Name: בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: למדו לבודד ולגדל נוירוני גרגיר מוח קטן מעכברים לאחר הלידה באמצעות פאפאין ומדרגת פרקול. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים ותפקודם במודלים של מחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ברברה קארלטי אנה מארי קני הצעות שלא יסולא בפז. HYL נתמך על ידי מענק הכשרה &quot;הורמונים: לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית&quot;, DK07328. נתמך בחלקו על ידי מענק 5R01-NIH NS16951 (רמ&quot;א).

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system%3A+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).</li>
<li>Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatten%2C+ME+%22in+Culturing+Nerve+Cells%22">in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).</li>
<li>Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).</li>
<li>Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).</li>
<li>Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).</li>
<li>Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).</li>
<li>Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).</li>
<li>Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).</li>
<li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalay%2C+SL+%22Cerebellar+Cortex%3A+Cytology+and+Organization%22">Cerebellar Cortex: Cytology and Organization</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).</li>
<li>Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).</li>
<li>Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).</li>
<li>Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).</li>
<li>Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).</li>
<li>Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).</li>
<li>Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).</li>
<li>Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).</li>
</ol>

פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של נהלים אשר תוארו 3,7,11 האחרונות. ישנן מספר נקודות חשובות לציין כמפורט להלן. הנוירונים גרגיר ו ובתאים לדבוק בתוך 2 שעות של ציפוי. בתאים בריאים יש מורפולוגיה עגול תחת 4 שלב הניגוד מיקרוסקופ. תוך 24 שעות לאחר ציפוי, תאים בריאים יתפשט באופן שווה סביב coverslips או גם פלסטיק יהוו תהליכים. בעת שינוי המדיום הראשון, לאחר 24 שעות, יהיה מספר תאים צפים מתים. זה נורמלי, כמו מספר תאים ימותו או יהיו בריאים במהלך תה...

<table><tbody><tr><td>מסנן תאים עם נקבוביות רשת של 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>מחט שדרה</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 inches</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine במשקל מולקולרי &amp;gt;300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>יש לבחון כל מנה חדשה של Poly-D-Lysine.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייסין (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>חייב להיות נקי מסידן וממגנזיום.</td></tr><tr><td>מדיום Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>תוסף Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27 נטול סרום (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי עגולות בקוטר 12-mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>מיוצרות בגרמניה על ידי Deckgluder.</td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי עגולות בקוטר 25-mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>מיוצרות בגרמניה על ידי Deckgluder.</td></tr><tr><td>מערכת לפירוק באמצעות פאפאין (Papain Dissociation System)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>הערכה מספיקה לחמש בידודים.</td></tr><tr><td>מספרי Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumont #5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית בעלת 4 בארות</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית בעלת 6 בארות</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר neuron ובתאים ונוירונים

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

קליפת המוח הקטן הוא מבנה תיאר היטב המספק הזדמנויות ייחודיות ללימוד המאפיינים עצב 1,2 פיתוח. סוגי נוירונים המוח הקטן (תאים גרגיר, תאים פורקינג&#39; ו interneurons מעכבות), גרגיר נוירונים הם ללא ספק רבים ביותר הן הסוג הנפוץ ביותר של הנוירונים במוח היונקים. במכרסמים, הנוירונים גרגיר cerebellar נוצרות במהלך שני הראשונים שלאחר הלידה שבועות ובתאים בשכבה החיצונית של קליפת המוח הקטן, את השכבה החיצונית גרגיר (EGL). הפרוטוקול המובא כאן מתאר טכניקות להעשיר גרגיר נוירונים תרבות ובתאים שלהם המוח הקטן שלאחר הלידה העכבר. נתאר הליכים כדי להשיג תרבויות של טוהר הגדלת 3,4, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הבידול של מתרבים ובתאים לתוך הנוירונים גרגיר 5,6. לאחר ובתאים להבדיל, התרבויות גם לספק אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים גרגיר מניפולציה אפיון ניסיוני של תופעות כגון synaptogenesis, פונקציה קולטן הגלוטמט 7, אינטראקציה עם תאים אחרים cerebellar מטוהרים 8,9 או מוות של תאים 7.

