בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

הליך זה מתחיל בהסרת המוח הקטן מ-P ארבע ל-P חמש. קרומי המוח של עכברים שזה עתה נולדו ומקלעת הכורואיד מוסרים מהמוח הקטן הבודד, אשר נאספים לאחר מכן בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. המוח הקטן מנותק מפפאין ומובא לתרחיף תא בודד עם טציה עדינה.

מתלה זה מסונן על ידי כוח הכבידה דרך רשת ניילון בגודל נקבוביות של 70 מיקרון. הזרימה דרכה מונחת בעדינות על גבי שיפוע פרקה לא רציף וצנטריפוגה כדי להפריד את תאי הגרגיר מהגליה לנוירונים ונוירונים של גן פרקין. תאים בממשק השיפוע נאספים ומונחים על צלחות מצופות פולי דה ליצין.

כדי להסיר עוד יותר את תאי הגליה, תאי גרגיר נאספים, נספרים ומצופים בצפיפות הרצויה על גבי תלושי כיסוי זכוכית מצופים פולי דה ליצין או לוחות תרבית פלסטיק. היי, אני היי לי צעיר מהמעבדה של ד"ר לויד גרין במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת קולומביה. היום נראה לכם נוהל לבידוד וטיפוח נוירונים של גרגירי המוח הקטן מעכברים לאחר לידה.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור התפשטות והתמיינות של גרגירים עצביים. אז בואו נתחיל. הליך זה מתחיל בשימוש ב-70% אתנול באזור הדיסקציה כדי להפריד תאי גרגיר במוח הקטן, אנו משתמשים במערכת הדיסוציאציה של פפין.

בעת התחלת ערכה חדשה, הכן את תמיסת מעכב MOID של אלבומין OVO equate. לשם כך, קח 32 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של ארל או EBSS, המסופקת בערכה, והוסף אותה לתערובת האלבומין OVO moid. הניחו אותו בצד בזמן הכנת שאר הרכיבים כדי לאפשר לתוכן להתמוסס.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של EBSS לבקבוקון פפאין אחד מערכת הדיסוציאציה. כל בקבוקון מספיק כדי לנתק ארבעה עד 15 עכברים מחמישה עכברים. לאחר מכן הניחו את בקבוקון הפפאין באינקובטור של 5% CO 2 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות עד שהאבא נמס לחלוטין והתמיסה נראית צלולה.

שמור על התמיסה בטמפרטורת החדר במהלך הדיסקציה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של EBSS לבקבוקון NAS 1D מהערכה. מערבבים בעדינות על ידי הקשה על הבקבוקון.

מכיוון ש-DNA רגיש לדנטורציה, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסה זו לבקבוקון הפפאן כדי לקבל ריכוז סופי של 20 יחידות למיל ו-0.005% DNA, שמור את קובץ ה-DNA הנותר לשימוש בשלבים מאוחרים יותר. לאחר שהכלים והריאגנטים מוכנים, המשך בניתוח המוח הקטן והסרת קרומי המוח לצורך הליך זה. C 57 שישה עכברים שחורים משמשים בין הימים הרביעי והשישי שלאחר הלידה.

טווח גילאים זה אופטימלי לתרבית תאי גרגיר מכיוון שמספר שכבת הגרגירים החיצונית או אבות תאי גרגיר EGL הוא מקסימום להתחיל פיפטה 15 מיליליטר גלוקוז HBSS לתוך צלחת תרבית רקמה פלסטית של 60 מילימטר ו-10 מיליליטר לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. הניחו את הצינור על קרח, נגבו את ראש הגור באתנול 70%. השתמש במספריים כדי להסיר את הראש.

העבירו את הראש לתוך מכסה המנוע והחזיקו אותו בעזרת מלקחיים כך שהחלק האחורי של הגולגולת נראה בבירור. הכניסו את המספריים המיקרו לתוך מגנום מנהלי העבודה על מנת לגשת למוח ואז חתכו ישר לכיוון העיניים. השתמש בדומונט משובח.

