Name: lung decellularization and recellularization
Uploaded: 2023-04-30T06:33:07.000Z
Duration: 8 min 45 s
Channel: JoVE

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Le colture in vitro di organi parziali o interi vengono spesso utilizzate per modellare con precisione la funzione dei tessuti e degli organi in varie condizioni di prova. La coltura di organi interi può comportare la decellularizzazione di un organo asportato o la rimozione di cellule al fine di utilizzare la struttura dell'organo nativo. Questo è seguito dalla ricellularizzazione con nuove cellule. L'uso di bioreattori specializzati è spesso incorporato nel processo di ricellularizzazione per imitare la crescita dei tessuti nel corpo. Questo video introdurrà i principi fondamentali alla base della coltura di tessuti di organi interi e dimostrerà la procedura in laboratorio.
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Questo processo inizia con il prelievo di un organo donatore. In questo esempio, mostriamo un polmone donatore da una scimmia. Attraverso un processo chiamato perfusione detergente, l'organo isolato viene sistematicamente ripulito dalla sua popolazione cellulare nativa da una serie di lavaggi, risultando in una matrice di organi acellulari sterili. Successivamente, la matrice tissutale viene ricellularizzata utilizzando tipi di cellule specifiche, come una linea di cellule staminali stabilita. Le cellule possono anche essere donate dalla persona che sta ricevendo il tessuto ingegnerizzato, chiamato trapianto di cellule autologhe. Questo mitiga il rigetto e migliora la biocompatibilità dell'organo. In alternativa, le cellule possono essere utilizzate da un donatore diverso, chiamato trapianto allogenico. Questo potrebbe dover essere perseguito se un numero sufficiente di cellule non può essere raccolto dal potenziale destinatario. Una volta che le cellule sono seminate sull'organo, i bioreattori tissutali vengono utilizzati per stimolare la proliferazione cellulare e dirigere la crescita dei tessuti. Questi reattori mirano a coltura dinamica dell'organo e imitare l'ambiente nativo trovato in vivo. Ad esempio, l'organo può essere collegato a una pompa peristaltica per simulare il flusso sanguigno. Ora che hai imparato a conoscere i principi della cultura degli organi, diamo un'occhiata a una procedura di esempio che coinvolge l'intera coltura di organi dei polmoni dei donatori.
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Per iniziare, i polmoni del donatore vengono posti in un vassoio di dissezione e l'arteria polmonare puònuolarsi introducendo un connettore luer femminile nella cavità aperta. Un secondo connettore luer femmina viene quindi inserito nell'apertura tracheale. Fosfato tamponato soluzione salina o PBS contenente 30 unità per millilitri di eparina e cinque microgrammi per millilitro di nitroprussiato di sodio viene quindi instillato per facilitare l'allargamento dei vasi sanguigni e la rimozione dell'aria intrappolata dai polmoni. La soluzione viene espulsa dal rinculo naturale e ripetuta altre due volte prima di tappare la cannula, per trattenere la soluzione nei polmoni per sciogliere il sangue residuo. Quindi, entrambi gli atri vengono lacerati e il cappuccio tracheale della cannula luer viene rimosso per facilitare il drenaggio dei liquidi. La perfusione viene continuata con PBS, eparina e soluzione di nitroprussiato di sodio fino a quando la maggior quantità possibile di sangue viene rimossa dalla vascolarizzazione polmonare. Per iniziare la decellurizzazione, i polmoni vengono gonfiati e permeati di acqua deionizzata. Dopo cinque lavaggi arteriosi e vascolari, i polmoni vengono rimossi dall'acqua e immersi in un detergente chiamato Triton per rimuovere le cellule mentre colpiscono minimamente la matrice dell'organo. I polmoni vengono gonfiati altre due volte con la soluzione di Triton prima di incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, i polmoni vengono lavati altre cinque volte con acqua deionizzata fresca. Successivamente, i polmoni vengono immersi in una soluzione di desossicolato di sodio al 2% e quindi lavati più volte con acqua e soluzione tampone per facilitare la decellularizzazione e la rimozione dei detriti cellulari. Quando completamente pulito, l'organo viene conservato in soluzione sterile di PBS a quattro gradi Celsius fino all'uso.