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

קליפת המוחדשברה (cerebellar cortex) היא מבנה המתואר היטב המספק הזדמנויות ייחודיות לחקר תכונות ופיתוח של נוירונים1,2. מתוך ה...

הליך זה מתחיל בהסרת המוחון מעכברים בשלבי התפתחות P4 עד P5. קרומי המוח והמקלעת הדמוית רשת (choroid plexus) מוסרים ממוחות קטנים של עכברים רכים, ואלו נאספים לאחר מכן לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. המוחונים עוברים דיסוציאציה באמצעות פפאין ומוביאים למצב של תרחיף של תאים בודדים באמצעות טריטורציה עדינה.מתחלה זו מסוננת בכבידה דרך רשת ניילון עם גודל נקבים של 70 micron. הנוזל שעבר סינון מונח בעדינות מעל מדרג perca לא רציף ועובר צנטריפוגציה כדי להפריד את תאי הגרנולות מהגליה לתאי עצבים ולתאי עצבים מסוג Perkin gene. תאים בממשק של המדרג נאספים ומועברים לצלחות מצופות poly de lycine.כדי להסיר את התאי הגליא进一步, תאי הגרנול נאספים, נספרים ונזרעים בצפיפויות הרצויות על לוחות כיסוי מזכוכית או פלטות תרבית מפלסטיק מצופות poly-D-lysine. שלום, אני hey young Lee מהמעבדה של ד"ר Lloyd Green במחלקה הפתולוגית באוניברסיטת קולומביה. היום נראה לכם פרוצדורה לבידוד ותרבית של נוירוני גרנול מהמוח הקטן של עכברים לאחר הלידה.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור התרבות והתמיינות של תאי פרוגניטור עצביים של גרנולות. בואו נתחיל. פרוצדורה זו מתחילה בשימוש ב-70% ethanol באזור הדיסקציה; כדי להפריד את תאי הגרנולות של הדماغ הקטן, אנו משתמשים במערכת ההפרדה Papin.בעת התחלת שימוש בערכה חדשה, הכינו את תמיסת מעכב albumin OVO equate MOID. לשם כך, קחו 32 milliliters של תמיסת מלחים מאוזנת של Earl (EBSS), המסופקת בערכה, והוסיפו אותה לתערובת albumin OVO moid. הניחו לה בצד בזמן הכנת הרכיבים האחרים כדי לאפשר לתכולה להתמוסס.בשלב הבא, הוסיפו חמישה מיליליטר של EBSS למבחנה אחת של פפאין מהערכת הדיסוציאציה. כל מבחנה מספיקה לדיסוציאציה של ארבעה עד 15 מוחיות קטנים (cerebella) מעכברים בגיל P5. לאחר מכן, הניחו את מבחנת הפפאין באינקובטור ב-5% CO₂ ובטמפרטורה של 37 °C למשך חמש עד 10 דקות, עד שהפפאין מומס לחלוטין והתמיסה נראית צלולה.שמור את התמיסה בטמפרטורת החדר במהלך הניתוח. לאחר מכן, הוסף 500 µL של EBSS למבחנת 1D NAS מהערכה. ערבב בעדינות על ידי הקשה על המבחנה.כיוון ש-DNAS רגיש לדנטורציה כתוצאה מכוחות גזירה, הוסף 250 µL של תמיסה זו למבחנה עם הפפאין כדי להגיע לריכוז סופי של 20 units/ml ו-0.005% DNA, ושמור את שאר מלאי ה-DNA לשימוש בשלבים מאוחרים יותר. לאחר שהכלים והריאגנטים מוכנים, המשך בהסרת הקרומים מהמוחון ובביצוע הניתוח עבור הליך זה. למחקר נעשה שימוש בעכברי C 57 black six בגילאי 4 עד 6 ימים לאחר הלידה.טווח גילאים זה הוא האופטימלי לתרבית של תאי גרנול (granule cells), מכיוון שמספר תאי הפרוגניטור של תאי הגרנול בשכבת הגרנול החיצונית (EGL) נמצא בשיאו. התחל בהעברת 15 milliliters של HBSS glucose לכלי תרבית רקמות מפלסטיק בקוטר 60 millimeter ו-10 milliliters לשפופרת קונית סטרילית של 15 milliliter. הנח את השפופרת על קרח, ונגב את ראשו של הגור עם 70%ethanol. השתמש במספריs כדי להסיר את הראש.העבירו את הראש אל תוך המנדף והחזיקו אותו בעזרת פינצטה כך שגב הגולגולת גלוי בבירור. הכניסו את מספרי המיקרו-דיסקציה אל תוך ה-foramen magnum כדי לגשת למוח, ולאחר מכן גזרו בקו ישר לכיוון העיניים. השתמשו בפינצטת Dumont עדינה.