מספר חמש, מלקחיים כדי לקלף את העור ולהרים את הגולגולת כדי לחשוף את המוח. לאחר מכן צבטו את המוח הקטן ואת המוח האמצעי שמסביב. העבירו אותו לכלי המכיל גלוקוז HBSS.

שימו לב שקל יותר לתפעל את המוח הקטן ולהסיר את קרומי המוח אם המוח הקטן עדיין מחובר לרקמה שמסביב. לאחר מכן, הניחו את הרקמה מתחת למיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן השתמש בסט אחד של מלקחיים כדי לעגן את המוח הקטן לצלחת.

השתמש בדומונט משובח. מספר חמש, מלקחיים לקילוף עדין של קרומי המוח מהמוח הקטן כמו גם בין האונות. תוכלו להבחין בכלי דם על פני המוח הקטן.

כלי דם אלה הם דרך טובה לזהות את קרומי המוח. המשך להסיר את קרומי המוח עד שהמוח הקטן מקבל מראה לבן מט. לאחר מכן הפרד את המוח הקטן משאר המוח האמצעי.

סובב אותו על הצד הגחוני שלו, והסר את מקלעת הכורואיד, שנראית כמו סרט אדמדם בין המוח הקטן הגחוני למוח האמצעי הסמוך. ברגע שהמוח הקטן מנותח, הניחו אותו בגלוקוז HBSS קר בצינור החרוטי של 15 מיליליטר על קרח. לאחר ניתוח שלושה מוחות, החלף את תמיסת הדיסקציה בגלוקוז HBSS טרי.

ככל שתכירו יותר את דיסקציה של המוח הקטן, נסו להפחית את זמן הנתיחה ללא יותר משש דקות לכל גור. לאחר השלמת הנתיחות, המשך עם תרחיף התאים. שלב ליצירת תרחיף תאים מדיסקציות המוח הקטן.

ראשית, הסר את הגלוקוז HBSS מהצינור והחלף אותו בתמיסת פפאין. למרות שהערכה ממליצה לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות, אנו מוצאים שזה לא הכרחי בגיל זה. הנח את תמיסת הרקמה והפפאין באינקובטור של 5% CO 2 37 מעלות למשך 15 עד 20 דקות.

במשך ארבע עד שמונה דגירה של המוח הקטן למשך 15 דקות. למספר גדול יותר יש לדגור עד חצי שעה. מערבבים בעדינות את הצינור כל שלוש עד ארבע דקות.

לאחר השלמת הדגירה, התחל בציפוי שלב הטציה קצה פיפטה תרסיס P 1000 סטרילי עם FBS על ידי פיפטה למעלה ולמטה פעמיים. עכשיו טריגר דרג את התערובת. הקפד לפיפטה בעדינות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

מספיקות כ -10 תנועות למעלה ולמטה עם הפיפטה כדי לנתק את הרקמה. הפתרון צריך להיות מעונן. הניחו לתרחיף לשבת במשך 30 עד 60 שניות כך שכל חתיכה גדולה של רקמה לא קשורה תשקע בתחתית הצינור.

למרות שניתן להשתמש בפיפטות זכוכית מלוטשות אש לטיפול, אנו מוצאים כי קצות P 1000 סטריליים מצופים בסרום עובדים באותה מידה. לאחר מכן, הסר את התאים התלויים לתוך צינור חרוטי טרי של 15 מיל באמצעות קצה פיפטה מצופה סרום, היזהר לא להסיר את חלקי הרקמה הלא קשורים בתחתית. לאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התא בכ -200 גרם למשך חמש דקות.

בטמפרטורת החדר במהלך הסיבוב, הכינו את מדיום ההשעיה של הרסוס. לשם כך, הוסף 2.7 מיליליטר EBSS בצינור סטרילי. לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר מתמיסת מעכב האלבומין OVO MOID המשוחזרת.

לבסוף, הוסף 150 מיקרוליטר מתמיסת ה- DNA. לאחר השלמת הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט ומיד השעו מחדש את כדור התא בתמיסת מעכב אלבומין ה-DNA המדולל. שוב, השתמש בקצה פיפטה מצופה בסרום כדי להשעות מחדש את הגלולה.

