Name: בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: למדו לבודד ולגדל נוירוני גרגיר מוח קטן מעכברים לאחר הלידה באמצעות פאפאין ומדרגת פרקול. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים ותפקודם במודלים של מחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים ברברה קארלטי אנה מארי קני הצעות שלא יסולא בפז. HYL נתמך על ידי מענק הכשרה &quot;הורמונים: לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית&quot;, DK07328. נתמך בחלקו על ידי מענק 5R01-NIH NS16951 (רמ&quot;א).

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system%3A+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).</li>
<li>Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatten%2C+ME+%22in+Culturing+Nerve+Cells%22">in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).</li>
<li>Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).</li>
<li>Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).</li>
<li>Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).</li>
<li>Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).</li>
<li>Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).</li>
<li>Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).</li>
<li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalay%2C+SL+%22Cerebellar+Cortex%3A+Cytology+and+Organization%22">Cerebellar Cortex: Cytology and Organization</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).</li>
<li>Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).</li>
<li>Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).</li>
<li>Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).</li>
<li>Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).</li>
<li>Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).</li>
<li>Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).</li>
<li>Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).</li>
</ol>

פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של נהלים אשר תוארו 3,7,11 האחרונות. ישנן מספר נקודות חשובות לציין כמפורט להלן. הנוירונים גרגיר ו ובתאים לדבוק בתוך 2 שעות של ציפוי. בתאים בריאים יש מורפולוגיה עגול תחת 4 שלב הניגוד מיקרוסקופ. תוך 24 שעות לאחר ציפוי, תאים בריאים יתפשט באופן שווה סביב coverslips או גם פלסטיק יהוו תהליכים. בעת שינוי המדיום הראשון, לאחר 24 שעות, יהיה מספר תאים צפים מתים. זה נורמלי, כמו מספר תאים ימותו או יהיו בריאים במהלך תה...

<table><tbody><tr><td>מסנן תאים עם נקבוביות רשת של 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>מחט שדרה</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 inches</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine במשקל מולקולרי &amp;gt;300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>יש לבחון כל מנה חדשה של Poly-D-Lysine.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייסין (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>חייב להיות נקי מסידן וממגנזיום.</td></tr><tr><td>מדיום Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>תוסף Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27 נטול סרום (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי עגולות בקוטר 12-mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>מיוצרות בגרמניה על ידי Deckgluder.</td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי עגולות בקוטר 25-mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>מיוצרות בגרמניה על ידי Deckgluder.</td></tr><tr><td>מערכת לפירוק באמצעות פאפאין (Papain Dissociation System)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>הערכה מספיקה לחמש בידודים.</td></tr><tr><td>מספרי Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה Dumont #5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית בעלת 4 בארות</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית בעלת 6 בארות</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר neuron ובתאים ונוירונים

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

קליפת המוח הקטן הוא מבנה תיאר היטב המספק הזדמנויות ייחודיות ללימוד המאפיינים עצב 1,2 פיתוח. סוגי נוירונים המוח הקטן (תאים גרגיר, תאים פורקינג&#39; ו interneurons מעכבות), גרגיר נוירונים הם ללא ספק רבים ביותר הן הסוג הנפוץ ביותר של הנוירונים במוח היונקים. במכרסמים, הנוירונים גרגיר cerebellar נוצרות במהלך שני הראשונים שלאחר הלידה שבועות ובתאים בשכבה החיצונית של קליפת המוח הקטן, את השכבה החיצונית גרגיר (EGL). הפרוטוקול המובא כאן מתאר טכניקות להעשיר גרגיר נוירונים תרבות ובתאים שלהם המוח הקטן שלאחר הלידה העכבר. נתאר הליכים כדי להשיג תרבויות של טוהר הגדלת 3,4, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הבידול של מתרבים ובתאים לתוך הנוירונים גרגיר 5,6. לאחר ובתאים להבדיל, התרבויות גם לספק אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים גרגיר מניפולציה אפיון ניסיוני של תופעות כגון synaptogenesis, פונקציה קולטן הגלוטמט 7, אינטראקציה עם תאים אחרים cerebellar מטוהרים 8,9 או מוות של תאים 7.

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

קליפת המוחדשברה (cerebellar cortex) היא מבנה המתואר היטב המספק הזדמנויות ייחודיות לחקר תכונות ופיתוח של נוירונים1,2. מתוך ה...