מספר חמישה, פינצטה לקילוף העור והרמת הגולגולת כדי לחשוף את המוח. לאחר מכן, קטע את cerebellum ואת המוח האמצעי (midbrain) שסביבו. העבר אותם לצלחית המכילה HBSS glucose.שימו לב כי קל יותר לתמרן את cerebellum ולהסיר את הקרומים (meninges) כאשר ה-cerebellum עדיין מחובר לרקמה הסובבת אותו. לאחר מכן, הניחו את הרקמה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן, השתמשו בסט פינצטות אחד כדי לקבע את ה-cerebellum לפלטה.השתמשו בפינצטה מסוג דומון (Dumont) עדינה, מספר 5, כדי לקלף בעדינות את הקרומים מהמוחון וכן בין האונות. תוכלו להבחין בכלי דם על פני השטח של המוחון.כלי דם אלו מהווים דרך טובה לזיהוי הקרומים. המשך להסיר את הקרומים עד שהמוחון יקבל מראה לבן וסבוך. לאחר מכן, הפרד את המוחון משאר הגבעול המוחית.הפכו אותו על צדו הבטני והסירו את הפלקסוס הכורואידי (choroid plexus), הנראה כסרט אדמדם בין המוחון הבטני למוח האמצעי הסמוך. מיד לאחר דיסקציה של המוחון, העבירו אותו ל-HBSS glucose קר בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר על קרח. לאחר ביצוע דיסקציה לשלושה מוחות, החליפו את תמיסת הדיסקציה ב-HBSS glucose טרי.ככל שתתרגלו יותר לניתוח של הדגימות מהמוח הקטן, נסו לקצר את זמן הניתוח כך שלא יעלה על שש דקות לגור. עם סיום הניתוחים, המשיכו להכנת תרחיף התאים. שלב ליצירת תרחיף תאים מהניתוחים של המוח הקטן.ראשית, הסירו את ה-HBSS glucose מהמבחנה והחליפו אותו בתמיסת papain. למרות שהערכה ממליצה לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות, מצאנו שאין בכך צורך בגיל זה. הניחו את הרקמה ותמיסת ה-papain באינקובטור 5%CO 2 בטמפרטורה של 37 מעלות למשך 15 עד 20 דקות.עבור ארבעה עד שמונה מוחיות דגנים (cerebella), דגרו למשך 15 דקות. עבור מספר גדול יותר, דגרו עד חצי שעה. נערה בעדינות את המבחנה מדי שלושה עד ארבעה דקות.בסיום הדגירה, התחל בשלב הציפוי: טבל טיפ של פפיטת אווירוזול P 1000 סטרילית ב-FBS על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) פעמיים. כעת, ערבב את התערובת. הקפד לבצע את השאיבה בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.כ-10 תנועות מעלה ומטה עם הפ pipette מספיקות כדי לפרק את הרקמה. התמיסה צריכה להפוך לעכורה. יש להמתין 30 עד 60 שניות כדי ששברים גדולים של רקמה שלא התפרקה ישקעו לתחתית המבחנה.למרות שניתן להשתמש בפיפטות זכוכית שעברו ליטוש באש לצורך העברה, מצאנו שטיפים סטריליים של P 1000 מצופים בסרום עובדים באותה מידה. כעת, העבירו את התאים התלויים למבחנה קונית נקייה של 15 mil באמצעות טיפ פיפטה מצופה בסרום, תוך הקפדה לא להוציא את שרידי הרקמה הבלתי קשורים שבתחתית. לאחר מכן, סובבו את תגלי התאים בצנטריפוגה במהירות של כ-200 G למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר במהלך הסרבוגציה, הכין את תמיסת הסספנסיות של ה-resus. לשם כך, הוסף 2.7 milliliters של EBSS למבנה סטרילי. לאחר מכן, הוסף 300 microliters של תמיסת מעכב albumin OVO MOID משוחזרת.לבסוף, הוסיפו 150 µL מתמיס ה-DNA. עם סיום הסנטריפוגה, השליכו את על-משקע התמיסה (supernatant) והשעיכו באופן מיידי את משקע התאים בתמיסת מעכב ה-DNA-albumin המדוללת. שוב, השתמשו בקצה פפטה מצופה בסרום כדי להשעיך את המשקע.