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Per imitare il comportamento naturale dei polmoni può essere utilizzato un bioreattore specializzato, come quello mostrato qui. In primo luogo, la camera principale del reattore è riempita con un terreno di coltura che è stato bilanciato con l'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Quindi viene installato l'organo. Una volta collegato, il coperchio viene fissato e tutta l'aria viene rimossa dal tubo utilizzando una siringa. Il bioreattore viene quindi spostato in un incubatore di colture tissutali per equilibrare. Successivamente, i polmoni vengono ventilati con circa un respiro completo ogni due minuti e il mezzo viene fatto circolare attraverso la vascolarizzazione, tramite la pompa peristaltica, a circa 10 millilitri al minuto per un totale di 30 minuti.
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Per la semina delle vie aeree, i polmoni vengono gonfiati con una sospensione cellulare contenente cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo. Per ricellularizzare gli alveoli, che sono responsabili dello scambio di ossigeno e anidride carbonica che avviene nei polmoni. I polmoni vengono quindi incubati durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi alla matrice decellularizzata. Dopo l'incubazione notturna, la ventilazione viene riavviata e le cellule possono crescere nella matrice dell'organo per diversi giorni. Successivamente, la semina vascolare è completata dalla graduale introduzione di cellule endoteliali utilizzando la pompa peristaltica per avviare la ricellularizzazione di piccoli vasi e quindi coltivata staticamente per diverse ore per facilitare lo sviluppo di un organo cellulare accurato. Il terreno di coltura viene nuovamente fatto circolare e le cellule vengono coltivate per una settimana per promuovere la crescita e l'attaccamento in condizioni dinamiche. Una volta completata la crescita tissutale, viene eseguita l'istologia per confermare l'attaccamento e la crescita sia delle cellule staminali mesenchimali che delle cellule endoteliali sulla vascolarizzazione e sulle vie aeree dell'organo. L'istologia mostra l'attaccamento delle cellule staminali mesenchimali e delle cellule endoteliali agli alveoli all'interno dell'impalcatura della matrice e dei piccoli vasi vascolari, creando l'aspetto del tessuto polmonare nativo.
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Ora che hai imparato a conoscere la cultura dell'intero organo, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni pratiche di questa tecnologia al di fuori dell'obiettivo primario della medicina rigenerativa e della sostituzione degli organi. La coltura di organi interi può anche essere utilizzata come un modo per testare agenti farmaceutici o dispositivi di somministrazione di farmaci. Ad esempio, in questo studio, le tiroide embrionali di topo sono state espiantate, coltivate e utilizzate come modello di organo per osservare come gli agenti farmaceutici sperimentali vengono trasportati attraverso l'organo e il tessuto. Questa simulazione può alla fine portare a una rappresentazione più realistica di come un farmaco viene trasferito all'interno di un organo in vivo. Infine, la coltura di tessuti interi organi può essere utilizzata per studiare il comportamento dei tessuti in varie condizioni. Ad esempio, i dischi intervertebrali sono stati raccolti dalle code bovine per studiare i possibili meccanismi di degenerazione del disco. Sono stati impiegati bioreattori appositamente progettati per indurre il carico meccanico sul disco al fine di comprendere meglio come questi carichi influiscono sulla degenerazione.
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<div class="chapter_text" id="script_6">
Hai appena visto il video di Jove su Whole Organ Tissue Culture. Ora dovresti capire come interi organi possono essere coltivati in vitro e come questa tecnica viene applicata nel campo della bioingegneria. Grazie per l'attenzione.
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coltura tissutale di organi interi

Organi interi possono essere coltivati ex vivo utilizzando bioreattori specializzati con l'obiettivo di riparare o sostituire interi organi. Questo metodo utilizza un organo donatore che viene spogliato di tutte le cellule, lasciando dietro di sé la struttura tridimensionale, che viene poi ripopolata con nuove cellule. Questo video dimostra l'intera coltura d'organo dei polmoni e mostra come sia necessaria una coltura dinamica che imita la stimolazione meccanica nel corpo per indurre le proprietà dei tessuti nativi.