כעת הכן שיפוע צפיפות לא רציף. לשם כך, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת מעכב MOID הסגלגל אלבומין לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. שכבו את תרחיף התאים על גבי התמיסה על ידי הוספה עדינה של התאים לאורך צד הצינור, ולאחר מכן צנטריפוגה בחום של כ-70 גרם למשך שש דקות.

בטמפרטורת החדר, התאים המנותקים יתגלו בתחתית הצינור בעוד שברי הממברנה נשארים בממשק. אם ברצונך להשיג תרביות מועשרות בתאי גרגיר, אין צורך בטיהור נוסף. השליכו את ה-SUP natant והשעו מיד את הגלולה בארבעה מיליליטר של 10% FBS בינוני עם 50 מיקרוליטר DNA.

סנן את המתלה הזה בכוח הכבידה דרך רשת ניילון בגודל גרוע של 70 מיקרון. שלב זה מסיר תאים גדולים שאינם עצביים ומספק תרחיף טוב יותר של תא בודד. לאחר מכן עקוף את שלב הפרדת השיפוע הבא לכל קריאה והמשך לשלב ציפוי התא.

לחלופין, אם ברצונך לטהר עוד יותר את תאי הגרגיר מגליה ונוירונים בין-עצביים גדולים, המשך לשיפוע לכל קריאה. שלב, השליכו את החטיפה ומיד החזירו לחיים. השעו את הגלולה בשני מיליליטר גלוקוז HBSS עם 50 מיקרוליטר DNA.

שוב, סנן את המתלה דרך רשת ניילון לפני שמתחילים בהפרדת שיפוע הפרקה, הכינו שתי פיפטות מרעה מלוטשות באש. להבעיר בעדינות את קצה הפיפטה עד שהקצה חלק וקדח הפיפטה הוא כמחצית מהגודל המקורי. היזהר לא להפוך את הפתח לקטן מדי.

כעת הפוך את השיפוע לכל שיחה. הנח 10 מיל של 35% לכל תמיסת שיחה לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיל. לאחר מכן טען 10 מיל של 60% לשיחה למזרק סטרילי של 10 מיל עם מחט עמוד שדרה סטרילית מחוברת.

הניחו בעדינות את תמיסת ה-60% לכל קריאה מתחת לתמיסת ה-35% על ידי מתן אפשרות לקצה המזרק לגעת בתחתית הצינור. הקפידו לשמור על ממשק חד בין שתי השכבות. לאחר מכן, הוסף את התאים לחלק העליון של השיפוע.

בעזרת פיפטה מלוטשת אש, הוסף בעדינות את התאים לאורך צד הצינור מבלי להפריע לממשק. לאחר שכבת התאים, הניחו בזהירות את הצינור בצנטריפוגה. התחל צנטריפוגה במהירות של כ-18 גרם.הגביר את המהירות צעד אחד כל 20 שניות כך שייקח כשתי דקות להגיע ל-1800 גרם.לאחר 10 דקות ב-1800 גרם, הורד את המהירות בהדרגה צעד אחד כל 20 שניות.

לאחר השלמת הסיבוב, הסר את הממשק העליון של השיפוע והשליך אותו. ממשק זה מכיל תאי ביקיני גדולים ובין נוירונים. לאחר מכן, השתמש בפיפטה מלוטשת אש כדי להסיר בזהירות את התאים בממשק.

מעבירים את התאים לצינור של 50 מיל. אם הנפח במקרה גדול מ-15 מיל, פצל אותם לשני צינורות של 50 מיל והשהה מחדש בשלושה נפחים של גלוקוז HB S וערבב על ידי היפוך מספר פעמים. לאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1100 גרם.כעת הסר את הסופרנטנט והוסף ארבעה מיל של מדיום המכיל 10% FBS ו-50 מיקרוליטר של D ns reus.

תלו את הגלולה בעדינות באמצעות פיפטה מלוטשת אש ליצירת מתלה תא יחיד. לאחר השעיית התאים, המשך בהכנה. התאים מכינים את התאים שנאספו על צלחת מצופה פולי דה ליזין למשך 20 דקות.

באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. במהלך הדגירה, האסטרוגליה והתאים הכבדים יותר ישקעו וייצמדו לצלחות בעוד נוירוני הגרגירים הקטנים ותאי האב של הנוירונים יישארו צפים או מחוברים באופן רופף. לאחר 20 דקות, הקש בעדינות על הכלי כדי לעקור תאי גרגיר שנדבקו באופן רופף.

לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לצלחת מצופה פולי דה ליצין טרייה וחזרו על הדגירה. לאחר מכן, אסוף את נוירוני הגרגיר ותאי האב של הנוירונים בצינור חרוטי של 15 מיל וצנטריפוגה ב -200 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במיל אחד של מדיום חופשי C וספרו באמצעות ציטומטר המו.

לבסוף, הוסף מדיום נטול סרום כדי להגיע לצפיפות התאים הרצויה לצלחת בצפיפות בינונית. לשש לוחות קיר. השתמש בכשלושה וחצי עד 4 מיליון תאים לארבע לוחות קיר.

השתמש ב-650,000 תאים. שמרו על התאים באינקובטור של 37 מעלות עם 5% CO2. החליפו את המדיום לחלוטין 24 שעות לאחר הציפוי הראשוני, ולאחר מכן כל יומיים-שלושה לאחר מכן.

להלן כמה תמונות של תרביות תאי עצב גרגירים ותאי אב בריאים. 24 שעות לאחר הציפוי ושישה ימים לאחר הציפוי. ניתן לשמור על תאים אלה בתרבית עד שבועיים.

שימו לב שתוך 24 שעות לאחר הציפוי, תאים בריאים יתפזרו באופן שווה סביב החלקות הכיסוי או באר הפלסטיק ויקרינו תהליכים. גוש תאים ונוכחות דליות בתהליכי התא מצביעים על כך שהתאים אינם בריאים או שמצע הפולי דה ליצין רעיל. כפי שניתן לראות בתרשים, אבות נוירונים גרגירים מתחילים להתמיין על ציפוי ומבטאים סמנים.

מייצג את הבידול שלהם. קבע שניתן להאריך באופן משמעותי את התפשטותם של אבות נוירונים גרגיריים על ידי הוספת קיפוד קולי למדיום. ניתן להוסיף למינין גם כמצע בנוסף לפוליליזין כדי לקדם צמיחת נויריטים.

תכונות אלה של תרבית תאי הגרגיר מציעות מערכת לחקר הביולוגיה של נוירוני גרגיר או ויסות התמיינות תאי אב לנוירונים. זה עתה הראינו לך כיצד לבודד ולתרבית MAO מוח גדול אבות נוירולוגיים ונוירונים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שהתשואה המשוערת היא 4 2 5 כפול 10.

מתוך ששת התאים לגור וצפיפות הציפוי יכולה לנוע בין ופי חמישה למרכז התאים החמישיים לסנטימטר מרובע. אז אם עוקפים את שלב שיפוע הפריקו, אז שמונה גורי עכברים ביום חמישי לאחר הלידה יכולים להניב מספיק תאים לשש ארבע צלחות תרבית באר בידיים שלי, השימוש בצעד שיפוע הפריקו יפחית את תפוקת התאים בערך 2230 5%עם זאת, אחוז נוירוני הגרגיר בתרבויות עולה מ-90 ל-95 ל-99% תאי גרגיר מועשרים המתקבלים ללא שלב הפרדת שיפוע לכל מיטת תינוק שימשו למחקר ויסות התפשטות והתמיינות אבות של תאי עצב גדולים. עם זאת, אם יש להשתמש בתרביות מעבר למספר ימים במבחנה, מומלץ לכלול את שלב השיפוע לכל מיטת תינוק על מנת להפחית את הזיהום של תאי העצב על ידי ריבוי תאים שאינם עצביים.

כמו כן, ודא שהפתרונות המשמשים לייצור שיפוע לכל מיטת תינוק טריים מכיוון שחציצה לא נכונה מובילה למוות תאים גדול יותר. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.