כעת הכינו מדרג צפיפות לא רציף. לשם כך, הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת מעכב MOID של albumin oval למבחנה קונית של 15 מיליליטר. שכבדו את תרחיף התאים מעל התמיסה על ידי הוספה עדינה של התאים לאורך דופן המבחנה, ולאחר מכן סבבו במערך צנטריפוגה בכ-70 G למשך שש דקות.בטמפרטורת החדר, התאים שהופרדו ישקעו לתחתית הפרונט, בעוד ששברי הממברנה יישארו בממשק. אם ברצונך לקבל תרביות המועשרות בתאי גרנולה, אין צורך בניקוי נוסף. השלך את הנוזל העליון (SUP natant) ותלה את המשקע באופן מיידי בארבעה מיליליטרים של מצע 10%FBS עם 50 microliters של DNAs.סננו תרחף זה בכבידה דרך רשת ניילון בנקבים בגודל 70 microns. שלב זה מסיר תאים גדולים שאינם תאי עצב ומאפשר קבלת תרחף תאים בודדים איכותי יותר. לאחר מכן, דלגו על שלב הפרדת המדרג (gradient separation) הבא ועברו לשלב זריעת התאים.או אם ברצונכם לטהר עוד יותר את תאי הגרנול מהגליות ומנוירונים בינוריים גדולים, המשיכו לשלב של מעבר בגרדיאנט של Percoll. השליכו את העלייה ותלה את המשקע באופן מיידי בשני מיליליטר של HBSS glucose עם 50 microliters של DNase.שנית, סננו את התוךית דרך רשת ניילון. לפני תחילת ההפרדה בגרדיאנט Percoll, הכינו שתי פיפטות פסטור מלוטשות באש. חממו בעדינות את קצה הפיפטה בלהבה עד שהקצה יהיה חלק וקוטר פתח הפיפטה יהיה כחצי מגודלו המקורי. היזהרו לא להקטין את הפתח יותר מדי.כעת הכינו את מדרג הריכוזים של per call. העבירו 10 mils של תמיסת per call בריכוז 35% לפרועת קונית סטרילית של 50 mil. לאחר מכן, טענו 10 mils של per call בריכוז 60% למזרק סטרילי של 10 mil עם מחט ספינלית סטרילית מחוברת אליו.שכבב בעדינות את תמיסת ה-60%per call מתחת לתמיסת ה-35% על ידי הבאת קצה המזרק למגע עם תחתית המבחנה. הקפד לשמור על ממשק חד בין שתי השכבות. לאחר מכן, הוסף את התאים לחלק העליון של המדרג.בעזרת פיפט שעבר ליטוש באש, הוסף בעדינות את התאים לאורך דופן המבחנה מבלי להפריע לממשק. לאחר שכבת התאים הונחה, מקם את המבחנה בזהירות בצנטריפוגה. התחל את הסבוב במהירות של כ-18 G. הגבר את המהירות בצעד אחד בכל 20 שניות, כך שייקח כשתי דקות להגיע ל-1800 G. לאחר 10 דקות במהירות של 1800 G, הפחת את המהירות בהדרגה בצעד אחד בכל 20 שניות.עם סיום הסבוב, הסירו את הממשק העליון של הגרדיאנט והשליכו אותו. ממשק זה מכיל תאי ggl bikini גדולים ונוירונים משפיעים (inter neurons). לאחר מכן, השתמשו בפיפטה שעברה פליימינג (fire polished) כדי להסיר בזהירות את התאים שבממשק.העבירו את התאים לאنبוב של 50 mil. אם הנפח גדול מ-15 mils, פצלו אותם לשני אנבובי 50 mil וסספנדו מחדש בשלושה נפחים של HB S'S glucose וערבבו על ידי היפוך מספר פעמים. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1100 G. כעת הסירו את העילם והוסיפו ארבעה mils של מצע המכיל 10% FBS ו-50 microliters של D ns reus.ששפפו בעדינות את המשקע באמצעות פיפט מלוטש באש כדי ליצור תרחיף תאים בודדים. לאחר הששפופ התאים, המשיכו בשלב הפריקה (prepl). פריקו את התאים שנאספו על צלחת מצופה פולי-ליזין למשך 20 דקות.באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5%CO2. במהלך הדגירה, האסטרוגליה והתאים הכבדים יותר ישקעו וייהדבקו למנות, בעוד שתאי עצבי גרנולר קטנים ותאי אב לעצבים יישארו צפים או מחוברים באופן רופף. לאחר 20 דקות, הקישו בעדינות על המנה כדי לשחרר תאי גרנולר שהידבקו באופן רופף.לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לפלטה חדשה מצופה ב-poly-D-lysine וחזרו על הדגירה. לאחר מכן, אספו את נוירוני הגרנולה ואת תאי הפרוגניטור של הנוירונים לשפופרת קונית של 15 ml וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 200 G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-1 ml של מצע ללא C וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.לבסוף, הוסיפו מצע ללא סרום כדי להגיע לצפיפות התאים הרצויה לזריעה בצפיפות בינונית. עבור פלטות בעלות שישה בארות, השתמשו בערך ב-3.5 עד 4 מיליון תאים עבור פלטות בעלות ארבעה בארות.השתמשו ב-650,000 תאים. שמרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות עם 5%CO2. החליפו את המצע באופן מלא 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית, ולאחר מכן בכל יומיים עד שלושה ימים.להלן מספר תמונות של תרביות בריאות של נוירונים גרנולריים ותאי אב. 24 שעות לאחר הזריעה ושישה ימים לאחר הזריעה. ניתן לשמר תאים אלו בתרבית למשך עד שבועיים.שימו לב כי תוך 24 שעות מהזריעה, תאים בריאים יתפשטו באופן אחיד סביב לוחות הכיסוי או באבורי הבור של הפלסטיק וישליחו זקיקים. התגבשות של תאים ונוכחות של התרחבויות (varicosities) על זקיקי התאים מעידות על כך שהתאים אינם בריאים או שהמצע של poly D-lysine הוא רעיל. כפי שניתן לראות בתרשים, תאי פרוגניטור של נוירוני גרנולה מתחילים להבחין את עצמם עם הזריעה ומבטאים סמנים.מייצג את הדיפרנציאציה שלהם. נשכיל לציין כי ניתן להאריך באופן משמעותי את השגשוג של תאי אב של נוירונים גרנולריים על ידי הוספת sonic hedgehog למצע הגידול. ניתן להוסיף למיננין כמצע בנוסף לפוליליזין כדי לעודד צמיחה של ניוריטים.תכונות אלו של תרביות תאי הגרנולה מציעות מערכת לחקר הביולוגיה של נוירוני הגרנולה או הרגולציה של התמיינות תאי פרוגניטור לנוירונים. הרגע הצגנו כיצד לבודד ולתרבת תאי פרוגניטור ונוירונים של תאי גרנולה מהמוח הקטן של עכברי MAO. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי התנובה המשוערת היא 4 2 5 times 10th.מתוך שש תאים לגור וצפיפויות זריעה שיכולות לנוע בין חמש תאים לסנטימטר רבוע. לכן, אם מדלגים על שלב ה-Percoll gradient, שמונה גורי עכבר ביום פוסט-נטלי 5 יכולים לספק מספיק תאים עבור שש פלטות תרבית בעלות ארבעה בארות. בניסיוני, השימוש בשלב ה-Percoll gradient יפחית את תפוקת התאים בכ-25% עד 30%. עם זאת, אחוז הנוירונים הגרנולריים בתרביות עולה מ-90% ל-95% ועד 99%. תאי גרנולה מועשרים שהושגו ללא שלב הפרדת ה-Percoll gradient שימשו למחקר של ויסות השכפול והבידול של תאי פרוגניטור של נוירוני גרנולה. עם זאת, אם התרביות אמורות לשמש מעבר למספר ימים in vitro, מומלץ לכלול את שלב ה-Percoll gradient כדי להפחית את זיהום הנוירונים הגרנולריים על ידי תאים לא-נוירונליים השכפלים.בנוסף, ודאו שהתמיסות המשמשות להכנת מפל ה-per cot הן טריות, שכן באפרינג לא תקין מוביל למוות תאי רב יותר. זהו הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את הטכניקה לבידוד וטיפוח נוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכבר. תאים מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גליה מתרבים ולייצר תרבות טהורה של נוירונים גרגיר cerebellar.