הליך זה מתחיל בהסרת המוחון מעכברים בשלבי התפתחות P4 עד P5. קרומי המוח והמקלעת הדמוית רשת (choroid plexus) מוסרים ממוחות קטנים של עכברים רכים, ואלו נאספים לאחר מכן לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. המוחונים עוברים דיסוציאציה באמצעות פפאין ומוביאים למצב של תרחיף של תאים בודדים באמצעות טריטורציה עדינה.מתחלה זו מסוננת בכבידה דרך רשת ניילון עם גודל נקבים של 70 micron. הנוזל שעבר סינון מונח בעדינות מעל מדרג perca לא רציף ועובר צנטריפוגציה כדי להפריד את תאי הגרנולות מהגליה לתאי עצבים ולתאי עצבים מסוג Perkin gene. תאים בממשק של המדרג נאספים ומועברים לצלחות מצופות poly de lycine.כדי להסיר את התאי הגליא进一步, תאי הגרנול נאספים, נספרים ונזרעים בצפיפויות הרצויות על לוחות כיסוי מזכוכית או פלטות תרבית מפלסטיק מצופות poly-D-lysine. שלום, אני hey young Lee מהמעבדה של ד"ר Lloyd Green במחלקה הפתולוגית באוניברסיטת קולומביה. היום נראה לכם פרוצדורה לבידוד ותרבית של נוירוני גרנול מהמוח הקטן של עכברים לאחר הלידה.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור התרבות והתמיינות של תאי פרוגניטור עצביים של גרנולות. בואו נתחיל. פרוצדורה זו מתחילה בשימוש ב-70% ethanol באזור הדיסקציה; כדי להפריד את תאי הגרנולות של הדماغ הקטן, אנו משתמשים במערכת ההפרדה Papin.בעת התחלת שימוש בערכה חדשה, הכינו את תמיסת מעכב albumin OVO equa

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את הטכניקה לבידוד וטיפוח נוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכבר. תאים מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גליה מתרבים ולייצר תרבות טהורה של נוירונים גרגיר cerebellar.

בידוד ותרבית של נוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכבר

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של תאי אב עצביים במוח הקטן של גור עכברים. אבות נוירון גרגיר המוח הקטן מבודדים ומטוהרים באמצעות הידבקות דיפרנציאלית, ומסירים ביעילות אסטרוציטים. אבות מתורבתים אלה מתמיינים לאחר מכן לנוירונים גרגיריים צרבלריים.

בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינותם לתאים עצביים. תאי גזע מתרחיף התא המבודד מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומתורבתים ליצירת נוירוספרות. לאחר מכן הנוירוספרות נשמרות במדיום התמיינות כדי ליצור תאים עצביים.

בידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינות לתאים עצביים

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל פגיעה עצבית בנוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכברים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בגרימת פגיעה עצבית באמצעות NMDA, אגוניסט קולטן נוירוטרנסמיטר מעורר, וגליצין, אגוניסט משותף. NMDA וגליצין נקשרים לקולטנים עצביים ספציפיים, גורמים לגירוי יתר שלהם וכתוצאה מכך זרם סידן תוך תאי מסיבי, מה שמוביל לנזק לתאי עצב ולמוות.

מידול פגיעה עצבית בתאי עצב גרגיריים צרבלריים ראשוניים בעכבר

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

אבות להביע Nestin הם אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של אבות עצביים במוח הקטן מתפתח. שימוש בטכניקת microdissection מוצגת כאן בשילוב עם מיון תא הופעל ניאון, אוכלוסיית תא זו יכולה להיות מטוהרת ללא זיהום מאזורים אחרים של מוח קטנים ויכולה להיות מתורבת למחקרים נוספים.

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

הפגינו כאן היא שיטה יעילה וחסכונית כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל בתאי גזע החומר הלבן מתוך המוח הימני של העכבר.

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

למדו לבודד ולגדל נוירוני גרגיר מוח קטן מעכברים לאחר הלידה באמצעות פאפאין ומדרגת פרקול. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות נוירונים ותפקודם במודלים של מחלות נוירולוגיות.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

גלה סרטונים נוספים