Coltura tissutale di organi interi

Whole organs can be cultured ex vivo using specialized bioreactors&#160;with the goal of repairing or replacing entire organs. This method uses a donor ...

Le colture in vitro di organi parziali o interi sono spesso utilizzate per modellare accuratamente la funzione dei tessuti e degli organi in varie condizioni di test. La coltura dell'intero organo può comportare la decellularizzazione di un organo asportato o la rimozione di cellule al fine di utilizzare la struttura dell'organo nativo. Segue la ricellularizzazione con nuove cellule. L'uso di bioreattori specializzati è spesso incorporato nel processo di ricellularizzazione per imitare la crescita dei tessuti nel corpo. Questo video introdurrà i principi fondamentali alla base della coltura di tessuti di organi interi e dimostrerà la procedura in laboratorio. Questo processo inizia con il prelievo di un organo da donatore. In questo esempio, mostriamo un polmone di un donatore di una scimmia. Attraverso un processo chiamato perfusione detergente, l'organo isolato viene sistematicamente ripulito dalla sua popolazione cellulare nativa mediante una serie di lavaggi, ottenendo una matrice di organi acellulari sterile. Successivamente, la matrice tissutale viene ricellularizzata utilizzando tipi di cellule specifici, come una linea di cellule staminali consolidata. Le cellule possono anche essere donate dalla persona che riceve il tessuto ingegnerizzato, chiamato trapianto di cellule autologhe. Questo mitiga il rigetto e migliora la biocompatibilità dell'organo. In alternativa, le cellule possono essere utilizzate da un donatore diverso, chiamato trapianto allogenico. Potrebbe essere necessario perseguire questo obiettivo se non è possibile prelevare un numero sufficiente di cellule dal potenziale ricevente. Una volta che le cellule sono state seminate sull'organo, i bioreattori tissutali vengono utilizzati per stimolare la proliferazione cellulare e dirigere la crescita dei tessuti. Questi reattori mirano a coltivare dinamicamente l'organo e imitare l'ambiente nativo che si trova in vivo. Ad esempio, l'organo può essere collegato a una pompa peristaltica per simulare il flusso sanguigno. Ora che hai appreso i principi della coltura degli organi, diamo un'occhiata a una procedura di esempio che coinvolge l'intera coltura degli organi dei polmoni dei donatori. Per iniziare, i polmoni del donatore vengono posti in un vassoio di dissezione e l'arteria polmonare incannulata introducendo un connettore luer femmina nella cavità aperta. Un secondo connettore luer femmina viene quindi inserito nell'apertura tracheale. La soluzione salina tamponata con fosfato o PBS, contenente 30 unità per millilitro di eparina e cinque microgrammi per millilitro di nitroprussiato di sodio, viene quindi instillata per facilitare l'allargamento dei vasi sanguigni e la rimozione dell'aria intrappolata dai polmoni. La soluzione viene espulsa per rinculo naturale e ripetuta altre due volte prima di tappare la cannula, per trattenere la soluzione nei polmoni e sciogliere il sangue residuo. Quindi, entrambi gli atri vengono lacerati e il cappuccio della cannula luer tracheale viene rimosso per facilitare il drenaggio dei liquidi. La perfusione viene continuata con la soluzione di PBS, eparina e nitroprussiato di sodio, fino a rimuovere quanto più sangue possibile dal sistema vascolare polmonare. Per iniziare la decellurizzazione, i polmoni vengono gonfiati e permeati con acqua deionizzata. Dopo cinque lavaggi arteriosi e vascolari, i polmoni vengono rimossi dall'acqua e immersi in un detergente chiamato Tritone per rimuovere le cellule con un impatto minimo sulla matrice dell'organo. I polmoni vengono gonfiati altre due volte con la soluzione di Triton prima di incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, i polmoni vengono lavati altre cinque volte con acqua fresca deionizzata. Successivamente, i polmoni vengono immersi in una soluzione di desossicolato di sodio al 2% e quindi lavati