בידוד ותרבית של נוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכבר

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של תאי אב עצביים במוח הקטן של גור עכברים. אבות נוירון גרגיר המוח הקטן מבודדים ומטוהרים באמצעות הידבקות דיפרנציאלית, ומסירים ביעילות אסטרוציטים. אבות מתורבתים אלה מתמיינים לאחר מכן לנוירונים גרגיריים צרבלריים.

בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינותם לתאים עצביים. תאי גזע מתרחיף התא המבודד מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומתורבתים ליצירת נוירוספרות. לאחר מכן הנוירוספרות נשמרות במדיום התמיינות כדי ליצור תאים עצביים.

בידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינות לתאים עצביים

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל פגיעה עצבית בנוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכברים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בגרימת פגיעה עצבית באמצעות NMDA, אגוניסט קולטן נוירוטרנסמיטר מעורר, וגליצין, אגוניסט משותף. NMDA וגליצין נקשרים לקולטנים עצביים ספציפיים, גורמים לגירוי יתר שלהם וכתוצאה מכך זרם סידן תוך תאי מסיבי, מה שמוביל לנזק לתאי עצב ולמוות.

מידול פגיעה עצבית בתאי עצב גרגיריים צרבלריים ראשוניים בעכבר

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

אבות להביע Nestin הם אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של אבות עצביים במוח הקטן מתפתח. שימוש בטכניקת microdissection מוצגת כאן בשילוב עם מיון תא הופעל ניאון, אוכלוסיית תא זו יכולה להיות מטוהרת ללא זיהום מאזורים אחרים של מוח קטנים ויכולה להיות מתורבת למחקרים נוספים.

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

הפגינו כאן היא שיטה יעילה וחסכונית כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל בתאי גזע החומר הלבן מתוך המוח הימני של העכבר.

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

למדו לבודד ולגדל נוירוני גרגיר מוח קטן מעכברים לאחר הלידה באמצעות פאפאין ומדרגת פרקול. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים ותפקודם במודלים של מחלות נוירולוגיות.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

גלה סרטונים נוספים