (supernatant). אנו מדללים אותו ביחס של אחד לאחד בבופר חסימה.לאחר מכן, בצעו שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות ב-PBT, ולאחריהם שלושה שלבי שטיפה של שעה אחת ב-PBT. לאחר השטיפה, דללו את הנוגדן המשני ביחס של 1:2,500 בתמיסת חסימה. במקרה זה, השתמשו ב-goat anti-US IgG המשורשר ל-peroxidase והדגיפו את העובר בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C על שייקר.בצעו שלושה שטיפות של 10 דקות ב-PBT, ולאחריהן שלושה שטיפות של שעה אחת ב-PBT כדי לפתח את תגובת הצבע של העובר הצבוע. בצעו שתי שטיפות ראשונות של 20 דקות בבופר tris של 100 millimolar tris, HCL pH 7.4. לאחר מכן, הסירו את שטיפת בופר ה-TS האחרונה מהמבחנה המכילה את העובר והחליפו אותה בחמישה milliliters של תמיסת DAB.השאירו את הדגימה בחושך במכשיר ה-mutator למשך 20 דקות. השליכו את טיפ ה-einor לדלי המכיל תמיסת אקונומיקה בריכוז 10%. כדי לחטא את ה-DAB, הוסיפו 16 µL.הוסף H₂O₂ למבחנה המכילה את העוברים ב-DAB. שמור את המבחנה בחושך. לאחר 10 דקות, עקב אחר התגובה תחת מיקרוסקופ עד להשלמת תגובת הצבע. השלך את ה-DAB לדלי עם אקונומיקה, והחלף אותו בחמישה מיליליטרים.מי ברז. לאחר מכן, בצע שני שלבי שטיפה של 10 דקות ב-PBS לצורך עיבוד לצילום וחיתוך בפרפין. התייבש את העובר הצבוע בסדרת אתנול, 25% 50% 75% ו-100% למשך 10 דקות כל אחת.לאחר הדהידרציה, החליפו את האתנול ב-0.5 עד 1 מיליליטר של שמן ארז (cedarwood oil). פעולה זו תהפוך את העובר לשקוף לצורך צילום בשמן ארז. לאחר הצילום, החזירו את העובר לבקבוקון והחליפו את שמן הארז ב-100% ethanol.לבסוף, החליפו את האתנול ב-5% fast green FCF ב-100% ethanol והדגירו למשך שלוש דקות. שלב זה יגרום לעובריו להיות גלויים לצורך היסטולוגיה. החליפו את תמיסת ה-fast green FCF ב-100% ethanol והמשיכו בעיבוד להיסטולוגיה.להלן שלוש דוגמאות של עוברים צבועים. עוברים אלו, בשלב 11, מסומנים עם 15.3 B תשעה או לא. אחד, נוגדן ספציפי לחבל הנודאלי (nodal cord) שפותח במעבדה של Jane dod ו-Tom Gessel.לאחר שתי דקות ב-DAB, העובר עדיין שקוף. לאחר 20 דקות ב-DAB, מופיע סימון קל בחוט הצומת (nodal cord). לבסוף, לאחר 40 דקות, הסימון של חוט הצומת מושלם.בדוגמה זו, אנו מראים כיצד PAC seven, נוגדן שפותח במעבדתו של Tom Jessel, מזהה שלבים מוקדמים של סגירת צינור העצבים, כמו גם תאי רב-עצביים קרניאליים המגיעים מהמוח האמצעי. כאן העובר סומן באמצעות פרובה של Croc 20 ממעבדתו של David Wilkinson, ולאחר מכן בנוגדן אחד. הרגע הראינו לכם כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה של עוברים שלמים.ניתן להשתמש בפרוצדורה זו גם בעוברים שעברו עיבוד מוקדם עבור היברידיזציה במקום (in situ hybridization) של דגימה שלמה. במקרה זה, קבעו את העובר לזמן קצר של שעה אחת לאחר ההיברידיזציה במקום, ולאחר מכן המשיכו לצביעה בנוגדנים. וזהו.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

method-for-whole-mount-antibody-staining-in-chick

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

סרטון זה מתאר את טכניקת הצביעה האימונוהיסטוכימית לזיהוי תאים דנדריטיים מביופסיות אנדוברונכיאליות.

צביעה אימונוהיסטוכימית: שיטה לקבלת מידע מרחבי מקטעי רקמה דקה

סרטון זה מדגים טכניקת לוקליזציה אימונופלואורסצנטית in vivo (IVIL) לחקר ההתפלגות הביולוגית של נוגדנים ממוקדי גידול במודל מורין של סרטן השד. עם הזרקה תוך ורידית של נוגדן ספציפי לגידול בעכבר, הגידול מבודד בניתוח, והמיקום של הנוגדן בתוך רקמת הגידול מאושר באמצעות חיסון ex vivo.

שיטת לוקליזציה של In Vivo Immunofluorescence לחקר הפצה ביולוגית של נוגדנים

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

מאמר וידאו זה מדגים פרוטוקול מקיף לאיתור וכימות של כל שלבי הנוירוגנזה של ההיפוקמפוס במבוגרים באותו קטע רקמה. פיתחנו שיטה להתגבר על המגבלות של אימונופלואורסצנציה מרובה עקיפה המתעוררת כאשר נוגדנים מתאימים ממינים מארחים שונים אינם זמינים.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את הפלישה של תאי גידול לחיים שברי רקמה נורמלים בשלושה ממדים. טכניקת תרבות איבר זה מיושמת בעיקר כדי לבדוק את התרופות שעלולים להיות אנטי-פולשני במבחנה.

חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית

טכניקות מתוארים כדי immunostain-אפיטופים phospho כולן עוברי דג הזברה ולאחר מכן לנהל לוקליזציה confocal ניאון בשני צבעים במבנים הסלולר קטן כמו cilia העיקרי. טכניקות לתיקון והדמיה יכול להגדיר את המיקום ואת קינטיקה של המראה או הפעלה של חלבונים ספציפיים.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

גישה הר שלמה אימונוהיסטוכימי, כדי לחזות ביטוי חלבון neurofilament במערכת מרה מרהיב סונקוס murinus. מוצג כאן. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים בס מורינוס או מינים אחרים.

באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה<em&gt; סונקוס מורן</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוגדן הפלורסנט בתיווך זיהוי של חלבונים בהכנות שלמות של עוברי הדגים והזחלים.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

למד את שיטת מכתים נוגדן שלם הר בצ'יק להדמיית ביטוי אנטיגנים בעוברים צעירים באמצעות נוגדנים מצומדים ל-HRP. השיטה מאפשרת חתכי שעווה וניתוח היסטולוגי מפורט של אתרי האנטיגן.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

גלה סרטונים נוספים