più volte con acqua e soluzione tampone per facilitare la decellularizzazione e la rimozione dei detriti cellulari. Una volta completamente pulito, l'organo viene conservato in una soluzione sterile di PBS a quattro gradi Celsius fino all'uso. Per imitare il comportamento naturale dei polmoni può essere utilizzato un bioreattore specializzato, come quello mostrato qui. In primo luogo, la camera principale del reattore viene riempita con un terreno di coltura che è stato bilanciato all'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Quindi l'organo viene installato. Una volta collegato, il coperchio viene fissato e tutta l'aria viene rimossa dal tubo utilizzando una siringa. Il bioreattore viene quindi spostato in un incubatore per colture tissutali per equilibrare. Successivamente, i polmoni vengono ventilati con circa un respiro completo ogni due minuti e il mezzo viene fatto circolare attraverso il sistema vascolare, tramite la pompa peristaltica, a circa 10 millilitri al minuto, per un totale di 30 minuti. Per la semina delle vie aeree, i polmoni vengono gonfiati con una sospensione cellulare contenente cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo. Ricellularizzare gli alveoli, che sono responsabili dello scambio gassoso di ossigeno e anidride carbonica che avviene nei polmoni. I polmoni vengono quindi incubati durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi alla matrice decellularizzata. Dopo l'incubazione notturna, la ventilazione viene riavviata e le cellule vengono lasciate crescere nella matrice dell'organo per diversi giorni. Successivamente, la semina vascolare è completata dall'introduzione graduale di cellule endoteliali utilizzando la pompa peristaltica per avviare la ricellularizzazione di piccoli vasi e quindi coltivate staticamente per diverse ore per facilitare lo sviluppo di un organo cellulare accurato. Il terreno di coltura viene fatto circolare di nuovo e le cellule vengono coltivate per una settimana per promuovere la crescita e l'adesione in condizioni dinamiche. Una volta completata la crescita del tessuto, viene eseguita l'istologia per confermare l'attaccamento e la crescita sia delle cellule staminali mesenchimali che delle cellule endoteliali sul sistema vascolare e sulle vie aeree dell'organo. L'istologia mostra l'attaccamento delle cellule staminali mesenchimali e delle cellule endoteliali agli alveoli all'interno dell'impalcatura della matrice e dei piccoli vasi vascolari, creando l'aspetto del tessuto polmonare nativo. Ora che hai imparato a conoscere la coltura dell'intero organo, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni pratiche di questa tecnologia al di fuori dell'obiettivo principale della medicina rigenerativa e della sostituzione degli organi. La coltura dell'intero organo può anche essere utilizzata come un modo per testare agenti farmaceutici o dispositivi di somministrazione di farmaci. Ad esempio, in questo studio, le tiroidi embrionali di topo sono state espiantate, coltivate e utilizzate come modello di organo per osservare come gli agenti farmaceutici sperimentali vengono trasportati attraverso l'organo e il tessuto. Questa simulazione può in definitiva portare a una rappresentazione più realistica di come un farmaco viene trasferito all'interno di un organo in vivo. Infine, la coltura di tessuti di organi interi può essere utilizzata per studiare il comportamento dei tessuti in varie condizioni. Ad esempio, i dischi intervertebrali sono stati prelevati da code bovine per studiare i possibili meccanismi della degenerazione del disco. Sono stati impiegati bioreattori appositamente progettati per indurre un carico meccanico sul disco al fine di comprendere meglio come questi carichi influiscono sulla degenerazione. Hai appena visto il video di Giove sulla coltura dell'intero tessuto d'organo. A questo punto dovresti capire come gli organi interi possono essere coltivati in vitro e come questa tecnica viene applicata nel campo della bioingegneria. Grazie per l'attenzione.

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Didattica

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Engineering

Ingegneria

Bioengineering

Bioingegneria

Whole Organ Tissue Culture

lung decellularization and recellularization

Whole organs can be cultured ex vivo using specialized bioreactors to support repair or replacement of entire organs. In this approach, a donor organ is first stripped of all cells. What remains is the three-dimensional structure of the organ, which can then be repopulated with new cells.

The lung is the example shown here. The method uses a dynamic culture system that provides mechanical stimulation, similar to what the organ experiences in the body. This type of culture helps induce native tissue properties in the developing lung tissue.

Lung Decellularization and Recellularization

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overview of biomaterials

Biomaterials in Medicine and Engineering

Biomaterials are materials designed to interact well with biological organisms or molecules. They may come from an organism, be produced by an organism, or be made as a synthetic polymer. Because of these properties, engineers use biomaterials in medicine and other biological applications. These materials are used in tissue engineering, biosensing, and drug delivery. Tissue engineering uses materials to support the growth or repair of tissues. Biosensing uses materials to detect biological...

collagen hydrogels

Porcine Collagen for Tissue Engineering

Collagen is a useful biomaterial with uses that go beyond the lab. It has also found commercial use in photography. In tissue engineering, collagen can be turned into hydrogels that give engineered tissue support and structure. This page follows the path from porcine skin to a collagen hydrogel. Porcine skin is used as the source of collagen. The material is then prepared for use in tissue engineering applications. The video also shows several applications of collagen and the methods used to...

electrospinning of silk biomaterials

Silk Cocoon Processing for Fiber Mats

Silk cocoons can be processed into a soluble material that is useful for making biomaterials. Silk fibers have been used for fabrics and threads for centuries, but turning them into a versatile pre-polymer solution is a newer technique. That solution can then be shaped into materials with controllable mechanical properties. The process begins with silk worm cocoons. The silk is solubilized, or dissolved, so it can be handled as a liquid-like solution. The video then shows how that silk...

overview of biomem devices

BioMEMs in Diagnostics and Miniaturization

Bio-microelectromechanical systems, or BioMEMs, are microscale devices used in diagnostic settings. They work with very small sample and reagent volumes in vivo and in vitro, which means inside a living body or outside it in a lab. These compact systems support bioengineering research and help make diagnostic tools more efficient. BioMEMs can carry out functions such as filtration, sensing, and synthesis on a tiny scale. Using less material can lower costs and improve sensitivity. The...

microfabrication via photolithography

Photolithography for Silicon Wafer Patterning

Photolithography is a common microfabrication method used to pattern a silicon wafer. It uses light to transfer a design onto the wafer surface. This process helps form the basis for many BioMEM devices. The page also shows how photolithography is carried out in a cleanroom. Cleanroom steps are important because they support careful fabrication of small, detailed features. The video ends by introducing applications of this process in BioMEM device production.

soft lithography

Photolithography for Microfluidic Device Making

Photolithography and soft lithography are used to make BioMEM devices such as microfluidic channels. A microscale pattern is copied by curing an elastomeric polymer over a 3D structure. The result is a polymer piece that can serve as part of a biological device. These polymer structures are then used to build a range of tools. Some are microfluidic channels for biosensing applications. Others are microscale bioreactors that let scientists visualize micro-colonies. The process also shows how...

overview of bioprocess engineering

Bioreactors and Protein Production in Bioprocessing

Bioprocessing uses living organisms to make a desired target product. In many cases, that product is a protein made in a bioreactor, which is a controlled vessel for growing cells. This process often relies on genetically engineered organisms. Engineers design the system so the cells can produce proteins at large scale. That approach is central to making biotherapeutics, which are drugs made from biological materials. Biotherapeutics are important medicines for complex diseases such as...

synthetic biology

Engineering Cells to Produce Proteins

Synthetic biology is a bioengineering method for programming cells to make useful products. In many cases, the goal is to genetically modify an organism so it can produce large amounts of a protein. That protein may already be made by the cell, or it may come from a newly inserted DNA sequence. The process depends on changing an organism’s genetic material. This is done with transformation or transfection, two common ways to introduce DNA into cells. The video also shows how this work is...

batch and continuous bioreactors

Growing Cells in Bioreactors

Bioreactors are used to grow organisms in large volumes. This makes it possible to produce large amounts of a target product. In laboratory and bioengineering settings, they provide a controlled place for cell growth and product formation. The two main reactor types are batch reactors and continuous reactors. A batch reactor contains all of the materials needed for cell growth at the start. A continuous reactor has inlet and outlet ports, so fresh growth media can be added while cell waste is...

overview of biosensing

How Biosensors Detect Molecules

Biosensors detect biological molecules and chemical contaminants by combining biology with physical measurement. They can identify targets such as proteins or cells, as well as non-biological molecules like chemicals or contaminants. This makes biosensing a useful field for studying and monitoring many kinds of samples. These devices rely on different signal types to find the target molecule. Some biosensors use electrical signals, while others depend on optical, electrochemical, or mechanical...

electrochemical biosensing

Glucose Sensors and Cancer Detection

Electrochemical biosensors detect target molecules by measuring an oxidation-reduction event. That signal changes when a molecule binds to the sensor surface. These sensors helped shape modern biosensing after the first glucose biosensor was invented. The glucose biosensor is a key example of this technology. It shows how electrochemical sensing can track a biological target through a measurable electrical change. The same basic idea also helps explain how electrochemical biosensors can be...

optical biosensing

Detecting Molecules with Light

Optical biosensors detect target molecules with light. They monitor binding by reading an optical signal from the sample. This makes them useful for seeing when a target molecule is present. Some optical biosensors use a label molecule. The label creates a measurable signal, such as fluorescence. Other optical biosensors are label-free and track changes in optical properties, such as refractive index, as binding occurs. This page introduces both label and label-free optical biosensors. It...

overview of tissue engineering

Building Artificial Tissue with Biomaterials

Tissue engineering uses biomaterials, specific cells, and growth factors to build artificial tissue. These engineered tissue constructs are designed for tissue repair and, in some cases, organ replacement. The field focuses on how to make tissue work like natural tissue. It begins with a scaffold, which is a structure that supports cell growth. Cells are then added to the scaffold, and growth factors help encourage proliferation, or cell multiplication. The video also outlines common methods...

histotypic tissue culture

3D Cell Growth on Engineered Matrices

Histotypic tissue culture uses an engineered three-dimensional matrix to grow and propagate cells. Compared with common two-dimensional tissue culture, cells in a 3D setting behave more realistically and better mimic native tissue. The method is useful when high cell density is needed. The process begins by harvesting cells from donor tissue. Those cells are then placed onto an engineered construct for culture. This setup supports growth in a three-dimensional space instead of a flat surface.

whole organ tissue culture

Whole organs can be cultured ex vivo using specialized bioreactors to support repair or replacement of entire organs. In this approach, a donor organ is first stripped of all cells. What remains is the three-dimensional structure of the organ, which can then be repopulated with new cells. The lung is the example shown here. The method uses a dynamic culture system that provides mechanical stimulation, similar to what the organ experiences in the body. This type of culture helps induce native...

bioengineering

Questa collezione tratta i concetti di bioingegneria di base, che includono la produzione di
biomateriali, colture di tessuti istotipici e di organi interi, tecniche di processamento biologico, e i campi complessi a livello sistemico di bioMEM e biorilevamento.

Learn how donor lungs are decellularized, repopulated with new cells, and grown in bioreactors that provide dynamic mechanical stimulation.

Lung Decellularization and Recellularization

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